Methodenartikel

Een suppressor scherm voor de karakterisering van genetische links reguleren chronologische levensduur in Saccharomyces cerevisiae

DOI:

10.3791/61506

⸱

17 september 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, William Paterson University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier is een protocol om genetische interacties te identificeren door middel van een verhoogde kopie nummer suppressor scherm in Saccharomyces cerevisiae. Deze methode stelt onderzoekers in staat om te identificeren, klonen, en testen suppressors in kortstondige gist mutanten. We testen het effect van de toename van het kopieeraantal van SIR2 op de levensduur in een autofagie null mutant.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Veroudering is de tijdafhankelijke verslechtering van de normale biologische processen van een organisme die de kans op overlijden verhoogt. Veel genetische factoren dragen bij aan veranderingen in het normale verouderingsproces. Deze factoren kruisen elkaar op complexe manieren, zoals blijkt uit de rijkdom van gedocumenteerde links geïdentificeerd en bewaard in vele organismen. De meeste van deze studies richten zich op verlies-van-functie, null mutanten die het mogelijk maken voor een snelle screening van vele genen tegelijk. Er is veel minder werk dat zich richt op het karakteriseren van de rol die overexpressie van een gen in dit proces. In het huidige werk presenteren we een eenvoudige methodologie om genen in de ontluikende gist, Saccharomyces cerevisiae,te identificeren en te klonen, voor onderzoek naar onderdrukking van het kortlevende chronologische levenseologisch fenotype dat bij veel genetische achtergronden wordt gezien. Dit protocol is ontworpen om toegankelijk te zijn voor onderzoekers met een breed scala aan achtergronden en in verschillende academische stadia. Het SIR2-gen, dat codeert voor een histone deacetylase, werd geselecteerd voor klonen in de pRS315-vector, omdat er tegenstrijdige rapporten zijn geweest over het effect ervan op de chronologische levensduur. SIR2 speelt ook een rol in de autofagie, die resulteert wanneer verstoord door de schrapping van verschillende genen, met inbegrip van de transcriptie factor ATG1. Als bewijs van principe klonen we het SIR2-gen om een suppressorscherm uit te voeren op de verkorte levensduur fenotype die kenmerkend is voor de autofagie-tekort atg1Δ-mutant en vergelijken we het met een anders isogene, wilde genetische achtergrond van het type.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Veroudering is het tijdsafhankelijke verlies van integriteit in talloze biologische processen die uiteindelijk de kans op organisale dood verhoogt. Veroudering is bijna onvermijdelijk voor alle soorten. Op cellulair niveau zijn er verschillende goed gekarakteriseerde kenmerken die worden geassocieerd met veroudering, waaronder: genomische instabiliteit, epigenetische veranderingen, verlies-van-proteostase, mitochondriale disfunctie, gedereguleerde voedingsstoffen senseren, cellulaire senscentie, en telomeer uitputting1,2. In eencellige organismen, zoals gisten, leidt dit tot een vermindering van het replicatief potentieel en de chronologische levensduur3,4. Deze cellulaire veranderingen manifesteren zich in complexere organismen, zoals mensen, als pathologieën die kankers, hartfalen, neurodegeneratie, diabetes en osteoporose5,,6,7omvatten. Ondanks de vele complexiteiten die kenmerkend zijn voor het verouderingsproces, is er behoud van deze moleculaire kenmerken die aan dit proces ten grondslag liggen in sterk uiteenlopende organismen8,9,10. Identificatie van veranderingen in deze trajecten tijdens de vergrijzing leidde tot het besef dat ze kunnen worden gemanipuleerd via veranderingen in levensstijl – dieetbeperking blijkt de levensduur in veel organismen aanzienlijk te verlengen11. Deze paden convergeren en kruisen elkaar en vele andere paden, op complexe manieren. Opheldering en karakterisering van deze interacties biedt mogelijkheden voor therapeutische interventies om de levensduur en de levensduur te verlengen12,13,14.

Het behoud van de moleculaire onderbouwing van veroudering zorgt voor functionele dissectie van genetische interacties die aan het proces ten grondslag liggen door het gebruik van eenvoudigere modelorganismen – ook in de ontluikende gist, Saccharomyces cerevisiae15,16. Er zijn twee gevestigde soorten veroudering gemodelleerd door ontluikende gist: chronologische veroudering (de chronologische levensduur, CLS) en replicerende veroudering (de replicante levensduur, RLS)17. Chronologische veroudering meet de hoeveelheid tijd die een cel kan overleven in een niet-delende toestand. Dit is analoog aan de veroudering die wordt gezien in cellen die het grootste deel van hun leven doorbrengen in G0,zoals neuronen4. Als alternatief is de replicanatieve levensduur het aantal keren dat een cel kan delen vóór uitputting en is een model voor mitotically actieve celtypen (bijvoorbeeld het aantal dochtercellen dat een cel kan hebben)18.

Het algemene doel van deze methode is om een protocol dat het mogelijk maakt voor de functionele dissectie van de genetica van veroudering met behulp van S. cerevisiaepresenteren . Hoewel er veel uitstekende studies zijn uitgevoerd door veel onderzoekers die hebben geleid tot ons huidige begrip, blijven er veel mogelijkheden voor beginnende onderzoekers om bij te dragen aan de vergrijzing van het veld van het begin van hun academische carrière. We presenteren een duidelijke methodologie die onderzoekers in staat zal stellen om het gebied van veroudering verder te bevorderen. Dit protocol is ontworpen om toegankelijk te zijn voor alle onderzoekers, ongeacht de fase in hun academische carrière door het verstrekken van de instrumenten die nodig zijn om te formuleren en testen van hun eigen nieuwe hypothesen. Het voordeel van onze aanpak is dat dit een kosteneffectieve methode gemakkelijk toegankelijk voor alle onderzoekers, ongeacht de instelling - en vereist geen dure, gespecialiseerde apparatuur die nodig is voor sommige protocollen19. Er zijn verschillende manieren om dit type scherm te ontwerpen, de aanpak die in dit werk wordt beschreven is bijzonder vatbaar voor het screenen van null-mutanten van niet-essentiële genen die een ernstige vermindering van de chronologische levensduur vertonen in vergelijking met een isogene wilde gistsoort.

Als ons bewijs van principe klonen we SIR2, een lysine deacetylase die wordt gerapporteerd als het vertonen van zowel een uitgebreide als een verkorte CLS wanneer overexpressed. SIR2 overexpressie werd onlangs gevonden om CLS in wijnbereidingsgist te verhogen; verschillende groepen hebben echter geen verband gemeld tussen sir2 en CLS-uitbreiding , waardoor zijn rol onder de20,21,22 . Vanwege deze tegenstrijdige rapporten in de literatuur, hebben we dit gen geselecteerd om onafhankelijk onderzoek toe te voegen om de rol van SIR2 in chronologische veroudering te verduidelijken, indien aanwezig. Bovendien verlengt het verhogen van het kopieernummer van een SIR2-homoloog de levensduur in een nematodewormmodelsysteem23.

Autophagy is een intracellulair afbraaksysteem om cytosolische producten, zoals eiwitten en organellen, te leveren aan de lysosoom24. Autofagie is nauw verbonden met een lange levensduur door zijn rol in het vernederen van beschadigde eiwitten en organellen om cellulaire homeostase25te behouden. Inductie van autofagie hangt af van het orkestreren van de expressie van vele genen, en de verwijdering van het ATG1-gen resulteert in een abnormaal korte CLS in ontluikende gist26. ATG1-codes voor een eiwitservine/threonine kinase die nodig is voor blaasvorming in autofagie en de cytoplasma-to-vacuole (het schimmellysosomale equivalent) pad27,28. Hier presenteren we onze methode voor een verhoogd kopieernummer scherm, het testen van het effect van verhoogde SIR2 kopie op de CLS in een wild type en een atg1-nullachtergrond. Deze methode is bijzonder vatbaar voor junior onderzoekers en onderzoeksgroepen bij voornamelijk undergraduate instellingen, waarvan vele dienen gemeenschappen ondervertegenwoordigd in de wetenschappen en hebben beperkte middelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Identificeer potentiële genetische interacties voor screening

  1. Identificeer de genetische achtergrond(en) voor karakterisering, wat resulteert in een abnormaal kortgebraden chronologische levensduur (CLS) in Saccharomyces cerevisiae met behulp van de Saccharomyces Genome Database (de SGD, https://www.yeastgenome.org29,30), die bekende fenotypische informatie voor dit organisme samenstelt.
    1. Selecteer het tabblad Functie in de opties boven aan de webpagina.
    2. Selecteer Fenotype, gevolgd door alle fenotypen te selecteren.
    3. Van de opties Gistfenotype Ontologie scrollen naar de onderverdeling Ontwikkeling en selecteer Chronologische levensduur, gevonden onder de onderverdeling Levensduur.
    4. Selecteer de kwalificatie voor verlaagd ,waardoor genen die een fenotype vertonen, kunnen worden geïdentificeerd dat resulteert in een verlaagd chronologisch levensecht fenotype wanneer het wordt verwijderd. Voor deze proof-of-method werd atg1Δ geselecteerd, wat resulteert in een kortstondig CLS-fenotype en wordt verstoord voor autofagie26.
  2. Identificeer doelgen(en) om te screenen op genetische interacties die het fenotype kunnen onderdrukken, op basis van gerapporteerde of voorspelde ontologiekenmerken, van de mutant die in deel 1.2 is geïdentificeerd. Herhaal de fenotype zoeken zoals gevonden in stappen 1.1.1-1.1.4 hierboven, query's voor genen die resulteren in een langere CLS wanneer overexpressed in een wild-type achtergrond. SIR2 werd geselecteerd op basis van het gerapporteerde CLS-fenotype en gerapporteerde interacties met autofagie31,32.

2. Reagentia voorbereiden

OPMERKING: Tenzij anders gespecificeerde autoclave elke oplossing bij 121 °C gedurende 20 minuten te steriliseren voor gebruik.

  1. YPAD vloeibare media: Voeg 1% gistextract, 2% Pepton, 2% Dextrose (glucose), en 40 mg adenine (als adenine sulfaat dehydraat) per liter dubbel gedestilleerd water. Meng goed met een magnetische roerder.
  2. LB vloeibare media: Voeg Tryptone (10 g), Gisextract (5 g) en natriumchloride (10 g) per liter dubbel gedestilleerd water toe. Meng goed met een magnetische roerder.
  3. Bereid 1000x (100 mg/mL) ampicilline voorraad, in dubbel gedestilleerd water. Meng goed en filter steriliseren.
  4. Synthetisch compleet – Leucine (SC-LEU) vloeibare media: Voeg 1,7 g Giststikstofbasis w/o aminozuren, 2% glucose, 1,92 g SC-LEU Dropout mix, 5 g Ammoniumsulfaat per liter dubbel gedestilleerd water toe. Meng goed met een magnetische roerder.
  5. TE-buffer: Mix Tris (10 mM eindconcentratie), EDTA (1 mM eindconcentratie) in de oplossing met dubbel gedestilleerd water. Meng goed met een magnetische roerder.
  6. Bereid 50% PEG 3350 in oplossing met dubbel gedestilleerd water. Meng goed met een magnetische roerder.
  7. Bereid 1 M en 100 mM Lithium Acetaat oplossing met dubbel gedestilleerd water. Meng goed met een magnetische roerder.
    OPMERKING: Om vaste agar platen toe te voegen 20 g agar (per liter met dubbel gedestilleerd water) aan de media bereid in 2.1 en 2.2 boven voorafgaand aan autoclaving. Als de bereiding van ampicilline platen voeg 1mL van de ampicilline aan de media in 2,2 hierboven nadat het is afgekoeld tot ongeveer 60 °C. Giet in steriele platen en laat voor gebruik 48-72 uur instellen. Bewaar platen op 4 °C voor langere opslag.

3. Ontwerp de kloonstrategie om SIR2 te klonen in de pRS315-vector

  1. Ontwerp PCR-primers om het SIR2-gen te versterken voor klonen in de pRS315-vector.
    1. Ontwerp primers handmatig om 21-22 nucleotide complementariteit te hebben aan de intergene regio's stroomopwaarts en stroomafwaarts van de SIR2. Zorg ervoor dat het hele gen, samen met de onvertaalde gebieden van het mRNA wordt gekloond door deze functies uit de beschikbare datasets33,34inkaart te brengen .
    2. Zorg ervoor dat het PCR primerontwerp resulteert in voorwaartse en omgekeerde primers met een smelttemperatuur (Tm) boven 53 °C en onder 60 °C.
      OPMERKING: Idealiter moeten beide primers een Tm zo dicht bij elkaar als sequentie zal toestaan, met een geschatte GC-inhoud van tussen de 40-50%, ervoor te voorkomen dat dinucleotide herhalingen en balanceren GC en AT-verdeling in de hele reeks.
    3. Na het ontwerp van de PCR primers die het mogelijk maken voor de generatie van de amplicon voor klonen, voeg beperking enzym spijsvertering (R.E.D.) doelsites aan de 5 'einde van elke primer die compatibel zijn met de plasmid-klonen vector. Bij deze methode wordt een HindIII-beperkingsenzymverteringsplaats (5'-AAGCTT-3') toegevoegd aan de upstream, voorwaartse primer en een SacII-beperkingsenzymverteringsplaats (5'-CCGCGG-3') aan de downstream, omgekeerde primer.
      OPMERKING: Het gebruik van de SacII- en HindIII-sites vereist dat de consensussnoep voor elke endonuclease niet aanwezig is in het doelgen. Als een van beide enzymdoelen binnen het doelgen, moeten alternatieve beperkingsenzymen worden gekozen. Er zijn veel die compatibel zijn met de polylinker regio op de pRS315 vector.
    4. Tot slot, voeg een vier nucleotide (5'-NNNN-3') sequentie overhang aan de 5 'einde van elke primer om de beperking enzym te binden en verteren van de amplicon. Zodra de primers zijn ontworpen, hebben de oligonucleotiden commercieel gesynthetiseerd voor gebruik klonen van de SIR2 gen.
    5. Resuspension van de PCR primers: Centrifuge de PCR primers met behulp van een tafelblad microfuge op maximale snelheid gedurende 4 min. Voeg TE-oplossing toe om een voorraadconcentratie van 100 μM te maken. Bewaar de voorraadconcentratie op -20 °C en verdun 1/10 voor gebruik in PCR-toepassingen.
      OPMERKING: Los de primers op in een volume steriele TE-buffer van 10x de hoeveelheid nmoles in de primerbuis met behulp van microliterten van TE. Als de buis bijvoorbeeld 15,6 nmoles primer bevat, voegt u 156 μL TE-buffer toe.
  2. Isoleer wild-type gist gDNA voor PCR versterking van de SIR2 klonen construct.
    LET OP: Verschillende hoogwaardige opties zijn commercieel beschikbaar voor het isoleren van gist gDNA. Het gebruik van een kit die de vertering van de schimmelcelwand met zymolyase omvat, resulteert in een betere kwaliteit gDNA (hogere opbrengst, minder onzuiverheden). Het onderstaande protocol levert consequent een hoge concentratie en zuiverheid op. Details van een kit die wij aanbevelen zijn te vinden in de tabel van materialen.
    1. Kweek 5 mL cultuur van wild-type gist voor 48-72 h tot post-log fase in verrijkte media, zoals YPAD. Pellet de gistcellen op >800 x g gedurende 3 min bij kamertemperatuur, verwijder het groeimedia en resuspend in 120 μL zymolyase digestiebuffer aangevuld met 5 μL zymolyase (2 eenheden enzym/μL). Meng het monster door vortexing en incubeer op 37 °C gedurende 40 minuten.
    2. Voeg 120 μL van een chaotropische lysebuffer (bijvoorbeeld guanidiniumchloride), 250 μL chloroform en vortex het monster voor 60 s.
    3. Centrifuge op >8.000 x g gedurende 2 minuten en breng het supernatant in een zuiveringskolom in een steriele opvangbuis.
    4. Centrifuge op >8.000 x g voor 60 s en gooi de stroom door. De gDNA is gebonden aan de kolommatrix.
    5. Was de kolom twee maal met 300 μL van een op ethanol gebaseerde wasbuffer, waarbij de centrifugatiestap van bovenaf wordt herhaald (3.2.4). Gooi de stroom na elke draai weg. Breng de kolom over in een microfugebuis van 1,5 mL, voeg 60 μL TE-buffer toe en broed bij kamertemperatuur voor 60 s. Flash draai het monster voor 30 s om het DNA te ontwijken.
      LET OP: Bepaal de concentratie van het DNA in het monster (Absorbantie op 260nm) en de kwaliteit (Absorbance 260nm/280nm). Een typische opbrengst is 100-200 ng/ μL gDNA met absorptieverhouding op 260nm/280nm zo dicht mogelijk bij 1,8 mogelijk.
  3. Versterk en isoleer de pRS315 plasmide vector voor klonen.
    LET OP: Verschillende hoogwaardige opties zijn commercieel beschikbaar voor de zuivering van plasmide vectoren. Een silica-gebaseerde kolomchemie wordt aanbevolen voor deze stap. De onderstaande veranderingen hebben geleid tot de hoogste concentratie en zuiverheid. Details zijn te vinden in de tabel van materialen.
    1. Kweek een 5 mL cultuur van E. coli met de pRS315 vector 's nachts in LB + ampicillin (80 μg/mL) media. Pellet de cultuur door centrifugatie op >8.000 x g gedurende 2 min bij RT (15-25 °C).
    2. Opnieuw ophangen pelleted bacteriële cellen in 250 μL van TE buffer met RNase A (100 μg/mL) en overbrengen naar een microcentrifuge buis. Zorg ervoor dat er geen klonten cellen overblijven.
    3. Voeg 250 μL lysebuffer toe en meng door de buis 6–8 keer om te keren. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Laat lysis niet langer dan 5 minuten doorgaan – iets minder heeft de voorkeur.
    4. Voeg 350 μL neutralisatiebuffer toe en meng onmiddellijk en grondig door de buis 10 keer om te keren. Centrifuge gedurende 10 minuten bij >8.000 x g.
    5. Breng de supernatant voorzichtig van bovenaf over naar een silica spinkolom door pipetting. Centrifuge voor 30 s en gooi de flow-through weg.
    6. Voeg 500 μL van een hoge zoutwasbuffer en centrifuge toe zoals in stap 3.3.5. Gooi de doorstroom weg. Was de DNA-bindingsdrain door 750 μL van een wasbuffer op basis van ethanol toe te voegen, om restzouten te verwijderen en centrifugeren zoals in stap 3.3.5.
    7. Gooi de stroom door en centrifuge voor een extra 2 min op >8.000 x g om de resterende wasbuffer te verwijderen. Plaats de spinkolom in een schone, gelabelde 1,5 mL microcentrifugebuis. Voeg 20 μL TE-buffer toe aan het midden van de spinkolom, incubaal gedurende 1 min bij kamertemperatuur en centrifuge gedurende 1 min op >8.000 x g.
    8. Gebruik een spectrofotometer om de hoeveelheid (Absorbantie op 260nm) en de kwaliteit (Absorbantie 260 nm/280 nm) van DNA te bepalen. Een typische opbrengst is 1-2 μg/μL.
  4. PCR versterking van het kandidaat-gen, SIR2, van wild-type genomic DNA
    1. Om een amplicon te produceren die geschikt is voor klonen, gebruikt u een high-fidelity (HF) PCR polymerase om te voorkomen dat de onbedoelde generatie van mutaties in de sequentie wordt versterkt.
      LET OP: Veel verschillende high-fidelity PCR-opties zijn commercieel beschikbaar. Om de optimalisatie van de PCR-reactieomstandigheden te vergemakkelijken, gebruikt u een combinatie met twee buffers: een combinatie met twee buffers: een combinatie met een standaard HF-buffer en een die is geoptimaliseerd voor hoge GC en complexe amplicons. Details zijn te vinden in de tabel van materialen.
    2. PCR versterkt de SIR2-constructie voor klonen zoals beschreven in tabel 1.
      OPMERKING: Om het succes in de kloonstappen te maximaliseren, kunnen meerdere identieke 50 μL worden ingesteld en geconcentreerd door een PCR-kolomopruimingsstap. Zorg ervoor dat u een geen gDNA template controle reactie (negatieve controle).
    3. Stel de FIETSOMSTANDIGHEDEN VAN DE PCR in zoals beschreven in tabel 2.
      LET OP: Verschillende primerparen variëren op hun gloeiende temperatuur en verschillende polymerasen werken bij verschillende snelheden. Zorg ervoor dat u de versterkingsvoorwaarden optimaliseert op basis van het geselecteerde enzym en de specificaties van de primercombinatie zoals ontworpen.
    4. Controleer het succes van de PCR-reactie door de PCR-reactie, die een ongeveer 2,5 kb DNA-fragment zou produceren, te visualiseren op een 1,0% TAE-agarosegel (met 0,5 μg/mL ethidium bromide voor visualisatie).
  5. Spijsvertering en ligatie van het kandidaat-gen, SIR2, in de pRS315 plasmidevector.
    1. Voer beperkingsvertering van de vector en de wisselplaat uit: 625 ng DNA (ofwel de vector of insert), q.s. water om het uiteindelijke reactievolume op 50 μL, 5 μL buffer, 1 μL SacII en 1 μL HindIII te brengen. De beperkingsvertering bij 37 °C gedurende 3 uur uitbroeden, gevolgd door 80 °C gedurende 20 minuten om de enzymen te verwarmen. Digests kunnen worden opgeslagen op 4 °C voordat u doorgaat naar de volgende stap.
    2. Stel een 15 μL ligatiereactie in om de gewenste plasmid te creëren: 6 μL steriel water, 2 μL verteerde vector (50 ng DNA), 4 μL verteerd wisselplaat (100 ng DNA), 2 μL T4-reactiebuffer en 1 μL van T4 DNA Ligase. De ligatiereacties 's nachts bij 16 °C uitbroeden, gevolgd door 80 °C gedurende 20 minuten om het enzym te verwarmen.
      OPMERKING: Stel een geen wisselplaatbesturingselement in en vervang een extra 4 μL steriel water (totaal 10 μL) in plaats van de wisselplaat.
    3. Zet de ligatiereacties om in E. coli.
      OPMERKING: Er zijn veel opties beschikbaar voor bevoegde cellen die beschikbaar zijn. Dit protocol maakt gebruik van chemisch competente cellen die voor gebruik bij -80 °C worden opgeslagen.
      1. Ontdooi een 50 μL buis bevroren, competente E. coli cellen op ijs tot net ontdooid en voeg onmiddellijk 15 μL van de ligatiereactie toe. Veeg meerdere keren op de buis. Breng de buizen onmiddellijk terug naar ijs en incubbate gedurende 30 minuten.
      2. Verwarm de cellen voor 20 s in een waterbad bij precies 42 °C en breng de buizen onmiddellijk terug naar ijs voor een incubatie van 2 minuten. Voeg 450 μL ruimtetemperatuurherstelmedia (bijvoorbeeld SOC of LB) toe aan elke transformatiereactie en broed gedurende 60 minuten bij 37 °C met schudden.
      3. Voor elke transformatiereactie, maak een 1:10 verdunning van cellen. Met behulp van steriele techniek, plaat 150 μL van de onverdunde cellen en de 1:10 verdunningen op LB + (80 μg/mL) ampicillineplaten35. Incubeer de platen bij 37 °C 's nachts.
  6. Scherm potentiële transformatoren voor de overexpressievector.
    1. Met behulp van steriele techniek, inenting van de potentiële transformanten die uitgroeiden tot 5 mL LB + (80 μg/mL) ampicilline en groeien 's nachts. Volgens de procedure die hierboven is beschreven in punt 3.3.1–3.3.7, isoleer de plasmiden van elke potentiële transformant en scherm voor een succesvolle integratie van de wisselplaat door beperking van de spijsvertering, gevolgd door gelelektroforese op een 1,0% TAE-agarosegel (met 0,5 μg/mL ethidium bromide voor visualisatie).

4. Zet de vector om in atg1Δ en giststammen van het wilde type

OPMERKING: Dit wordt uitgevoerd met behulp van een gewijzigd lithiumacetaattransformatieprotocol36.

  1. Pellet 15 mL van wild type en atg1-null gistcellen 's nachts geteeld in YPAD media tot vroeg tot halverwege-log fase (O.D. 600nm = 0,4-0,9) van de groei gedurende 3 min op > 800 x g bij kamertemperatuur.
  2. Decanteer de supernatant, schort de celpellet opnieuw op in 1 mL steriele ddH2O en breng de inhoud over naar een 1,7 mL microfugebuis. Pellet de cellen gedurende 3 min bij > 800 x g bij kamertemperatuur.
  3. Verwijder het supernatant en schort de cellen opnieuw op in 250 μL van 100 mM lithiumacetaat met zachte pipetting. Splits de cellen in afzonderlijke microfugebuizen voor elk van de transformaties die u zult uitvoeren. Gebruik 50 μL van de cel-lithium acetaat mix per transformatie.
  4. Stel een transformatiemix in. Aan elk van de transformaties toe te voegen: 240 μL van 50% PEG3350, 36 μL van 1,0 M Lithium acetaat, en 5 μL van zalm sperma (of andere drager) DNA, gekookt voor 5 min en op ijs.
    LET OP: PEG is erg stroperig. Pipette en zorgvuldig te meten. Meng door pipetting na de toevoeging van elk onderdeel voorafgaand aan het verplaatsen.
  5. Voeg 5 μL van de juiste plasmid toe voor elke uitgevoerde transformatie. Vortex elke buis om grondig te mengen. Incubeer de monsters 45 minuten bij 30 °C. Warmteschokmonsters bij 42 °C gedurende 10 minuten.
  6. Pelletcellen gedurende 3 min bij > 800 x g bij kamertemperatuur, verwijder voorzichtig het transformatiemengsel en schort monsters opnieuw op in 300 μL steriele ddH2O. Pelletcellen door de bovenstaande draai te herhalen, voorzichtig water te verwijderen en uw monsters opnieuw op te schorten in 200 μL steriele ddH2O.
  7. Stel 1/10 en 1/100 verdunningen in voor elke getransformeerde giststam.
  8. Met behulp van steriele techniek plaat 150 μL van elk monster op SC-leucine platen te selecteren voor de plasmiden. Verdeel de cellen gelijkmatig en gelijkmatig en laat de plaat drogen voordat u de plaat omkeert en uitbroedt bij 30 °C om 48-72 uur te groeien.
    OPMERKING: Zodra de juiste stam is gegenereerd, kan deze op lange termijn worden opgeslagen in 25% glycerol bij -80 °C. De kwantificering van het aanwezige exemplaarnummer kan worden bepaald door verschillende methoden, waaronder qPCR, RNA-FISH of een andere passende maatregel37,38.

5. Bepaal de chronologische levensduur om te testen op verkorte CLS-fenotypeonderdrukking

  1. Test het effect van overexpressie van de vermeende suppressor op CLS in de kortstondige gist, atg1Δ mutant, door het bepalen van het aantal kolonievormende eenheden (CFL's) die blijven als functie van tijd39.
    OPMERKING: Het is noodzakelijk om dit gedeelte van het experiment in te stellen met de juiste besturingselementen. Een typisch experiment zal een wild type (WT) stam van gist vergelijken met de lege vector, WT met de suppressor vector, de verwijdering mutant met de lege vector, en de verwijdering mutant met de suppressor vector.
    1. Neem een enkele kolonie van de stam te bestuderen en inenting in SC-LEU media. Kweek de cultuur op 30 °C voor 72 uur, met schudden.
    2. Met behulp van een hemocytometer, bepalen van de concentratie van cellen die aanwezig zijn in de cultuur40.
    3. Verdun een aliquot van de cultuur, zodat het resultaat een uniform aantal cellen in een volume van 150 μL van steriel water is. Plaats de kweek met steriele techniek op SC-LEU platen en groei 72 uur op 30 °C. Deze platen zijn de dag drie keer punt en het experiment zal worden genormaliseerd tot dit tijd-punt als 100% levensvatbaarheid39.
      OPMERKING: Het aantal cellen moet 200-500 zijn, voldoende groot voor de analyse en een beheersbaar aantal voor het tellen. In deze studie gebruikten we 200 cellen voor onze beplatingshoeveelheid.
    4. Blijf de gistculturen bij 30 °C uitbroeden, waarbij regelmatig aliquots en beplating worden gebruikt zoals beschreven in punt 5.1.3. Ga door met dit proces totdat de stammen niet langer levensvatbaar zijn, compileren en analyseren van de resultaten.
      LET OP: De volledige lijst van stammen die in dit onderzoek worden gebruikt, vindt u in tabel 3.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Omdat er tegenstrijdige rapporten zijn over de rol van SIR2 tijdens het ouder worden, kozen we dit gen voor studie als mogelijke suppressor van de atg1Δ mutant verkort CLS fenotype26. De rol van SIR2 is enigszins controversieel, met tegenstrijdige rapporten over zijn rol bij de uitbreiding van CLS, maar het is duidelijk gekoppeld aan verhoogde CLS in ten minste één gistachtergrond , met een rol in zowel autofagie als mitophagy22,

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het ontrafelen van de genetica van veroudering is een moeilijke uitdaging, met veel mogelijkheden voor verdere studie die potentieel significante inzichten kunnen opleveren in de complexe interacties die er bestaan. Er zijn vele methoden die het mogelijk maken voor de snelle generatie van verlies-van-functie mutanten voor de studie van null stammen vangist 45,46. Deze methode biedt een eenvoudige aanpak om genen te identificeren en te klonen op de pRS315-vector v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

James T. Arnone wil de steun van de studenten in de Recombinant DNA Technologies cursus in 2017 en 2018 aan de William Paterson University die betrokken waren bij dit project vanaf het begin te erkennen, maar wiens inspanningen niet de drempel voor auteurschap overschreden: Christopher Andino, Juan Botero, Josephine Bozan, Brenda Calalpa, Brenda Cubas, Headtlove Essel Dadzie, Irvin Gamarra, PreciousGift , Wayne Ko, Nelson Mejia, Hector Mottola, Rabya Naz, Abdullah Odeh, Pearl Paguntalan, Daniel Raza'e, Gabriella Rector, Aida Shono, en Matthew So. Jullie zijn geweldige wetenschappers en ik mis jullie allemaal!

De auteurs willen de onschatbare steun van instructie en onderzoekstechnologie aan de William Paterson University voor hun hulp erkennen: Greg Mattison, Peter Cannarozzi, Rob Meyer, Dante Portella en Henry Heinitsh. De auteurs willen ook erkennen het Bureau van de Provost voor ART ondersteuning, het Bureau van de decaan en het Centrum voor Onderzoek in het College of Science and Health hun steun van dit werk, en het ministerie van Biologie voor de ondersteuning van dit project.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Fungal/Bacterial DNA kitZymo ResearchD6005
HindIIIHF enzymNew England BiolabsR3104S
Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseNew England BiolabsM0530S
Plasmid miniprep kitQiagen12123
SacII enzymNew England BiolabsR0157S
Salmon sperm DNAThermofisherAM9680
T4 DNA ligaseNew England BiolabsM0202S

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
  2. Kenyon, C. The genetics of ageing. Nature. 464 (7288), 504-512 (2010).
  3. Petralia, R. S., Mattson, M. P., Yao, P. J. Aging and longevity in the simplest animals and the quest for immortality. Ageing Research Reviews. 16, 66-82 (2014).
  4. Longo, V. D., Fabrizio, P. Aging Research in Yeast. , Springer. 101-121 (2011).
  5. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).
  6. Galkin, F., Zhang, B., Dmitriev, S. E., Gladyshev, V. N. Reversibility of irreversible aging. Ageing Research Reviews. 49, 104-114 (2019).
  7. Khan, S. S., Singer, B. D., Vaughan, D. E. Molecular and physiological manifestations and measurement of aging in humans. Aging Cell. 16 (4), 624-633 (2017).
  8. Riera, C. E., Merkwirth, C., De Magalhaes Filho, C. D., Dillin, A. Signaling networks determining life span. Annual Review of Biochemistry. 85, 35-64 (2016).
  9. Powers, R. W., Kaeberlein, M., Caldwell, S. D., Kennedy, B. K., Fields, S. Extension of chronological life span in yeast by decreased TOR pathway signaling. Genes & Development. 20 (2), 174-184 (2006).
  10. Lapierre, L. R., Hansen, M. Lessons from C. elegans: signaling pathways for longevity. Trends in Endocrinology & Metabolism. 23 (12), 637-644 (2012).
  11. Fontana, L., Partridge, L., Longo, V. D. Extending healthy life span-from yeast to humans. Science. 328 (5976), 321-326 (2010).
  12. Houtkooper, R. H., Pirinen, E., Auwerx, J. Sirtuins as regulators of metabolism and healthspan. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (4), 225-238 (2012).
  13. Bitto, A., et al. Transient rapamycin treatment can increase lifespan and healthspan in middle-aged mice. elife. 5, 16351(2016).
  14. Fang, E. F., et al. NAD+ replenishment improves lifespan and healthspan in ataxia telangiectasia models via mitophagy and DNA repair. Cell Metabolism. 24 (4), 566-581 (2016).
  15. Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. Large-scale identification in yeast of conserved ageing genes. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (1), 17-21 (2005).
  16. Fabrizio, P., et al. Genome-wide screen in Saccharomyces cerevisiae identifies vacuolar protein sorting, autophagy, biosynthetic, and tRNA methylation genes involved in life span regulation. PLoS Genetics. 6 (7), (2010).
  17. Longo, V. D., Shadel, G. S., Kaeberlein, M., Kennedy, B. Replicative and chronological aging in Saccharomyces cerevisiae. Cell Metabolism. 16 (1), 18-31 (2012).
  18. He, C., Zhou, C., Kennedy, B. K. The yeast replicative aging model. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease. 1864 (9), 2690-2696 (2018).
  19. Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (13), 4916-4920 (2012).
  20. Fabrizio, P., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Aging Cell. 2 (2), 73-81 (2003).
  21. Smith, J., Daniel, L., McClure, J. M., Matecic, M., Smith, J. S. Calorie restriction extends the chronological lifespan of Saccharomyces cerevisiae independently of the Sirtuins. Aging Cell. 6 (5), 649-662 (2007).
  22. Orozco, H., Matallana, E., Aranda, A. Genetic manipulation of longevity-related genes as a tool to regulate yeast life span and metabolite production during winemaking. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1(2013).
  23. Tissenbaum, H. A., Guarente, L. Increased dosage of a sir-2 gene extends lifespan in Caenorhabditis elegans. Nature. 410 (6825), 227-230 (2001).
  24. Huang, W. P., Klionsky, D. J. Autophagy in yeast: a review of the molecular machinery. Cell Structure and Function. 27 (6), 409-420 (2002).
  25. Barbosa, M. C., Grosso, R. A., Fader, C. M. Hallmarks of aging: an autophagic perspective. Frontiers in Endocrinology. 9, 790(2019).
  26. Aris, J. P., et al. Autophagy and leucine promote chronological longevity and respiration proficiency during calorie restriction in yeast. Experimental Gerontology. 48 (10), 1107-1119 (2013).
  27. Cheong, H., Nair, U., Geng, J., Klionsky, D. J. The Atg1 kinase complex is involved in the regulation of protein recruitment to initiate sequestering vesicle formation for nonspecific autophagy in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 19 (2), 668-681 (2008).
  28. Matsuura, A., Tsukada, M., Wada, Y., Ohsumi, Y. Apg1p, a novel protein kinase required for the autophagic process in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 192 (2), 245-250 (1997).
  29. Cherry, J. M., et al. Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast. Nucleic Acids Research. 40, 700-705 (2012).
  30. Engel, S. R., et al. The reference genome sequence of Saccharomyces cerevisiae: then and now. G3: Genes, Genomes, Genetics. 4 (3), 389-398 (2014).
  31. Imai, S. I., Armstrong, C. M., Kaeberlein, M., Guarente, L. Transcriptional silencing and longevity protein Sir2 is an NAD-dependent histone deacetylase. Nature. 403 (6771), 795-800 (2000).
  32. Sampaio-Marques, B., et al. SNCA (α-synuclein)-induced toxicity in yeast cells is dependent on Sir2-mediated mitophagy. Autophagy. 8 (10), 1494-1509 (2012).
  33. Nagalakshmi, U., et al. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing. Science. 320 (5881), 1344-1349 (2008).
  34. De Boer, C. G., Hughes, T. R. YeTFaSCo: a database of evaluated yeast transcription factor sequence specificities. Nucleic Acids Research. 40, 169-179 (2012).
  35. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments. (63), e3064(2012).
  36. Gietz, R. D., Woods, R. A. Methods in Enzymology. 350, Elsevier. 87-96 (2002).
  37. Salvi, S., et al. Serum and plasma copy number detection using real-time PCR. Journal of Visualized Experiments. (130), e56502(2017).
  38. McIsaac, R. S., et al. Visualization and analysis of mRNA molecules using fluorescence in situ hybridization in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Visualized Experiments. (76), e50382(2013).
  39. Mirisola, M. G., Braun, R. J., Petranovic, D. Approaches to study yeast cell aging and death. FEMS Yeast Research. 14 (1), 109-118 (2014).
  40. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. (16), e752(2008).
  41. Lin, S. J., Guarente, L. Nicotinamide adenine dinucleotide, a metabolic regulator of transcription, longevity and disease. Current Opinion in Cell Biology. 15 (2), 241-246 (2003).
  42. Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).
  43. Romanos, M. A., Scorer, C. A., Clare, J. J. Foreign gene expression in yeast: a review. Yeast. 8 (6), 423-488 (1992).
  44. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 29 (9), 45(2001).
  45. Storici, F., Resnick, M. A. The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods in Enzymology. 409, 329-345 (2006).
  46. DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).
  47. Arnone, J. T. Genomic Considerations for the Modification of Saccharomyces cerevisiae for Biofuel and Metabolite Biosynthesis. Microorganisms. 8 (3), (2020).
  48. Murakami, C., Kaeberlein, M. Quantifying yeast chronological life span by outgrowth of aged cells. Journal of Visualized Experiments. (27), e1156(2009).
  49. Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. Measuring replicative life span in the budding yeast. Journal of Visualized Experiments. (28), e1209(2009).
  50. Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast. Journal of Visualized Experiments. (78), e50143(2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

GistgeneticagenoverexpressieATG1 mutantSIR2 genplasmid onrestrictiedigestiegisttransformatielevensduuranalyse

Gerelateerde artikelen