Methodenartikel

Functionele analyse van tumor-infiltrerende myeloïde cellen door middel van flowcytometrie en adoptieve overdracht

3.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61511

⸱

5 maart 2021

 ,  , 
1Department of Pathology and Molecular Medicine, McMaster University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol biedt betrouwbare methoden voor solide tumordissociatie en myeloïde celisolatie in intradermale of subcutane tumormodellen van muizen. Flowcytometrie maakt fenotypische karakterisering van heterogene myeloïde populaties binnen de micro-omgeving van de tumor mogelijk en sortering zal hun functionaliteit aantonen in de context van adoptieve overdracht.

Samenvatting

Het tumor-infiltrerende myeloïde celcompartiment vertegenwoordigt een heterogene populatie van breed immunosuppressieve cellen die door de tumor zijn uitgebuit om de groei ervan te ondersteunen. Hun accumulatie in tumor- en secundair lymfoïde weefsel leidt tot de onderdrukking van antitumorimmuunresponsen en is dus een doelwit voor therapeutische interventie. Omdat bekend is dat het lokale cytokinemilieu de functionele programmering van tumor-infiltrerende myeloïde cellen kan dicteren, zijn er strategieën bedacht om de tumormicro-omgeving (TME) te manipuleren om een cytokinelandschap tot expressie te brengen dat meer bevorderlijk is voor antitumor myeloïde celactiviteit. Om therapie-geïnduceerde veranderingen in tumor-infiltrerende myeloïde cellen te evalueren, zal dit artikel de procedure schetsen om intradermaal/subcutaan tumorweefsel te dissociëren van solide tumordragende muizen ter voorbereiding op het herstel van leukocyten. Strategieën voor flowcytometrische analyse zullen worden aangereikt om de identificatie van heterogene myeloïde populaties binnen geïsoleerde leukocyten en de karakterisering van unieke myeloïde fenotypes mogelijk te maken. Ten slotte zal dit artikel een manier beschrijven om levensvatbare myeloïde cellen te zuiveren voor functionele assays en hun therapeutische waarde te bepalen in de context van adoptieve overdracht.

Inleiding

De tumormicro-omgeving (TME) bestaat uit snel prolifererende neoplastische cellen en een omringend heterogeen stromaal celcompartiment. Aangezien groeiende tumoren vaak slecht gevasculariseerd zijn, is de TME een perifere plaats die uniek wordt gekenmerkt door hypoxie, tekort aan voedingsstoffen en acidose1. Om in dit landschap te overleven, resulteren tumorstressreacties en metabole herprogrammering in de secretie van oplosbare factoren die weefselremodellering en angiogenese bevorderen, evenals de selectieve rekrutering van immuuncellen2. Aangezien myeloïde cellen een van de meest voorkomende soorten hematopoëtische cellen in de TME zijn, is er steeds meer belangstelling voor het onderzoeken van de rol van tumor-infiltrerende myeloïde cellen in de TME.

Myeloïde cellen zijn een heterogene en plastische groep van aangeboren immuuncellen, waaronder monocyten, macrofagen, dendritische cellen en granulocyten. Hoewel ze een cruciale rol spelen in weefselhomeostase en adaptieve regulering van de immuunrespons, kan hun functie polariserend zijn, afhankelijk van de samenstelling van activeringssignalen binnen de lokale micro-omgeving3. Tumoren profiteren van de kenmerken van myeloïde cellen door de afscheiding van oplosbare factoren in de TME. Deze alternatieve signalen kunnen myelopoëse omleiden naar onrijpe differentiatie en de functie van bestaande tumor-infiltrerende myeloïde cellen vertekenen3. Myeloïde cellen in de TME bevorderen inderdaad vaak de progressie van kanker en kunnen antitumorale immuunresponsen onderdrukken, wat leidt tot nadelige effecten op de kankertherapie.

Hoewel is aangetoond dat therapeutische strategieën die de uitputting van immunosuppressieve myeloïde cellen bevorderen, de tumorgroei vertragen4, riskeert het gebrek aan doelspecificiteit de verwijdering van immunostimulerende myeloïde cellen, die daarentegen helpen bij het oplossen van kanker. Deze inflammatoire myeloïde cellen kunnen diepgaande antitumoreffecten hebben, waaronder directe doding van tumorcellen en activering van cytotoxische CD8+ T-cellen5. Als alternatief hebben strategieën die de samenstelling en functie van myeloïde cellen in de TME normaliseren, therapeutisch succes aangetoond6; De biologische mechanismen die ten grondslag liggen aan hun heropvoeding naar een antitumorfenotype zijn echter nog steeds niet volledig begrepen. Uiteindelijk is een uitgebreide karakterisering van tumormyeloïde cellen nodig voor verdere verbetering van de kankertherapie.

Helaas is reproduceerbare desaggregatie van tumoren voor myeloïde celisolatie een uitdaging. Van tumoren afgeleide myeloïde cellen zijn gevoelig voor ex vivo manipulatie in vergelijking met andere subgroepen van leukocyten, en de agressiviteit van tumorverwerking kan leiden tot enzymatische epitoopsplitsing en verminderde levensvatbaarheid van herstelde cellen7. Het doel van deze methode is om een betrouwbare manier van tumordissociatie te bieden om de integriteit van de oppervlaktemarker te behouden voor analyse en cellulaire vitaliteit voor functioneel onderzoek. In vergelijking met tumor-infiltrerende leukocyten (TIL) isolatieprotocollen die de voorkeur geven aan hardere enzymatische mengsels om de reproduceerbare afgifte van verschillende cellulaire subsets te verbeteren, geeft deze methode de voorkeur aan een meer conservatieve enzymatische vertering om het herstel van myeloïde cellen te maximaliseren. Er worden ook meerkleurige flowpoortstrategieën op hoog niveau aangeboden om subsets van myeloïde cellen van muizentumoren te identificeren voor verdere karakterisering en/of sortering.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Alle dierstudies voldeden aan de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care en werden goedgekeurd door de Animal Research Ethics Board van McMaster University.

1. Tumoroogst en dissociatie

  1. Inoculeer 6-8 weken oude, vrouwelijke, C57BL/6 muizen intradermaal/subcutaan met 2 × 105 B16-melanoomcellen zoals beschreven door Nguyen et al.8 Laat tumoren 7 dagen groeien voordat ze worden geoogst.
  2. Euthanaseer de muis door cervicale dislocatie en zorg ervoor dat de tumor hierbij niet wordt verstoord. Spuit de muis voor het oogsten in met 70% ethanol.
  3. Verwijder met een scalpel en een schaar operatief de intradermale/onderhuidse tumor uit het omliggende weefsel (inclusief aangehechte tumorafvoerende lymfeklieren) en plaats de tumoren in een vooraf gewogen microfugebuis. Blijf op ijs.
    OPMERKING: Voer de tumoroogst uit in een bioveiligheidskast voor dierlijk gebruik. Gebruik een conische tube van 15 ml voor grotere tumoren.
  4. Weeg de tumoren en voeg 500 μL RPMI-1640 medium met 10% foetaal runderserum (FBS) toe aan elke buis, gebruik een schaar om de tumoren in kleine stukjes te knippen in de buis of in een plaat met 6 putjes.
    OPMERKING: De stukjes tumor moeten klein genoeg zijn om door een elektrische pipettor te worden gemengd nadat het spijsverteringsmedium is toegevoegd.
  5. Bereid de dissociatiemix voor door collagenase type IV op te lossen bij 0,5 mg/ml en DNase bij 0,2 mg/ml in RPMI-1640-medium met 10% FBS en 5 mM calciumchloride.
    OPMERKING: De dissociatiemix moet vers worden bereid om de collagenase-activiteit te maximaliseren.
  6. Breng de fijngehakte tumorsuspensie over in een conische buis van 15 ml en voeg 10 ml dissociatiemix toe per 0,25 mg tumor. Plaats de buis gedurende 30 minuten in een orbitale schudder met temperatuurregeling bij 37 °C met 200 tpm roeren. Neutraliseer de collagenase-activiteit door twee volumes koud RPMI-1640-medium met 10% FBS en 2 mM ethyleendiamine tetra-azijnzuur (EDTA) toe te voegen en 10 minuten in de koelkast te bewaren bij 4 °C.
  7. Draai en pipetteer de suspensie kort in een zeef van 40 μm op een conische buis van 50 ml. Gebruik een spuitzuiger en neutraliserende media om het resterende tumorweefsel uit elkaar te halen en spoel het door de zeef. Centrifugeer de suspensie gedurende 5 minuten (500 × g, 4 °C), gooi het bovenstaande weg en resustrien de pellet in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 2% FBS en 1 mM EDTA.

2. TIL-verrijking en flowcytometrische kleuring (FACS)

  1. Om TIL's te verrijken voor de karakterisering van myeloïde cellen, gebruikt u een magnetische celscheidingskit die is ontworpen voor biotine-positieve selectie met gebiotinyleerde CD45.2-antilichamen volgens de instructies van de fabrikant (zie de materiaaltabel).
  2. Resuspendeer de cellen in 200 μL FACS-buffer (PBS met 0,5% w/v runderserumalbumine (BSA)) en breng ze over naar een U-bodemplaat met 96 putjes.
    OPMERKING: Overschrijd een kleuringsconcentratie van 1 × 108 cellen/ml niet. Pas het volume aan en splits de monsters in meerdere putjes om het hoge aantal cellen te compenseren.
  3. Centrifugeer de plaat gedurende 5 minuten (500 × g, 4 °C) en gooi het bovenstaande weg. Voeg 50 μl Fc-blokoplossing toe (1:200 verdunning van gezuiverd ratten anti-muis CD16/CD32 [zie de materiaaltabel) in FACS-buffer, eindconcentratie van 2,5 μg/ml) en breng de cellen opnieuw in sustribueren door te pipetteren. Incubeer gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  4. Voeg 50 μL FACS-buffer toe met een 2x concentratie van oppervlaktekleurend antilichaam (1:50 verdunning van CD45.2, NK1.1, CD11c, F4/80, CD8a, Ly6C, CD11b, CD4, Ly6G) en fixeerbare levensvatbaarheidskleuring (FVS, 1:500 verdunning) en meng de cellen door te pipetteren. Incubeer gedurende 20 minuten bij 4 °C.
    NOTITIE: Bedek de plaat met aluminiumfolie om blootstelling aan licht te minimaliseren. Antilichamen moeten voorafgaand aan het experiment worden getitreerd om empirisch de optimale verdunning te bepalen.
  5. Was de cellen twee keer door 200 μL FACS-buffer aan elk putje toe te voegen, de suspensie te centrifugeren (5 min, 500 × g, 4 °C) en het supernatant weg te gooien.
  6. Voeg 100 μl fixatie-/permeabilisatieoplossing (zie de materiaaltabel) toe aan elk putje, meng de cellen door te pipetteren en incubeer gedurende 20 minuten bij 4 °C.
  7. Voeg 100 μL 1x permeabilisatiebuffer (zie de materiaaltabel) toe aan elk putje, centrifugeer de plaat gedurende 5 minuten (500 × g, 4 °C) en gooi het supernatant weg.
  8. Was de cellen door 200 μL 1x permeabilisatiebuffer aan elk putje toe te voegen, de suspensie te centrifugeren (5 min, 500 × g, 4 °C) en het supernatant weg te gooien.
    OPMERKING: Het experiment kan 's nachts worden gepauzeerd nadat de cellen in de permeabilisatiebuffer zijn geresuspendeerd. Bewaar het monster bij 4 °C en beschermd tegen licht. Ga verder na het kort mengen van de cellen voordat u gaat centrifugeren.
  9. Voeg 100 μL permeabilisatiebuffer toe met 1x concentratie van intracellulair kleuringsantilichaam (1:100 verdunning van stikstofmonoxidesynthase 2 (NOS2), arginase 1 (Arg1)), en meng de cellen door te pipetteren. Incubeer gedurende 20 minuten bij 4 °C.
    NOTITIE: Bedek de plaat met aluminiumfolie om blootstelling aan licht te minimaliseren. Antilichamen moeten voorafgaand aan het experiment worden getitreerd om empirisch de optimale verdunning te bepalen.
  10. Voeg 100 μL 1x permeabilisatiebuffer toe aan elk putje, centrifugeer de plaat gedurende 5 minuten (500 × g, 4 °C) en gooi het supernatant weg.
  11. Was de cellen door 200 μL 1x permeabilisatiebuffer toe te voegen aan elk putje, de suspensie te centrifugeren (5 min, 500 × g, 4 °C) en het supernatant weg te gooien.
  12. Resuspendeer de cellen in 300 μL FACS-buffer. Filtreer het monster door een polystyreenbuis van 5 ml met ronde bodem en zeefdop van 40 μm voordat u een flowcytometrieanalyse uitvoert.

3. Sortering van tumormyeloïde cellen voor functionele studies

  1. Na het identificeren van de gewenste myeloïde celpopulaties door middel van flowcytometrie-analyse, verrijk u bulkmyeloïde cellen voor sortering met een magnetische celscheidingskit die is ontworpen voor CD11b- of CD11c-positieve selectie volgens de instructies van de fabrikant (zie de materiaaltabel).
  2. Gebruik oppervlaktekleurende antilichamen die specifiek zijn voor de gewenste subsets van myeloïde cellen (1:100 verdunning van CD11b, Ly6C, Ly6G) om de voorverrijkte cellen te kleuren zoals beschreven in de stappen 2.2-2.5.
    OPMERKING: Voeg een fixeerbare levensvatbaarheidsvlek toe om het sorteren van levende myeloïde cellen te garanderen. Overschrijd een kleuringsconcentratie van 1 × 108 cellen/ml niet. Pas het volume aan en verdeel de monsters in meerdere putjes om het hoge aantal cellen te compenseren.
  3. Resuspendeer de cellen in een koude sorteerbuffer (PBS met 1% w/v BSA, 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) en 1 mM EDTA). Filtreer het monster door een polypropyleen buis van 5 ml met ronde bodem en een zeefdop van 40 μm. Houd de cellen op ijs en dek de buis af met aluminiumfolie.
    OPMERKING: Pas de concentratie van cellen/volume aan de gewenste instrumentspecificatie aan voor het sorteren.
  4. Bereid een monsterafnamebuis voor met opvangmedium (5 ml polypropyleen buis met ronde bodem die PBS bevat met 50% FBS).
    OPMERKING: Smeer de tubes met 5 ml opvangmedium een nacht in voordat u gaat sorteren. Gooi alles behalve 1-2 ml van het opnamemedium de volgende dag weg voordat u het monster uitvoert.
  5. Wijzig de instellingen van het sorteerinstrument om de monsterdruk te verlagen en verstoringen in de druppelvorming te voorkomen. Rust de nozzletip van 130 μm uit en gebruik de instelling van 10 psi. Laat het monster met een laag debiet draaien met periodieke monsteragitatie bij 100 tpm, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de afzetting van druppels zich in het midden van de buis bevindt. Bewaar het monster na het sorteren op ijs.
  6. Incubeer het monster gedurende 10 minuten bij 4 °C. Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten (500 × g, 4 °C), gooi het bovenstaande weg en suspendeer de pellet opnieuw in het gewenste medium voor functionele tests of adoptieve overdracht.

4. Adoptieve overdracht van gezuiverde tumor myeloïde cellen

  1. Inoculeer 6-8 weken oude, vrouwelijke, C57BL/6 muizen intradermaal met 1 × 106 B16 melanoom tumorcellen geresuspendeerd in 30 μL PBS.
    OPMERKING: Inoculeer muizen van tevoren zodat de tumorgroei niet groter is dan 100 mm3 op het moment van adoptieve overdracht.
  2. Resuspendeer de gesorteerde tumormyeloïde cellen in PBS met 25 mM HEPES en 1 mM EDTA in een concentratie van 2 × 106 cellen/ml. Filtreer het monster door een polystyreenbuis van 5 ml met ronde bodem en een zeefdop van 40 μm. Blijf op ijs.
  3. Induceer en onderhoud muizen onder narcose met 3% isofluraan. Breng oogzalf aan om uitdroging/letsel van de ogen te voorkomen.
  4. Vul een spuit van 31 g met 50 μl celsuspensie. Maak luchtbellen los door voorzichtig met de spuit te tikken. Reinig de injectieplaats met een alcoholdoekje.
  5. Til met een steriele tang de huid aan de basis van de tumor op. Steek de naald in de onderhuidse ruimte in een lichte opwaartse hoek om de tumor van onder de huid binnen te dringen. Gebruik de tang om in de huid rond de naald te knijpen en doseer langzaam het spuitvolume. Blijf met de tang in de huid knijpen terwijl u de naald langzaam verwijdert, en gebruik een wattenstaafje om mogelijke lekkage te verwijderen.
    OPMERKING: Ga indien gewenst verder met eventuele aanvullende therapeutische behandelingen.
  6. Laat de muizen herstellen van de anesthesie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De resultaten tonen aan dat deze methode een hoge opbrengst aan myeloïde cellen uit solide muizentumoren oplevert. Het behoud van de integriteit van de receptor en de cellulaire levensvatbaarheid vergemakkelijkt een betrouwbare functionele analyse van de gewenste myeloïde subsets. Deze verbeteringen in de isolatie van myeloïde cellen maakten het mogelijk om de veranderende functie van intratumorale myeloïde cellen te onderscheiden na normalisatie van de TME met de klasse I histondeacetyl...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hoewel tumor-infiltrerende myeloïde cellen in verschillende activerings- en differentiatietoestanden binnen de tumor voorkomen, zijn er verschillende subgroepen geïdentificeerd, waaronder tumor-geassocieerde DC's (TADC's), tumor-geassocieerde neutrofielen (TAN's), myeloïde-afgeleide suppressorcellen (MDSC's) en tumor-geassocieerde macrofagen (TAM's)12. Helaas maakt de overlappende expressie van celoppervlakmarkers die worden gebruikt om deze myeloïde celsubsets te...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Ontario Institute for Cancer Research door middel van financiering door de regering van Ontario, evenals de Canadian Institutes of Health Research (FRN 123516 en FRN 152954), de Canadian Cancer Society (grant 705143) en het Terry Fox Research Institute (TFRI-1073).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Alexa Fluor 700 Mouse Anti-Mouse CD45.2BD Biosciences5606931:100
APC-Cy7 Mouse Anti-Mouse NK-1.1BD Biosciences5606181:100
Biotin Mouse Anti-Mouse CD45.2BD Biosciences553771
BV421 Hamster Anti-Mouse CD11cBD Biosciences5627821:100
BV650 Rat Anti-Mouse F4/80BD Biosciences7432821:100
BV711 Rat Anti-Mouse CD8aBD Biosciences5630461:100
Collagenase, Type IV, poederGibco17104019
DNase IRoche10104159001
EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit IIStemcell technologies18970
EasySep Mouse CD11c Positive Selection Kit IIStemcell technologies18780
EasySep Release Mouse Biotin Positive Selection KitStemcell technologies17655
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6CBD Biosciences5531041:100
Fixable Viability Stain 510BD Biosciences5644061:1000
Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD Cytofix/Cytoperm)BD Biosciences554714
PE Rat Anti-CD11bBD Biosciences5573971:100
PE-Cy7 Rat Anti-Mouse CD4BD Biosciences5527751:100
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse Ly-6GBD Biosciences5606021:100
Perm/Wash (BD Perm/Wash)BD Biosciences554723
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)BD Biosciences553141
iNOS Monoclonal Antibody (CXNFT), APCThermo Fisher17-5920-821:100
Human/Mouse Arginase 1/ARG1 Fluorescein-geconjugeerd AntilichaamR&D SystemsIC5868F1:100

Referenties

  1. Paardekooper, L. M., Vos, W., vanden Bogaart, G. Oxygen in the tumor microenvironment: effects on dendritic cell function. Oncotarget. 10 (8), 883-896 (2019).
  2. Schouppe, E., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. A., Sarukhan, A. Instruction of myeloid cells by the tumor microenvironment: Open questions on the dynamics and plasticity of different tumor-associated myeloid cell populations. Oncoimmunology. 1 (7), 1135-1145 (2012).
  3. Jahchan, N. S., et al. Tuning the tumor myeloid microenvironment to fight cancer. Frontiers in Immunology. 10, 1611(2019).
  4. Srivastava, M. K., et al. Myeloid suppressor cell depletion augments antitumor activity in lung cancer. PLoS One. 7 (7), 40677(2012).
  5. Awad, R. M., De Vlaeminck, Y., Maebe, J., Goyvaerts, C., Breckpot, K. Turn back the TIMe: targeting tumor infiltrating myeloid cells to revert cancer progression. Frontiers in Immunology. 9, 1977(2018).
  6. Strauss, L., et al. Targeted deletion of PD-1 in myeloid cells induces antitumor immunity. Science Immunology. 5 (43), 1863(2020).
  7. Cassetta, L., et al. Deciphering myeloid-derived suppressor cells: isolation and markers in humans, mice and non-human primates. Cancer Immunology, Immunotherapy. 68 (4), 687-697 (2019).
  8. Nguyen, A., et al. HDACi delivery reprograms tumor-infiltrating myeloid cells to eliminate antigen-loss variants. Cell Reports. 24 (3), 642-654 (2018).
  9. Newton, J. M., Hanoteau, A., Sikora, A. G. Enrichment and characterization of the tumor immune and non-immune microenvironments in established subcutaneous murine tumors. Journal of Visual Experiments: JoVE. (136), e57685(2018).
  10. Engfeldt, P., Arner, P., Ostman, J. Nature of the inhibitory effect of collagenase on phosphodiesterase activity. Journal of Lipid Research. 26 (8), 977-981 (1985).
  11. Quah, B. J., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. Journal of Visual Experiments: JoVE. (44), e2259(2010).
  12. Schupp, J., et al. Targeting myeloid cells in the tumor sustaining microenvironment. Cellular Immunology. 343, 103713(2019).
  13. Gabrilovich, D. I., Ostrand-Rosenberg, S., Bronte, V. Coordinated regulation of myeloid cells by tumours. Nature Reviews Immunology. 12 (4), 253-268 (2012).
  14. Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
  15. Roussel, M., et al. Mass cytometry deep phenotyping of human mononuclear phagocytes and myeloid-derived suppressor cells from human blood and bone marrow. Journal of Leukocyte Biology. 102 (2), 437-447 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Flowcytometrische analyseadoptieve transferprocedureterugwinning van leukocytenkarakterisering van het myelo de fenotypemanipulatie van de tumormicro omgevingeffecten van het cytokinemilieudissociatie van solide tumorenzuivering van levensvatbare myelo de cellenevaluatie van functionele assays
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen