Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Toegang tot de cytotoxiciteit en celrespons op biomaterialen

4.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61512

⸱

8 juli 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Integrated Clinical Practice, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 2Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR) area of Environment Genetics and Oncobiology (CIMAGO), University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 3Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB), University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 4Clinical Academic Center of Coimbra, CACC, Portugal, 5Institute of Biophysics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 6Laboratory of Oncobiology and Hematology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 7Institute of Endodontics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 8Institute of Experimental Pathology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Deze methodologie is gericht op het evalueren van biomateriaal cytotoxiciteit door de bereiding van oplosbare extracten, met behulp van levensvatbaarheidstests en fenotypische analyse, waaronder flowcytometrie, RT-PCR, immunocytochemie en andere cellulaire en moleculaire biologietechnieken.

Samenvatting

Biomaterialen komen direct of indirect in contact met de menselijke weefsels, waardoor het belangrijk is om de cytotoxiciteit ervan te evalueren. Deze evaluatie kan op verschillende manieren worden uitgevoerd, maar er bestaat een grote discrepantie tussen de gebruikte benaderingen, waardoor de reproduceerbaarheid en de vergelijking tussen de verkregen resultaten in het gedrang komen. In dit artikel stellen we een protocol voor om de cytotoxiciteit van biomaterialen te evalueren met behulp van oplosbare extracten, die we gebruiken voor tandheelkundige biomaterialen. De extractenbereiding is gedetailleerd, van de productie van pellets tot de extractie ervan in een kweekmedium. De cytotoxiciteitsevaluatie van biomaterialen is gebaseerd op metabole activiteit met behulp van de MTT-test, levensvatbaarheid van cellen met behulp van de Sulphorhodamine B (SBR) -test, celdoodprofiel door flowcytometrie en celmorfologie met behulp van May-Grünwald Giemsa. Naast cytotoxiciteitsevaluatie wordt een protocol beschreven om de celfunctie te evalueren op basis van de expressie van specifieke markers die zijn beoordeeld door immunocytochemie en PCR. Dit protocol biedt een uitgebreide gids voor de cytotoxiciteit van biomaterialen en de evaluatie van cellulaire effecten, met behulp van de extractenmethodologie, op een reproduceerbare en robuuste manier.

Inleiding

Biocompatibiliteit kan worden gedefinieerd als het vermogen van een materiaal om weefsel te integreren en een gunstige therapeutische respons te induceren, vrij van lokale en systemische schade 1,2,3. Biocompatibiliteitsevaluatie is cruciaal voor de ontwikkeling van elk materiaal dat bedoeld is voor medisch gebruik. Daarom biedt dit protocol een systematische en alomvattende aanpak voor elke onderzoeker die nieuwe biomaterialen wil ontwikkelen of nieuwe toepassingen voor bestaande biomaterialen wil bestuderen.

In vitro cytotoxiciteitstests worden veel gebruikt als de eerste fase voor biocompatibiliteitsevaluatie, met behulp van primaire celculturen of cellijnen. De resultaten vormen een eerste indicator van mogelijke klinische toepassing. Naast het feit dat het van vitaal belang is voor de ontwikkeling van biomaterialen, is deze test verplicht om te voldoen aan de huidige regelgeving voor marktintroductie, van EUA- en EU-regelgevers (FDA- en CE-certificering)4,5,6,7,8. Bovendien bieden gestandaardiseerde tests in biomedisch onderzoek een aanzienlijk voordeel in termen van reproduceerbaarheid en vergelijking van resultaten van verschillende studies op vergelijkbare biomaterialen of apparaten9.

De richtlijnen van de International Organization for Standardization (ISO) worden veel gebruikt door meerdere onafhankelijke commerciële, regelgevende en academische laboratoria voor het testen van materialen op een nauwkeurige en reproduceerbare manier. De ISO 10993-5 verwijst naar de in vitro cytotoxiciteitsbeoordeling en de ISO 10993-12-rapporten naar bemonsteringsvoorbereiding10,11. Voor het testen van biomaterialen worden drie categorieën verstrekt, te selecteren op basis van het materiaaltype, contactweefsels en het behandelingsdoel: extracten, direct contact en indirect contact 8,11,12,13. Extracten worden verkregen door een celkweekmedium te verrijken met het biomateriaal. Voor de directe contacttests wordt het biomateriaal direct op de celculturen geplaatst en bij indirect contact wordt incubatie met de cellen uitgevoerd, gescheiden door een barrière, zoals een agarosegel11. Passende controles zijn verplicht en er moeten minimaal drie onafhankelijke experimenten worden uitgevoerd 5,8,10,11,14.

Het is van cruciaal belang om klinische omstandigheden te simuleren of te overdrijven om het cytotoxische potentieel te bepalen. In het geval van extractentests, het oppervlak van het materiaal;  het gemiddelde volume; het medium en de pH van het materiaal; de oplosbaarheid, osmolariteit en diffusieverhouding van het materiaal; en de extractieomstandigheden zoals agitatie, temperatuur en tijd beïnvloeden mediaverrijking5.

De methodologie maakt de kwantitatieve en kwalitatieve evaluatie van cytotoxiciteit van verschillende farmaceutische formuleringen, zowel vast als vloeibaar, mogelijk. Er kunnen verschillende testen worden uitgevoerd, zoals een neutrale rode opnametest, kolonievormingstest, MTT-test en XTT-test 5,10,14.

De meeste gepubliceerde cytotoxiciteitsbeoordelingsstudies gebruiken eenvoudigere testen, namelijk MTT en XTT, die beperkte informatie opleveren. De beoordeling van de biocompatibiliteit moet niet alleen de beoordeling van de cytotoxiciteit omvatten, maar ook de bioactiviteit van een bepaald testmateriaal2, zoals dit protocol onderschrijft. Aanvullende evaluatiecriteria moeten worden gebruikt wanneer dit gerechtvaardigd en gedocumenteerd is. Dit protocol is dus bedoeld om een uitgebreide gids te bieden, met een reeks methoden voor de evaluatie van de cytotoxiciteit van biomaterialen. Daarnaast wordt de evaluatie van verschillende cellulaire processen, namelijk het type celdood, celmorfologie, celfunctie bij de synthese van specifieke eiwitten en specifieke weefselproductie, beschreven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Pellets bereiding

  1. Bereid de polyvinylchloride (PVC) mallen voor door cirkelvormige gaten van bekende afmetingen in PVC-platen uit te voeren.
    OPMERKING: PVC-lijsten kunnen van verschillende afmetingen worden gemaakt. Bereken het contactoppervlak van PVC-mallen met behulp van de formule A= h(2πr)+2πr2 (r: straal van de cilinder; h: hoogte van de cilinder).
  2. Bereid het te testen biomateriaal voor volgens de instructies van de fabrikant en zo dicht mogelijk bij het begin van het experiment.
    OPMERKING: Voor de bereiding van biomaterialen voor pasta/pastaformulering worden een voldoende hoeveelheid basispasta en katalysator handmatig gemengd met een mengspatel. Voor andere materialen op basis van vloeibare en poederformuleringen moet handmatige spatulatie of mechanische menging met trillingen worden uitgevoerd, volgens de instructies van de fabrikant of passend voor nieuwe materialen. Voor vloeibare materialen is deze stap niet nodig. Start het protocol in stap 2.
  3. Plaats het biomateriaal met een spatel op de vormpjes en laat ze op de juiste tijd opstijven.
    OPMERKING: De insteltijd en instelomstandigheden van de biomaterialen moeten voldoen aan de instructies van de fabrikant of aan de instructies die geschikt zijn voor nieuwe materialen.
  4. Verwijder na het uitzetten de pellets van het biomateriaal uit de PVC-mallen en plaats ze in een container (een 6-putplaat of een petrischaal kan worden gebruikt).
  5. Steriliseer de pellets door ze gedurende 20 minuten voor elke kant onder een ultraviolette lichtlamp (UV) te plaatsen.

2. Verkrijging van de extracten van de biomaterialen

OPMERKING: Alle procedures moeten worden uitgevoerd onder strikte steriele omstandigheden.

  1. Bepaal het benodigde aantal pellets door het pelletoppervlak te berekenen op basis van de in punt 1.1 beschreven formule.
    OPMERKING: Als referentiewaarde wordt het contactoppervlak van 250 mm2/ml11,15 bereikt door toevoeging van 9 pellets (r 3 mm x h 1,5 mm) per ml medium.
  2. Bereid de oplosbare extracten (extract verrijkt met het biomateriaal).
    1. Doe de pellets in een buis van 50 ml en voeg het overeenkomstige celkweekmedium toe. Plaats de buizen gedurende 24 uur in de couveuse op 37°, in constante rotatie.
      OPMERKING: Gebruik het celkweekmedium dat geschikt is voor de celculturen.
    2. Verwijder na 24 uur de buizen uit de couveuse. Op dit punt komen de extracten overeen met een concentratie van 1/1 of 100%.
    3. Maak verdunningen van het extract door opeenvolgende toevoeging van gelijke volumes geconditioneerd medium aan celkweekmedium.
      OPMERKING: Er mag geen pH-aanpassing worden uitgevoerd voor de media.
      1. Voeg 1 ml kweekmedia toe aan 1 ml 100% extract om een extract van 50% te verkrijgen. Voeg 1 ml kweekmedia toe aan 1 ml 50% extract om een extract van 25% te verkrijgen, enzovoort (figuur 1).
        OPMERKING: Gebruik de concentraties die relevant zijn bevonden voor elke verbinding.

figure-protocol-1
Figuur 1: Schema van de bereiding en verdunningen van oplosbare extracten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Celincubatie met de extracten van de biomaterialen

  1. Bereid een cellulaire suspensie voor en plaats deze in een geschikte celcontainer, zoals een multiwell-plaat, volgens het aantal cellen dat nodig is voor de experimenten.
    1. Begin met een kolf van de gewenste cellen met 80% tot 90% samenvloeiing.
    2. Gooi de celkweekmedia weg, was met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en maak de cellen los met trypsine-EDTA (1 tot 2 ml voor een 75 cm2 celkweekkolf).
    3. Voeg de celkweekmedia toe (2 tot 4 ml voor een 2-celkweekkolf van 75 cm), breng de celsuspensie over in een buis en centrifugeer gedurende 5 minuten op 200 x g.
    4. Suspensie van de pellet in een bekend volume celkweekmedia.
      OPMERKING: Dit protocol is ontworpen voor het gebruik van aanhangende celculturen; Er kunnen echter eenvoudige aanpassingen worden gemaakt om met suspensiecelculturen te werken.
    5. Tel de cellen in de hemocytometer en bereken de celconcentratie van de celsuspensie.
    6. Suspensie de bepaalde hoeveelheid celsuspensie in kweekmedium en breng over naar multiwell-gerechten. Neem als referentiewaarde voor de zaaidichtheid 5 – 20 x 105 cellen/cm2.
      OPMERKING: Het toegewezen aantal cellen moet worden berekend op basis van het celtype en de celkenmerken, namelijk de celverdubbelingstijd.
  2. Incubeer de cellen gedurende 24 uur om celhechting mogelijk te maken.
  3. Dien na deze periode de oplosbare extracten toe in de kweekplaten.
    1. Zuig het celkweekmedium op.
    2. Voeg de extracten van de biomaterialen toe aan elke put, volgens de volgorde van concentraties, zoals eerder beschreven. Voeg vers celkweekmedium toe aan de controleputten.
    3. Incubeer de platen gedurende 24 uur of langer.
      OPMERKING: In elke test moeten negatieve controles worden uitgevoerd, overeenkomend met onbehandelde cellen, die in het kweekmedium worden bewaard. De incubatietijden kunnen worden geselecteerd op basis van de studiedoelen.

4. Evaluatie van de metabole activiteit

  1. Na de celincubatie met de extracten van de biomaterialen, zuig het medium uit de platen en was elke put PBS.
  2. Breng in elk putje het voldoende volume van 0,5 mg/ml 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolbromide (MTT) bereid in PBS, pH 7,4.
  3. Incubeer de platen gedurende 4 uur of 's nachts in het donker bij 37 ° C.
  4. Om de verkregen formazankristallen op te lossen, voegt u het adequate volume van 0,04 M-oplossing van zoutzuur in isopropanol toe aan elke put en roert u de platen gedurende 30 minuten.
    OPMERKING: Pas de hoeveelheid MTT en isopropanol aan volgens de grootte van de putten.
  5. Roer en homogeniseer de inhoud van elk putje, indien nodig, door op en neer te pipetteren totdat er geen kristallen meer te zien zijn.
  6. Kwantificeer de absorptie bij een golflengte van 570 nm met een 620 nm referentiefilter, in de spectrofotometer.
  7. Om de metabole activiteit te berekenen, deelt u de absorptie van de behandelde cellen door de absorptie van de controleculturen. Om percentagewaarden te verkrijgen, vermenigvuldigt u met 100.

5. Evaluatie van celdood

OPMERKING: Om deze evaluatie uit te voeren, moeten minimaal 106 cellen per aandoening worden gebruikt.

  1. Gebruik centrifugebuizen die naar behoren zijn geïdentificeerd, in overeenstemming met de omstandigheden die worden geëvalueerd.
  2. Na de celincubatie met de extracten van de biomaterialen, verzamelt u de kweekmedia naar de betreffende buis.
  3. Maak de cellen los en voeg de celsuspensie toe aan de respectievelijke buizen.
  4. Concentreer de celsuspensies door centrifugeren op 120 x g gedurende 5 minuten.
  5. Was de pellets met PBS. Verwijder de PBS door centrifugeren op 1.000 x g gedurende 5 minuten.
  6. Voeg 1 ml PBS toe en breng de celpellets over naar geïdentificeerde cytometriebuizen.
  7. Verwijder de PBS door centrifugeren op 1.000 x g gedurende 5 minuten.
  8. Incubeer met 100 μL bindingsbuffer (0,01 M HEPES, 0,14 mM NaCl en 0,25 mM CaCl2)16 en laat de cellen ongeveer 15 minuten rusten voor celmembraanherstel.
  9. Voeg 2,5 l fluorescerend gelabeld Annexin-V en 1 μl propidiumjodide toe gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
  10. Voeg na incubatie 400 μL PBS toe en analyseer op de cytometer. Gebruik voor de analyse en kwantificering van de informatie geschikte software.
  11. Presenteer resultaten als een percentage van levende cellen, apoptose, late apoptose / necrose en necrose.

6. Morfologische evaluatie

  1. Selecteer de juiste maat gesteriliseerde glazen afdekplaten die in de multiwell-plaat passen.
  2. Plaats elke dia in een putje met een steriel pincet.
  3. Verdeel een cellulaire suspensie in een voldoende concentratie in de putten en laat een nacht in een incubator bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 95% lucht en 5% CO2.
  4. Stel de celculturen bloot aan de extracten, zoals eerder beschreven.
  5. Zuig de media op en was met PBS.
  6. Laat de afdekstroken drogen bij kamertemperatuur en voeg vervolgens een voldoende volume May-Grünwald-oplossing toe om de afdekstroken af te dekken; Incubeer gedurende 3 minuten.
  7. Verwijder de kleurstof en was met gedestilleerd water gedurende 1 minuut.
  8. Verwijder het water en voeg een voldoende volume Giemsa-oplossing toe om de afdekstroken te bedekken; Incubeer gedurende 15 minuten.
  9. Was de coverslips in stromend water.
  10. Breng de coverslips over op een dia.
  11. Kijk onder een microscoop. Maak de foto's met de gekozen vergroting.

7. Celfunctiebepaling door middel van reverse transcriptie polymerasekettingreactie (RT-PCR)

OPMERKING: Om deze evaluatie uit te voeren, moeten minimaal 2x106 cellen per aandoening worden gebruikt. Als voorbeeld wordt alkalische fosfatase gepresenteerd als een gen van belang voor de evaluatie van de odontoblastenactiviteit. Andere genen van belang zijn te zien in tabel 1.

  1. Plaats de cellen zoals hierboven beschreven.
    OPMERKING: De concentratie van de geplateerde cellen moet mogelijk worden aangepast aan het celtype en de cytotoxiciteit van de biomaterialen die worden bestudeerd.
  2. Incubeer met oplosbare extracten, zoals hierboven beschreven.
  3. Maak de cellen los om een suspensie te verkrijgen zoals eerder beschreven.
  4. Was de cellen twee keer met PBS; voor deze centrifuge op 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Lyseer de cellen door de pellet te suspenseren in 1 ml RNA-zuiveringsoplossing (bijv. NZYol), intensief roeren en opeenvolgend pipetteren.
  6. Incubeer de monsters gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  7. Voeg 200 μL chloroform toe en schud de buisjes 15 seconden met de hand.
  8. Incubeer gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
  9. Centrifugeer lysaten bij 4 °C gedurende 15 minuten bij 12.000 x g. Tijdens deze centrifugatie ontstaan er twee fasen in het monster, waardoor het RNA in de waterige (bovenste) fase achterblijft.
  10. Verwijder de waterige fase naar een nieuwe buis en voeg 500 μL koud isopropanol toe om RNA neer te slaan.
  11. Incubeer monsters bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 12.000 x g bij 4 ° C.
  12. Verwijder het supernatant en was de pellet met 1 ml 75% ethanol door centrifugeren op 7.500 x g gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
  13. Droog de pellet bij kamertemperatuur tot de verdamping van de ethanol.
  14. Suspenderen in RNase-vrij water.
  15. Kwantificeer en bepaal de zuiverheidsgraad van de monsters met behulp van absorptiespectrofotometrie, op de golflengten 260 nm en 280 nm. Bepaal de RNA-zuiverheid en gebruik monsters met een zuiverheidsverhouding (A260/280) rond de 2,0.
  16. Bewaar monsters bij -80 °C.
  17. Ga verder met het uitvoeren van RT-PCR volgens protocol17 van de fabrikant.
    OPMERKING: Selecteer in overeenstemming met het onderzoeksdoel de specifieke markers die moeten worden geëvalueerd.

8. Celfunctiebeoordeling door eiwitidentificatie

OPMERKING: Selecteer volgens het onderzoeksdoel de specifieke eiwitten die moeten worden geëvalueerd. Als voorbeeld wordt dentinesialoproteïne (DSP) gepresenteerd als een eiwit van belang voor de evaluatie van de odontoblastenactiviteit. Andere interessante eiwitten zijn te zien in tabel 1.

  1. Kweek cellen in coverslips en stel ze bloot aan de extracten, zoals eerder beschreven.
  2. Was de celculturen met PBS.
  3. Fixeren met 3,7% paraformaldehyde gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Was twee keer met PBS.
  5. Permeabilize met 0,5% Triton in PBS gedurende 15 minuten.
  6. Blokkeer het peroxidase met 0,3% waterstofperoxide in PBS gedurende 5 minuten.
  7. Was twee keer met PBS.
  8. Was tweemaal met 0,5% runderserumalbumine (BSA).
  9. Blokkeer celculturen met 2% BSA gedurende 45 minuten.
  10. Wassen met 0,5% BSA in PBS.
  11. Incubeer culturen met het primaire antilichaam volgens het geselecteerde eiwit gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van het primaire antilichaam DSP (M20) antilichaam (1:100) en het secundaire antilichaam Polyklonaal Konijn Anti-geit immunoglobulinen / HRP (1:100).
  12. Was vijf keer met 0,5% BSA in PBS.
  13. Incubeer met secundair antilichaam gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Maak de antilichaamverdunningen met 0,5% BSA in PBS.
  14. Was vijf keer met 0,5% BSA in PBS gedurende 1 minuut in elke wasbeurt.
  15. Incubeer culturen met een substraat en chromogeenmengsel in een concentratie van 20 μL chromogeen/ml substraat gedurende 25 minuten.
  16. Was tweemaal met 0,5% BSA in PBS.
  17. Tegenbein met Hematoxyline gedurende 15 minuten.
  18. Was met een reeks van 0,037 mol/L ammoniak en gedestilleerd water gedurende 5 minuten om overtollige kleurstof te verwijderen.
  19. Monteer de coverslips op de dia's. Gebruik glycerol als montagemedium.
  20. Laat een nacht drogen.
  21. Kijk onder een microscoop. Maak de foto's met de gekozen vergroting.

9. Mineralisatie beoordeling door middel van Alizarin Red S assay

  1. Bereid een Alizarin Red S-oplossing in een concentratie van 40 mM18. Roer de oplossing voor homogenisatie gedurende 12 uur in het donker.
    OPMERKING: Om 100 ml Alizarin Red S-oplossing te bereiden, lost u 1,44 g alizarinepoeder (molecuulgewicht: 360 g / mol) op in ultrapuur water, beschermd tegen licht. Voor deze oplossing is de pH-waarde van cruciaal belang en moet deze tussen 4,1 en 4,3 liggen.
  2. Incubeer celcultuur met oplosbare extracten, zoals hierboven beschreven.
  3. Was celculturen drie keer met PBS.
  4. Fixeren met 4% paraformaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Was drie keer met PBS.
  6. Bevlek met Alizarin Red Staining oplossing gedurende 20 minuten bij 37 °C in het donker.
  7. Was na het kleuren de platen met PBS om de overtollige kleurstof te verwijderen.
  8. Kijk onder een microscoop. Maak de foto's met de gekozen vergroting.
  9. Voeg een extractieoplossing, bestaande uit 10% (m/v) azijnzuur en 20% (m/v) methanol, toe aan elk putje en laat 40 minuten roeren bij kamertemperatuur.
  10. Meet de absorptie bij een golflengte van 490 nm op een spectrofotometer19.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De representatieve resultaten hier verwijzen naar de studie van tandheelkundige biomaterialen. De extractmethodologie maakt het mogelijk om een cytotoxiciteitsprofiel en celfunctie te verkrijgen na blootstelling aan de tandheelkundige materialen, met betrekking tot effecten op metabole activiteit (figuur 2), levensvatbaarheid van cellen, celdoodprofiel en celmorfologie (figuur 3) en expressie van specifieke eiwitten (figuur 4).

...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol is ontworpen rekening houdend met de ISO 10993-5, die verwijst naar de evaluatie van in vitro cytotoxiciteit van biomaterialen die in contact komen met de weefsels, om de biocompatibiliteit te evalueren en om bij te dragen aan de reproduceerbaarheid van studies21. Dit is een groeiende zorg in de wetenschap, en veel auteurs volgen deze aanbevelingen al in het experimentele ontwerp van hun in vitro studies 15,22,23,24,25,26,27,28.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Wij danken de volgende voor hun steun: GAI 2013 (Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra); CIBB wordt gefinancierd door nationale fondsen via FCT (Foundation for Science and Technology) via het strategische project UIDB / 04539 / 2020 en UIDP / 04539 / 2020 (CIBB). We danken Jacques Nör, University of Michigan Dental School, voor het leveren van de cellijn MDPC-23.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Absolute ethanolMerck Millipore100983
AccutaseGibcoA1110501StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent
ALDH antibodySanta Cruz BiotechnologySC166362
Annexin V FITCBD Biosciences556547
Antibiotic antimycotic solutionSigmaA5955
BCA assayThermo Scientific23225Pierce BCA Protein Assay Kit
Bovine serum albuminSigmaA9418
CaCl2Sigma10035-04-8
CD133 antibodyMiteny Biotec293C3-APCAllophycocyanin (APC)
CD24 antibodyBD Biosciences658331Allophycocyanin-H7 (APC-H7)
CD44 antibodyBiolegend103020Pacific Blue (PB)
Cell strainerBD Falcon35234040 µM
Collagenase, type IVGibco17104-019
cOmplete MiniRoche118 361 700 0
DAB + ChromogenDakoK3468
DithiothreitolSigma43815
DMEM-F12SigmaD8900
DNAse IRoche11284932001
DSP (M-20) Antibody, 1: 100Santa Cruz BiotechnologyLS-C20939
ECC-1ATCCCRL-2923Human endometrium adenocarcinoma cell line
Epidermal growth factorSigmaE9644
Hepes 0.01 MSigmaMFCD00006158
Fibroblast growth factor basicSigmaF0291
Giemsa Stain, modified GS-500SigmaMFCD00081642
GlycerolDakoC0563
HaemocytometerVWRHERE1080339
HCC1806ATCCCRL-2335Human mammary squamous cell carcinoma cell line
Insulin, transferrin, selenium SolutionGibco41400045
May-Grünwald Stain MG500SigmaMFCD00131580
MCF7ATCCHTB-22Human mammary adenocarcinoma cell line
MethylcelluloseAlfaAesar45490
NaClJMGS37040005002212
Polyclonal Rabbit Anti-goat immunoglobulins / HRP, 1: 100DakoG-21234
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylateSigmaP3932
PutrescineSigmaP7505
RL95-2ATCCCRL-1671Human endometrium carcinoma cell line
Sodium deoxycholic acidJMSEINECS 206-132-7
Sodium dodecyl sulfateSigma436143
Substrate BufferDako926605
TrisJMGS20360000BP152112
Triton-X 100Merck108603
Trypan blueSigmaT8154
Trypsin-EDTASigmaT4049
β-actin antibodySigmaA5316

Referenties

  1. Williams, D. F. On the mechanisms of biocompatibility. Biomaterials. 29 (20), 2941-2953 (2008).
  2. Bruinink, A., Luginbuehl, R. Evaluation of biocompatibility using in vitro methods: interpretation and limitations. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 126, 117-152 (2012).
  3. Wataha, J. C. Principles of biocompatibility for dental practitioners. The Journal of Prosthetic Dentistry. 86 (2), 203-209 (2001).
  4. Mishra, S. F. D. A. CE mark or something else?-Thinking fast and slow. Indian Heart Journal. 69 (1), 1-5 (2016).
  5. Barbeck, M., et al. Balancing Purification and Ultrastructure of Naturally Derived Bone Blocks for Bone Regeneration: Report of the Purification Effort of Two Bone Blocks. Materials. 12 (19), 3234(2019).
  6. Ruzza, P., et al. H-Content Is Not Predictive of Perfluorocarbon Ocular Endotamponade Cytotoxicity in Vitro. ACS Omega. 4 (8), 13481-13487 (2019).
  7. Coelho, C. C., Araújo, R., Quadros, P. A., Sousa, S. R., Monteiro, F. J. Antibacterial bone substitute of hydroxyapatite and magnesium oxide to prevent dental and orthopaedic infections. Materials Science and Engineering: C. 97, 529-538 (2019).
  8. Jung, O., et al. Improved In Vitro Test Procedure for Full Assessment of the Cytocompatibility of Degradable Magnesium Based on ISO 10993-5/-12. International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), 255(2019).
  9. Ruzza, P., et al. H-Content Is Not Predictive of Perfluorocarbon Ocular Endotamponade Cytotoxicity in Vitro. ACS Omega. 4 (8), 13481-13487 (2019).
  10. ISO. I.O. for S. ISO 10993-12:2012 - part 12: Sample preparation and reference materials. ISO. , (2012).
  11. ISO. I.O. for S. ISO 10993-5:2009 Biological evaluation of medical devices - part 5: Tests for in vitro cytotoxicity. ISO. , (2009).
  12. Srivastava, G. K., et al. Comparison between direct contact and extract exposure methods for PFO cytotoxicity evaluation. Scientific Reports. 8 (1), 1425(2018).
  13. Pusnik, M., Imeri, M., Deppierraz, G., Bruinink, A., Zinn, M. The agar diffusion scratch assay--A novel method to assess the bioactive and cytotoxic potential of new materials and compounds. Scientific Reports. 6, 20854(2016).
  14. Spiller, K. L., et al. The role of macrophage phenotype in vascularization of tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 35 (15), 4477-4488 (2014).
  15. Zhou, H., et al. In Vitro Cytotoxicity Evaluation of a Novel Root Repair Material. Journal of Endodontics. 39 (4), 478-483 (2013).
  16. Bordron, A., et al. The binding of some human antiendothelial cell antibodies induces endothelial cell apoptosis. Journal of Clinical Investigation. 101 (10), 2029-2035 (1998).
  17. Palmini, G., et al. Establishment of Cancer Stem Cell Cultures from Human Conventional Osteosarcoma. Journal of Visualized Experiments. (116), e53884(2016).
  18. Gregory, C. A., Grady Gunn, W., Peister, A., Prockop, D. J. An Alizarin red-based assay of mineralization by adherent cells in culture: comparison with cetylpyridinium chloride extraction. Analytical Biochemistry. 329 (1), 77-84 (2004).
  19. Cai, S., Zhang, W., Chen, W. PDGFRβ+/c-kit+ pulp cells are odontoblastic progenitors capable of producing dentin-like structure in vitro and in vivo. BMC Oral Health. 16 (1), 113(2016).
  20. Paula, A., et al. Biodentine Boosts, WhiteProRoot MTA Increases and Life Suppresses Odontoblast Activity. Materials. 12 (7), 1184(2019).
  21. Chander, N. G. Standardization of in vitro studies. Journal of Indian Prosthodontic Society. 16 (3), 227-228 (2016).
  22. Cavalcanti, B. N., Rode de M, S., França, C. M., Marques, M. M. Pulp capping materials exert an effect on the secretion of IL-1β and IL-8 by migrating human neutrophils. Brazilian Oral Research. 25 (1), 13-18 (2011).
  23. Chang, S., Lee, S. Y., Ann, H. J., Kum, K. Y., Kim, E. C. Effects of calcium silicate endodontic cements on biocompatibility and mineralization-inducing potentials in human dental pulp cells. Journal of Endodontics. 40 (8), 1194-1200 (2014).
  24. Daltoé, M. O., Paula-Silva, F. W. G., Faccioli, L. H., Gatón-Hernández, P. M., De Rossi, A., Bezerra Silva, L. A. Expression of Mineralization Markers during Pulp Response to Biodentine and Mineral Trioxide Aggregate. Journal of Endodontics. 42 (4), 596-603 (2016).
  25. Elias, R. V., Demarco, F. F., Tarquinio, S. B. C., Piva, E. Pulp responses to the application of a self-etching adhesive in human pulps after controlling bleeding with sodium hypochlorite. Quintessence International. 38 (2), 67-77 (2007).
  26. Huang, G. T. J., Shagramanova, K., Chan, S. W. Formation of odontoblast-like cells from cultured human dental pulp cells on dentin in vitro. Journal of endodontics. 32 (11), 1066-1073 (2006).
  27. Jafarnia, B., et al. Evaluation of cytotoxicity of MTA employing various additives. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontology. 107 (5), 739-744 (2009).
  28. Paranjpe, A., Smoot, T., Zhang, H., Johnson, J. D. Direct contact with mineral trioxide aggregate activates and differentiates human dental pulp cells. Journal of Endodontics. 37 (12), 1691-1695 (2011).
  29. Spagnuolo, G., et al. In vitro cellular detoxification of triethylene glycol dimethacrylate by adduct formation with N-acetylcysteine. Dental Materials. 29 (8), 153-160 (2013).
  30. Murray, P. E., García Godoy, C., García Godoy C, F. How is the biocompatibilty of dental biomaterials evaluated. Medicina Oral, Patologia Oral y Cirugia Bucal. 12 (3), 258-266 (2007).
  31. Hanks, C. T., Wataha, J. C., Sun, Z. In vitro models of biocompatibility: a review. Dental Materials. 12 (3), 186-193 (1996).
  32. Eid, A. A., et al. In Vitro Biocompatibility and Oxidative Stress Profiles of Different Hydraulic Calcium Silicate Cements. Journal of Endodontics. 40 (2), 255-260 (2014).
  33. Nocca, G., et al. Effects of ethanol and dimethyl sulfoxide on solubility and cytotoxicity of the resin monomer triethylene glycol dimethacrylate. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 100 (6), 1500-1506 (2012).
  34. Abuarqoub, D., Aslam, N., Jafar, H., Abu Harfil, Z., Awidi, A. Biocompatibility of Biodentine with Periodontal Ligament Stem Cells: In Vitro Study. Dentistry Journal. 8 (1), 17(2020).
  35. Coelho, A. S., et al. Cytotoxic effects of a chlorhexidine mouthwash and of an enzymatic mouthwash on human gingival fibroblasts. Odontology. 108 (2), 260-270 (2020).
  36. Wang, M. O., et al. Evaluation of the In Vitro Cytotoxicity of Cross-Linked Biomaterials. Biomacromolecules. 14 (5), 1321-1329 (2013).
  37. Tyliszczak, B., Drabczyk, A., Kudłacik-Kramarczyk, S., Bialik-Wąs, K., Sobczak-Kupiec, A. In vitro cytotoxicity of hydrogels based on chitosan and modified with gold nanoparticles. Journal of Polymer Research. 24 (10), 153(2017).
  38. Widbiller, M., et al. Three-dimensional culture of dental pulp stem cells in direct contact to tricalcium silicate cements. Clinical Oral Investigations. 20 (2), 237-246 (2016).
  39. Pintor, A. V. B., et al. In Vitro and In Vivo Biocompatibility of ReOss in Powder and Putty Configurations. Brazilian Dental Journal. 29 (2), 117-127 (2018).
  40. Pellissari, C. V. G., et al. In Vitro Toxic Effect of Biomaterials Coated with Silver Tungstate or Silver Molybdate Microcrystals. Journal of Nanomaterials. 2020, 1-9 (2020).
  41. Collado-González, M., et al. Cytotoxicity and bioactivity of various pulpotomy materials on stem cells from human exfoliated primary teeth. International Endodontic Journal. 50, 19-30 (2017).
  42. Paula, A., et al. Direct Pulp Capping: Which is the Most Effective Biomaterial? A Retrospective Clinical Study. Materials. 12 (20), 3382(2019).
  43. Williams, D. F. There is no such thing as a biocompatible material. Biomaterials. 35 (38), 10009-10014 (2014).
  44. Schuh, J. C. L. Medical device regulations and testing for toxicologic pathologists. Toxicologic Pathology. 36 (1), 63-69 (2008).
  45. Pizzoferrato, A., et al. Cell culture methods for testing Biocompatibility. Clinical Materials. 15 (3), (1994).
  46. Pereira Paula, A. B., et al. Direct pulp capping: what is the most effective therapy? - review and meta-analysis. Journal of Evidence Based Dental Practice. , (2018).
  47. Caiaffa, K. S., et al. Effect of analogues of cationic peptides on dentin mineralization markers in odontoblast-like cells. Archives of Oral Biology. 103, 19-25 (2019).
  48. Fujiwara, S., Kumabe, S., Iwai, Y. Isolated rat dental pulp cell culture and transplantation with an alginate scaffold. Okajimas Folia Anatomica Japonica. 83 (1), 15-24 (2006).
  49. Nakashima, M., et al. Stimulation of Reparative Dentin Formation by Ex Vivo Gene Therapy Using Dental Pulp Stem Cells Electrotransfected with Growth/differentiation factor 11 (Gdf11). Human Gene Therapy. 15 (11), 1045-1053 (2004).
  50. Narayanan, K., et al. Differentiation of embryonic mesenchymal cells to odontoblast-like cells by overexpression of dentin matrix protein 1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4516-4521 (2001).
  51. Kim, H. J., Yoo, J. H., Choi, Y., Joo, J. Y., Lee, J. Y., Kim, H. J. Assessing the effects of cyclosporine A on the osteoblastogenesis, osteoclastogenesis, and angiogenesis mediated by the human periodontal ligament stem cells. Journal of Periodontology. , (2019).
  52. Bou Assaf, R., et al. Healing of Bone Defects in Pig's Femur Using Mesenchymal Cells Originated from the Sinus Membrane with Different Scaffolds. Stem Cells International. , (2019).
  53. He, W., et al. Lipopolysaccharide enhances decorin expression through the toll-like receptor 4, myeloid differentiating factor 88, nuclear factor-kappa B, and mitogen-activated protein kinase pathways in odontoblast cells. Journal of Endodontics. 38 (4), 464-469 (2012).
  54. Xiong, Y., et al. Wnt Production in Dental Epithelium Is Crucial for Tooth Differentiation. Journal of Dental Research. 98 (5), 580-588 (2019).
  55. Haruyama, N., et al. Genetic evidence for key roles of decorin and biglycan in dentin mineralization. Matrix Biology. 28 (3), 129-136 (2009).
  56. Sreenath, T., et al. Dentin Sialophosphoprotein Knockout Mouse Teeth Display Widened Predentin Zone and Develop Defective Dentin Mineralization Similar to Human Dentinogenesis Imperfecta Type III. Journal of Biological Chemistry. 278 (27), 24874-24880 (2003).
  57. Yang, Y., Zhao, Y., Liu, X., Chen, Y., Liu, P., Zhao, L. Effect of SOX2 on odontoblast differentiation of dental pulp stem cells. Molecular Medicine Reports. 16 (6), 9659-9663 (2017).
  58. Tao, H., et al. Klf4 Promotes Dentinogenesis and Odontoblastic Differentiation via Modulation of TGF-β Signaling Pathway and Interaction With Histone Acetylation. Journal of Bone and Mineral Research. 34 (8), 1502-1516 (2019).
  59. Massa, L. F., Ramachandran, A., George, A., Arana-Chavez, V. E. Developmental appearance of dentin matrix protein 1 during the early dentinogenesis in rat molars as identified by high-resolution immunocytochemistry. Histochemistry and Cell Biology. 124 (3-4), 197-205 (2005).
  60. Hao, J., Zou, B., Narayanan, K., George, A. Differential expression patterns of the dentin matrix proteins during mineralized tissue formation. Bone. 34 (6), 921-932 (2004).
  61. Tompkins, K., Alvares, K., George, A., Veis, A. Two related low molecular mass polypeptide isoforms of amelogenin have distinct activities in mouse tooth germ differentiation in vitro. Journal of Bone and Mineral Research. 20 (2), 341-349 (2005).
  62. Zhai, Y., et al. Activation and Biological Properties of Human β Defensin 4 in Stem Cells Derived From Human Exfoliated Deciduous Teeth. Frontiers in Physiology. 10, (2019).
  63. Bègue-Kirn, C., Ruch, J. V., Ridall, A. L., Butler, W. T. Comparative analysis of mouse DSP and DPP expression in odontoblasts, preameloblasts, and experimentally induced odontoblast-like cells. European Journal of Oral Sciences. 106, 254-259 (1998).
  64. Kikuchi, H., Suzuki, K., Sakai, N., Yamada, S. Odontoblasts induced from mesenchymal cells of murine dental papillae in three-dimensional cell culture. Cell and Tissue Research. 317 (2), 173-185 (2004).
  65. Li, X., Yang, G., Fan, M. Effects of homeobox gene distal-less 3 on proliferation and odontoblastic differentiation of human dental pulp cells. Journal of Endodontics. 38 (11), 1504-1510 (2012).
  66. Chen, S., et al. Differential regulation of dentin sialophosphoprotein expression by Runx2 during odontoblast cytodifferentiation. Journal of Biological Chemistry. 280 (33), 29717-29727 (2005).
  67. Narayanan, K., Gajjeraman, S., Ramachandran, A., Hao, J., George, A. Dentin matrix protein 1 regulates dentin sialophosphoprotein gene transcription during early odontoblast differentiation. Journal of Biological Chemistry. 281 (28), 19064-19071 (2006).
  68. Buchaille, R., Couble, M. L., Magloire, H., Bleicher, F. A substractive PCR-based cDNA library from human odontoblast cells: identification of novel genes expressed in tooth forming cells. Matrix Biology. 19 (5), 421-430 (2000).
  69. Miyazaki, T., Baba, T., Mori, T., Komori, T. Collapsin Response Mediator Protein 1, a Novel Marker Protein for Differentiated Odontoblasts. Acta Histochemica et Cytochemica. 51 (6), 185-190 (2018).
  70. Yokoi, M., Kuremoto, K., Okada, S., Sasaki, M., Tsuga, K. Effect of attenuation of fibroblast growth factor receptor 2b signaling on odontoblast differentiation and dentin formation. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Animal. 55 (3), 211-219 (2019).
  71. Tohma, A., et al. Glucose Transporter 2 and 4 Are Involved in Glucose Supply during Pulpal Wound Healing after Pulpotomy with Mineral Trioxide Aggregate in Rat Molars. Journal of Endodontics. , (2019).
  72. Sueyama, Y., Kaneko, T., Ito, T., Kaneko, R., Okiji, T. Implantation of Endothelial Cells with Mesenchymal Stem Cells Accelerates Dental Pulp Tissue Regeneration/Healing in Pulpotomized Rat Molars. Journal of Endodontics. 43 (6), 943-948 (2017).
  73. Petersson, U., Hultenby, K., Wendel, M. Identification, distribution and expression of osteoadherin during tooth formation. European Journal of Oral Sciences. 111 (2), 128-136 (2003).
  74. Couble, M. L., et al. Immunodetection of osteoadherin in murine tooth extracellular matrices. Histochemistry and Cell Biology. 121 (1), 47-53 (2004).
  75. Buchaille, R., Couble, M. L., Magloire, H., Bleicher, F. Expression of the small leucine-rich proteoglycan osteoadherin/osteomodulin in human dental pulp and developing rat teeth. Bone. 27 (2), 265-270 (2000).
  76. Salmon, B., et al. Abnormal osteopontin and matrix extracellular phosphoglycoprotein localization, and odontoblast differentiation, in X-linked hypophosphatemic teeth. Connective Tissue Research. 55, SUPPL. 1 79-82 (2014).
  77. Liao, C., Ou, Y., Wu, Y., Zhou, Y., Liang, S., Wang, Y. Sclerostin inhibits odontogenic differentiation of human pulp-derived odontoblast-like cells under mechanical stress. Journal of Cellular Physiology. 234 (11), 20779-20789 (2019).
  78. Deng, X., et al. The combined effect of oleonuezhenide and wedelolactone on proliferation and osteoblastogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells. Phytomedicine. 153103, (2019).
  79. Choi, H., Kim, T. H., Yun, C. Y., Kim, J. W., Cho, E. S. Testicular acid phosphatase induces odontoblast differentiation and mineralization. Cell and Tissue Research. 364 (1), 95-103 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Cytotoxiciteit van biomaterialenMTT-assaysulforhodamine B-assayflowcytometrieMay-Grünwald GiemsaimmunocytochemiePCR-analysealizarineroodkleuringcelmorfologieeiwitexpressie
Toegang tot de cytotoxiciteit en celrespons op biomaterialen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.