Het verkrijgen van primaire osteocyten door murine calvariale fractionering van GFP-tot expressie brengende osteocyten

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de dissectie van neonatale dmp1-topaas muizen calvaria en isolatie van osteocyten die het groene fluorescerende eiwit tot expressie brengen door celvertering en fractionering, naast osteocytenpreparaat voor fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS).

Samenvatting

De osteocyt, waarvan ooit werd gedacht dat hij een passieve bewoner van het bot was gezien de backstage-functie van het detecteren van mechanische belasting, wordt nu onder de aandacht gebracht en er is aangetoond dat hij meerdere belangrijke functies heeft, zoals het actief wijzigen van de extracellulaire matrix en het vormen van een endocriene orgaan met het lacunocanaliculaire systeem dat het omsluit en berichten naar verre locaties verzendt. Dankzij de methoden die het mogelijk maakten om de osteocyt in vitro te testen van het isoleren van primaire osteocyten tot osteocytachtige cellijnen, ervaren osteocyten nu een klinkende interesse en een golf van kennis over structuur en functie. Veel aspecten van de osteocytenbiologie en de interactie met andere moleculaire componenten moeten nog worden ontdekt. In dit protocol beschrijven we in detail de efficiënte isolatie van primaire osteocyten uit dmp1-topaas neonatale muis calvaria, die het groene fluorescerende eiwit in osteocyten tot expressie brengen, door celfractionering en vervolgens het verwerven van culturen van primaire osteocyten door FACS.

Inleiding

Osteocyten zijn terminaal gedifferentieerde cellen van osteoblastische voorlopers die ingebed raakten in hun uitgescheiden matrix¹. Ze zijn de meest voorkomende en langstlevende cellen onder botcelpopulaties. Ze bevinden zich in lacunes en hebben een karakteristieke stellaatmorfologie met dendrieten die zich uitstrekken door kanalen die canaliculi worden genoemd en een uitgebreid netwerk van communicatie en metabole uitwisseling vormen met hun omgeving en het botoppervlak². Osteocyten choreograferen zowel osteoblasten als osteoclasten rollen in botremodellering, ze zijn de primaire mechanosensorische cellen die aanpassing verlenen aan mechanische belasting³, zijn betrokken bij fosfaathomeostase⁴ en botmatrixmineralisatie⁵, en samen met het lacunocanaliculaire systeem fungeren ze als een endocriene orgaan dat verre weefsels^{signaleert 6}.

Osteocyten bevinden zich in een gemineraliseerde matrix, wat de toegankelijkheid beperkt en hun isolatie uitdagend maakt, waardoor in vitro onderzoek wordt belemmerd. Een van de eerste isolatiemethoden beschreef geïsoleerde osteocyten uit kippen calvaria met behulp van een osteocytspecifiek monoklonaal antilichaam (OB7.3)⁷ waarvan later bekend werd dat het de aviaire variant van PHEX (PHosfaatregulerend gen met homologie aan Endopeptidases op het X-chromosoom)⁸ was. Andere onderzoekers gebruikten sequentiële vertering van rat 9 of muis 10 lange botten om osteocytrijke fracties te verkrijgen waarin de zuiverheid van osteocyten ongeveer⁷⁰% ⁹ was. Beperkingen van deze procedure zijn onder meer de suboptimale zuiverheid van culturen die besmet zijn met andere celtypen dan osteocyten en dat osteocyten mogelijk kunnen worden overwoekerd door andere cellen in cultuur, omdat osteocyten het vermogen om te delen hebben verloren. Deze uitdagingen beperken de bruikbaarheid van langetermijnculturen.

Om deze beperkingen te overwinnen, werden verschillende osteocytencellijnen ontwikkeld. De MLO-Y4-cellijn¹¹ en de MLO-A5-cellijn¹² zijn met name de meest bestudeerde cellijnen die nuttig zijn voor de studie van de osteocyten in een vroeg stadium; ze zijn echter minder nuttig voor het bestuderen van volwassen osteocytensignalering omdat ze lage niveaus van sclerostine en FGF23¹³ uitdrukken, die beide volwassen osteocytenmarkers zijn. Andere cellijnen, waaronder IDG-SW3 14 en Ocy454¹⁵, drukken hoge niveaus van sclerostine en FGF23 uit en zijn nuttig bij het bestuderen van het late osteocytenstadium. Cellijnen blijken nuttige onderzoeksinstrumenten te zijn; Niettemin komen ze niet zonder beperkingen omdat ze de biologie van de primaire cel niet volledig vertegenwoordigen. Verschillende cellijnen vertegenwoordigen verschillende ontwikkelingsstadia van het rijpheidsspectrum van osteocyten en cellijnen vertegenwoordigen niet de heterogeniteit van primaire osteocyten^16,17.

Om zuivere culturen van primaire osteocyten te verkrijgen, maakten onderzoekers gebruik van het cre-muismodel waarin de 8-kb dmp1-promotor wordt gebruikt om groene fluorescerende eiwit (GFP) expressie in osteocyten^18,19 aan te sturen. Dubbele transgene muizen (pOB-Col 2.3- GFP-cyaan en DMP1-GFP-topaas) van Paic et ^al.19 en dmp1-topaas transgene muizen van Nakashima et ^al.20 zijn gebruikt om osteocytenpopulaties te verkrijgen. Waarin ze sequentiële vertering en FACS van osteocyten gebruikten die GFP tot expressie brachten om culturen van primaire osteocyten te verkrijgen^19,20. De richting van cre in de 10-kb dmp1 reportermuis Ai9, die het tdTomato-eiwit activeert, bleek aanwezig te zijn in osteocyten, osteoblasten, spieren en cellen in het beenmerg. De 8-kb dmp1-promotor had hetzelfde expressiepatroon, maar slechts een deel van de osteoblasten en beenmergcellen drukte het eiwit uit, wat aangeeft dat de 8-kb dmp1-promotor specifieker is²¹. Desondanks moeten resultaten verkregen met behulp van de 8-kb dmp1-promotor met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd en moeten genexpressieprofielen routinematig worden uitgevoerd met behulp van osteocyten versus osteoblastspecifieke markers om ervoor te zorgen dat de verkregen populatie van voldoende zuiverheid is.

Osteoclastmarkers OSCAR en Dcstamp werden gevonden in hematopoëtische niet-uitgeputte versus uitgeputte osteocytenpopulaties, deze bevinding leidde de auteurs tot de conclusie dat digesten verkregen uit fractionering van 8-kb dmp1-topaas neonatale calvaria en GFP-sortering besmet zijn met hematopoëtische cellen. Besmetting met hematopoëtische cellen had kunnen worden verzacht door de GFP-sorteerpoort aan te scherpen, aangezien GFP-positieve hematopoëtische cellen een redelijk lagere GFP-intensiteit hadden dan GFP-positieve mesenchymale cellen (osteocyten)²².

De methoden voor het bestuderen van osteocyten in vitro hebben bijgedragen aan de recente schat aan informatie over osteocytenbiologie. Osteocytenisolatie blijft echter een arbeidsintensieve en langdurige procedure met lage celopbrengsten. De beschreven methode van botvertering met behulp van collagenase en EDTA, vaak tot fractie 8²³, duurt enkele uren waarin de levensvatbaarheid van osteocyten wordt belast. Onderzoekers hebben gerapporteerd dat ze fracties (2-0125) hebben gebruikt voor celsortering 20, en hebben aangetoond dat het expressieprofiel van genen geassocieerd met osteocyten versus die van osteoblasten het succes van het isoleren van pure osteocytenpopulaties^{bevestigt 20}. In dit artikel beschrijven we het proces van het verkrijgen van breuken (2-0125) en vergelijken we de opbrengst van osteocyten van elke fractie beginnend met fractie 1 tot en met 8 om de terugkeer van osteocyten in elke fractie te bepalen. We beschrijven ook de dissectie van pasgeboren dmp1-topaas muis calvaria en calvariale spijsvertering met behulp van collagenase en ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), evenals de bereiding van cellen voor FACS.

Protocol

Alle dierprocedures en dierverzorging werden uitgevoerd in overeenstemming met de regels en voorschriften van de Tohoku University.

1. Dissectie van pasgeboren dmp1-topaas muis calvaria

1. Gebruik voor dit protocol 6\u20127 eendagsjongen van C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J muizen. Euthanaseer muizen met 5% isofluraaninhalatie en breng de pups vervolgens over in 70% ethanol.
2. Breng de geëuthanaseerde pup over in een niet-behandelde kweekschaal.
3. Gebruik een schaar en een pincet om de huid aan de basis van de schedel vast te pakken en maak een incisie.
4. Gebruik de eerste incisie als uitgangspunt, snijd aan beide zijden van de schedel voor de oren, verwijder de huid en leg de calvaria bloot.
5. Houd het hoofd van de neusbrug en snijd de calvaria langs de lambdoïde hechtdraad. Snijd langs de laterale randen van de pariëtale botten en breid deze uit naar het voorste deel.
6. Scheid de calvaria van het onderliggende hersenweefsel.
   OPMERKING: Om een schone benige calvaria met minimale aanhechting van zacht weefsel te garanderen, snijd niet diep in het bot; Ter referentie moet men de schaduw van de schaar onder het bot kunnen zien.
7. Breng de calvaria over in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4 gedurende het hele protocol). Zorg ervoor dat het holle deel naar boven is gericht.

2. Fractionering van de calvaria van pasgeboren muizen

1. Breng tot 5 calvariae over in een conische buis van 50 ml met 5 ml collagenaseoplossing van 2 mg/ml. Gebruik verse collagenase-oplossing die vlak voor gebruik is bereid.
   1. Om een verse collagenase-oplossing te bereiden, voegt u collagenasepoeder toe aan de isolatiebuffer (70 mM NaCl, 10 mM NaHCO 3, 60 mM sorbitol,₃ mM_K2 HPO₄, 1 mM CaCl 2, 1 mg / ml runderserumalbumine (BSA), 5 mg / ml glucose en 25 mM HEPES) bij₂ mg / ml. Los het collagenasepoeder op een magneetroerder op.
   2. Laat de collagenase-oplossing door een steriele filtereenheid van 0,22 μm in een buis van 50 ml lopen en houd deze gedurende het hele protocol op ijs.
2. Incubeer de calvaria bij 37 °C gedurende 20 minuten op een schudder bij 300 tpm om fractie 1 te verkrijgen.
3. Gooi de vertering van fractie 1 weg, was de calvaria met 5 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en gooi de was weg.
4. Incubeer de calvaria in 5 ml 5 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) met 1 mg/ml BSA in PBS, PH 7,4 bij 37 °C gedurende 15 minuten op een shaker bij 300 tpm.
5. Verzamel de digest in een conische buis van 50 ml. Was de calvaria met 5 ml PBS en voeg de wasoplossing toe aan de digest.
   OPMERKING: Op elk punt van het verzamelen van de vertering en het wassen, pipetteer de botten in hun oplossing om de cellen los te maken van het bot en om doubletten en celaggregaten te voorkomen.
6. Om fractie 2 te verkrijgen, centrifugeert u de digest bij 300 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten. Gooi het supernatant weg, suspensie de pellet opnieuw in 8 ml α-Minimum Essential Medium (MEM) met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 IE / ml penicilline G en 100 μg / ml streptomycine. Zaad op een kweekschaal van 10 cm. Incubeer fractie 2 bij 37 °C onder 5% CO₂.
7. Incubeer de calvaria in 5 ml collagenase-oplossing bij 37 °C gedurende 20 minuten op een shaker bij 300 tpm.
8. Als u breuk 3 wilt verzamelen, herhaalt u stap 2.5\u20122.6. Incubeer fractie 3 bij 37 °C onder 5% CO₂.
   OPMERKING: Op dit punt zullen de botten kleiner worden en zullen ze worden gereduceerd tot fragmenten. Om ervoor te zorgen dat er geen botten per ongeluk in de digesten terechtkomen, wat leidt tot celverlies tijdens het proces, gebruikt u een kleine tippipet voor het verzamelen van de digesten (1000-12200 μL pipetpunten).
9. Incubeer de calvaria in 5 ml collagenase-oplossing bij 37 °C gedurende 20 minuten op een shaker bij 300 tpm.
10. Als u breuk 4 wilt verzamelen, herhaalt u stap 2.5\u20122.6. Incubeer fractie 4 bij 37 °C onder 5% CO₂.
11. Incubeer de calvaria in 5 ml 5 mM EDTA met 1 mg/ml BSA in PBS (pH 7,4) bij 37 °C gedurende 15 minuten op een shaker bij 300 tpm.
12. Als u breuk 5 wilt verzamelen, herhaalt u stap 2.5\u20122.6. Incubeer fractie 5 bij 37 °C onder 5% CO₂. Osteocyten kunnen op dezelfde dag worden bereid om te sorteren of tot 24 uur voor het sorteren worden gekweekt.

3. Bereiding van osteocyten voor fluorescentie geactiveerde celsortering

1. Zuig het medium van elke celfractie op en was zachtjes met 10 ml PBS tweemaal.
2. Voeg 5 ml 0,5% trypsine-EDTA toe in PBS en incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij 37 °C. Voeg 5 ml 10% FBS α-MEM en pipet toe om de cellen voorzichtig los te maken. Combineer de cellen in elke fractie door een celzeef van 40 μm in een conische centrifugebuis van 50 ml te zeven.
3. Was de cellen met 10 ml PBS en verzamel door een celzeef van 40 μm in een conische centrifugebuis van 50 ml te zeven. Centrifugeer de cellen op 300 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten.
4. Zuig het supernatant aan en voeg 10% FBS α-MEM toe aan de pellet. Pas de celconcentratie aan op ongeveer 1 x 10⁷ cellen/ml.
5. Filter de cellen in een 35 μm nylon mesh afgedekte buis. De cellen zijn nu klaar voor FACS.
6. Gebruik voor dit protocol een mondstuk van 100 μm. De opvangvloeistof moet bestaan uit 10% FBS α-MEM. Houd het monster gesorteerd op roeren en op 4 °C in de gehele sortering, indien mogelijk.
7. Voorafgaand aan de sortering optimaliseert u gating om artefacten en cellen te verwijderen door het gebied side scatter (SSC) en forward scatter (FSC) aan te passen. Elimineer doubletten door SSC-breedte versus SSC-hoogte en FSC-gebied versus FSC-breedte aan te passen. GFP-negatieve osteocyten moeten worden gebruikt als een controle om de parameters van het sorteerinstrument aan te passen.
8. Nadat de celverzameling is voltooid, centrifugeert u de cellen gedurende 10 minuten bij 300 x g bij 4 °C. Was cellen met PBS. Centrifugeer de cellen op 300 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten.
9. Suspenseer de cellen opnieuw en pas het aantal naar wens aan met 10% FBS α-MEM.

Resultaten

Het doel van dit protocol is om het proces aan te tonen van het verkrijgen van culturen van primaire osteocyten uit dmp1-topaas neonatale muis calvaria door middel van een fractioneringsproces met behulp van collagenase om de collageenmatrix en EDTA voor calciumchelatie af te breken, waarna cellen worden voorbereid op FACS om osteocyten van andere celpopulaties te scheiden.

Methoden voor het verkrijgen van primaire osteocyten uit neonatale muis calvaria beschrijven vaak het gebruik van fractie...

Discussie

De eerste geïsoleerde osteocyt was van een kippencalvaria⁷ geïsoleerd met behulp van (OB7.3) of de aviantvariant van PHEX; Deze methode wordt echter beperkt door de beschikbaarheid van werkbare antilichamen, omdat osteocytspecifieke antilichamen die ook soortspecifiek zijn, moeten worden vervaardigd. Onderzoekers gebruikten een andere modificatie van het sequentiële enzymatische proces om osteocyten te verkrijgen uit lange botten van muizen en ratten; De gerapporteerde zuiverheid van deze culturen...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
BD FACSDiva software	BD Biosciences		Gegevensverwerving en analyse
BD Falcon Tube	BD Biosciences	352235	12 x 75 mm buis met celstrainerdop, 35 μm nylon gaas.
Bovine serum albumine (BSA)	Sigma-Aldrich, MO, USA
Collagenase	Wako, Osaka, Japan	034-22363	0,2% (w/v), ruwe collagenasemix afkomstig van C. histolyticum.
EDTA	Dojindo, Kumamoto, Japan		5mM EDTA bereid met 0,1% BSA
FACSAriaTM II	BD Biosciences
Fetaal bovien serum (FBS)	Biowest, Nuaillé, Frankrijk
Isolatiekoppeling			70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0,1% (w/v) BSA, 0,5% (w/v) glucose en 25 mM HEPES
Millex steriele filtereenheid	Merck Millipore, Ierland	SLGV033RS	0,22μm
Nylon celstrainer	FALCON, NY, USA		40μm
Trypsine-EDTA	Life Technologies, NY, USA		0,5% x10. verdund tot x1 in PBS
α-MEM	Wako, Osaka, Japan		Bevat 10% fetaal bovien serum, 100 IE/ml penicilline G en 100 μg/ml streptomycine