Dit protocol beschrijft de dissectie van neonatale dmp1-topaas muizen calvaria en isolatie van osteocyten die het groene fluorescerende eiwit tot expressie brengen door celvertering en fractionering, naast osteocytenpreparaat voor fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS).
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het verkrijgen van primaire osteocyten door murine calvariale fractionering van GFP-tot expressie brengende osteocyten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De osteocyt, waarvan ooit werd gedacht dat hij een passieve bewoner van het bot was gezien de backstage-functie van het detecteren van mechanische belasting, wordt nu onder de aandacht gebracht en er is aangetoond dat hij meerdere belangrijke functies heeft, zoals het actief wijzigen van de extracellulaire matrix en het vormen van een endocriene orgaan met het lacunocanaliculaire systeem dat het omsluit en berichten naar verre locaties verzendt. Dankzij de methoden die het mogelijk maakten om de osteocyt in vitro te testen van het isoleren van primaire osteocyten tot osteocytachtige cellijnen, ervaren osteocyten nu een klinkende interesse en een golf van kennis over structuur en functie. Veel aspecten van de osteocytenbiologie en de interactie met andere moleculaire componenten moeten nog worden ontdekt. In dit protocol beschrijven we in detail de efficiënte isolatie van primaire osteocyten uit dmp1-topaas neonatale muis calvaria, die het groene fluorescerende eiwit in osteocyten tot expressie brengen, door celfractionering en vervolgens het verwerven van culturen van primaire osteocyten door FACS.
Inleiding
Osteocyten zijn terminaal gedifferentieerde cellen van osteoblastische voorlopers die ingebed raakten in hun uitgescheiden matrix1. Ze zijn de meest voorkomende en langstlevende cellen onder botcelpopulaties. Ze bevinden zich in lacunes en hebben een karakteristieke stellaatmorfologie met dendrieten die zich uitstrekken door kanalen die canaliculi worden genoemd en een uitgebreid netwerk van communicatie en metabole uitwisseling vormen met hun omgeving en het botoppervlak2. Osteocyten choreograferen zowel osteoblasten als osteoclasten rollen in botremodellering, ze zijn de primaire mechanosensorische cellen die aanpassin....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierprocedures en dierverzorging werden uitgevoerd in overeenstemming met de regels en voorschriften van de Tohoku University.
1. Dissectie van pasgeboren dmp1-topaas muis calvaria
- Gebruik voor dit protocol 6\u20127 eendagsjongen van C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J muizen. Euthanaseer muizen met 5% isofluraaninhalatie en breng de pups vervolgens over in 70% ethanol.
- Breng de geëuthanaseerde pup over in een niet-behandelde kweekschaal.
- Gebruik een schaar en een pincet om de huid aan de basis van de schedel vast te pakken en maak een incisie.
- Gebruik de eerste incisie als uitgangspunt, snijd aan beid....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het doel van dit protocol is om het proces aan te tonen van het verkrijgen van culturen van primaire osteocyten uit dmp1-topaas neonatale muis calvaria door middel van een fractioneringsproces met behulp van collagenase om de collageenmatrix en EDTA voor calciumchelatie af te breken, waarna cellen worden voorbereid op FACS om osteocyten van andere celpopulaties te scheiden.
Methoden voor het verkrijgen van primaire osteocyten uit neonatale muis calvaria beschrijven vaak het gebruik van fractie.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De eerste geïsoleerde osteocyt was van een kippencalvaria7 geïsoleerd met behulp van (OB7.3) of de aviantvariant van PHEX; Deze methode wordt echter beperkt door de beschikbaarheid van werkbare antilichamen, omdat osteocytspecifieke antilichamen die ook soortspecifiek zijn, moeten worden vervaardigd. Onderzoekers gebruikten een andere modificatie van het sequentiële enzymatische proces om osteocyten te verkrijgen uit lange botten van muizen en ratten; De gerapporteerde zuiverheid van deze culturen.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een JSPS KAKENHI-beurs van de Japan Society for the Promotion of Science (nr. 19K10397 tot H.K. en nr. 18K09862 tot I.M.).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| BD FACSDiva software | BD Biosciences | Gegevensverwerving en analyse | |
| BD Falcon Tube | BD Biosciences | 352235 | 12 x 75 mm buis met celstrainerdop, 35 μm nylon gaas. |
| Bovine serum albumine (BSA) | Sigma-Aldrich, MO, USA | ||
| Collagenase | Wako, Osaka, Japan | 034-22363 | 0,2% (w/v), ruwe collagenasemix afkomstig van C. histolyticum. |
| EDTA | Dojindo, Kumamoto, Japan | 5mM EDTA bereid met 0,1% BSA | |
| FACSAriaTM II | BD Biosciences | ||
| Fetaal bovien serum (FBS) | Biowest, Nuaillé, Frankrijk | ||
| Isolatiekoppeling | 70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0,1% (w/v) BSA, 0,5% (w/v) glucose en 25 mM HEPES | ||
| Millex steriele filtereenheid | Merck Millipore, Ierland | SLGV033RS | 0,22μm |
| Nylon celstrainer | FALCON, NY, USA | 40μm | |
| Trypsine-EDTA | Life Technologies, NY, USA | 0,5% x10. verdund tot x1 in PBS | |
| α-MEM | Wako, Osaka, Japan | Bevat 10% fetaal bovien serum, 100 IE/ml penicilline G en 100 μg/ml streptomycine |
Referenties
- Manolagas, S. C. Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis. Endocrine Reviews. 21 (2), 115-137 (2000).
- Bonewald, L. F. Osteocy....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
