Gebruikmaken van troebelheid en trombo-lastografie voor complementaire clot karakterisering

Summary

Fibrin is verantwoordelijk voor stolselvorming tijdens hemostase en trombose. Troebelheidstesten en tromboelastograhy (TEG) kunnen worden gebruikt als synergetische instrumenten die complementaire beoordeling van een stolsel bieden. Deze twee technieken samen kunnen meer inzicht geven in hoe stollingscondities de vorming van fibrinstolsel beïnvloeden.

Abstract

Trombose is wereldwijd een belangrijke doodsoorzaak. Fibrin(ogen) is het eiwit dat primair verantwoordelijk is voor stolselvorming of trombose. Daarom is het karakteriseren van fibrinestolselvorming gunstig voor de studie van trombose. Troebelheid en trombo-lastografie (TEG) worden beide op grote schaal gebruikt in vitro tests voor het monitoren van stolselvorming. Troebelheid meet dynamisch de lichtdoorlatendheid via een fibrinstolselstructuur via een spectrometer en wordt vaak gebruikt in onderzoekslaboratoria. TEG is een gespecialiseerde visco-elastische techniek die direct de sterkte van de bloedstolsel meet en voornamelijk wordt gebruikt in klinische omgevingen om de hemostase van patiënten te beoordelen. Met behulp van deze twee instrumenten beschrijft deze studie een methode voor het karakteriseren van een in vitro fibrin stolsel met behulp van een vereenvoudigd fibrinogen/trombinstoletmodel. Gegevenstrends in beide technieken werden onder verschillende stollingsomstandigheden vergeleken. Menselijke en runderfibrinstols werden in deze studie naast elkaar gevormd, omdat boviene stollingsfactoren vaak worden gebruikt als vervanging van menselijke stollingsfactoren in klinische en onderzoeksomgevingen. De resultaten tonen aan dat TEG en troebelheid stolselvorming volgen via twee verschillende methoden en wanneer ze samen worden gebruikt complementaire stollingssterkte en vezel structurele informatie bieden over diverse stollingsomstandigheden.

Introduction

Trombose is de pathologische vorming van een bloedstolsel in het lichaam dat de bloedcirculatie blokkeert, wat wereldwijd leidt tot hoge morbiditeit en mortaliteit. Er zijn 1 tot 2 gevallen van veneuze trombo-embolie en 2 tot 3 gevallen van trombose-geïnduceerde vasculaire ziekten per 1000 mensen per jaar^1,2. Hier gepresenteerd is een methode gebruik te maken van trombo-lastografie (TEG) en troebelheid om stolselvorming te controleren onder verschillende stollingsomstandigheden. Fibrin(ogen) is het primaire eiwit dat verantwoordelijk is voor stolselvorming in het lichaam. In de laatste stappen van de stollingscasclaat worden fibrinopeptiden uit fibrinogen gespleten door trombine die de polymerisatie van onoplosbare fibrinemonmeren initieert terwijl het stolsel^{zich ontwikkelt 3,4}. Om stolselvorming in pathologische trombose te begrijpen, is het noodzakelijk om fibrinevorming te karakteriseren onder diverse stollingsomstandigheden. Meerdere stolsel monitoring testen zijn gebruikt om fibrin stolsel vorming in vitro studie. Prothrombin tijd (PT / INR) en geactiveerde gedeeltelijke tromboplastine tijd (aPTT) zijn twee veel voorkomende klinische tests die de integriteit van een specifieke stollingsroute te meten. Ze gebruiken echter tijd als de enige variabele die geen indicatie geeft van fysieke stolseleigenschappen⁵. Elektronenmicroscopie maakt visualisatie van de microstructuur van een volledig gevormd fibrinstolsel mogelijk, maar geeft geen informatie over het stolselvormingsproces zelf⁶. Onder alle testen, troebelheid testen en TEG bieden de mogelijkheid om stolsel kenmerken dynamisch te volgen in de tijd. Deze technieken maken het mogelijk om uitgebreide stollingsprofielen te meten en bieden daarom enig voordeel ten opzichte van andere fibrine stolselkarakteriseringstools.

Specifiek, troebelheid testen (of stolsel troebeleimetrie) wordt op grote schaal gebruikt voor onderzoek en klinische toepassingen als gevolg van de simplistische implementatie en de brede toegankelijkheid van spectrometers in onderzoekslaboratoria. Deze test maakt een dynamische meting van lichtdoorlatendheid door middel van een vormend stolsel mogelijk door individuele repetitieve metingen te doen op een gedefinieerde golflengte (meestal bij een golflengte in het bereik van 350 – 700 nm)⁷. Ook de temperatuur in de leeskamer kan worden aangepast. Naarmate fibringel zich vormt, wordt de hoeveelheid licht die door het eiwitnetwerk reist verminderd waardoor de absorptie na verloop van tijd toeneemt. Op dezelfde manier neemt de absorptie af wanneer het stolselnetwerk degradeert. Troebelheidstesten kunnen gemakkelijk worden gevoefd met behulp van een multi-well plaatformaat om een hoge doorvoermonsterscreening in zowel 96- als 384-putplaten mogelijk te maken. Verschillende stolsel kenmerken kunnen worden afgeleid van een troebelheid tracing curve (absorptie na tijd meting) die omvatten: maximale troebelheid, tijd tot maximale troebelheid, tijd om te stollen begin, en stolsel vorming tarief (Vmax). Een fibrin vezel massa / lengte verhouding kan ook worden afgeleid van ruwe troebelheid gegevens te schatten fibrin vezel dikte^8,9,10.

TEG wordt voornamelijk gebruikt in de klinische setting om de hemostase en stolsellyse van patiënten te beoordelen. Het wordt ook vaak gebruikt in chirurgische toepassingen om te bepalen wanneer anti-fibrinolytische geneesmiddelen of hemostatische bloedproducten moeten worden toegediend^11,12. Stolselvorming vindt plaats in een TEG-beker waarbij alle stollingscomponenten aan de beker worden toegevoegd voordat de test wordt ingeleid. De beker, met evoluerende stolsel, draait fysiek tegen een pin die in het midden wordt ingebracht en een elektromechanische torsiesensor meet de toenemende visco-elastische sterkte van het stolsel. Deze test wordt meestal uitgevoerd bij de fysiologische temperatuur van 37 °C; de temperatuur kan echter handmatig op het instrument worden aangepast. Maximale amplitude (MA), reactiesnelheid (R), kinetiektijd (K), α-hoek (Hoek) en time-to-maximum amplitude (TMA) worden door de TEG-software uit de dynamische TEG-tracering gehaald. Deze waarden worden meestal vergeleken met klinische normale bereiken om de stolling van een patiënt te beoordelen. Hoewel TEG niet precies een viscometer is, omdat het de stollingssterkte meet in millimetereenheden, biedt het wel belangrijke visco-elastische stolselgegevens en functioneert het als een waardevol klinisch beslissingsinstrument voor artsen om te beslissen om specifieke bloedproducten toe te dienen en therapeutische dosering aan te passen¹³. Wanneer zowel TEG- als troebelheidstesten samen worden gebruikt, bieden ze aanvullende informatie over de karakterisering van het stolsel, omdat stolselsterkte en kinetiek gemakkelijk kunnen worden geëxtraheerd uit TEG en fibrinvezeldikte toegankelijk is via optische troebelheidsmetingen.

Omdat fibrin een essentieel onderdeel is van een bloedstolsel, kan fibrinstololkkarakterisering onder diverse stolselvormingsomstandigheden waardevol inzicht geven in hoe een specifieke variabele bijdraagt aan het stolselvormingsproces en de uiteindelijke stolseleigenschappen. Inzicht in dit kan begeleiding bieden voor trombose diagnose en de ontwikkeling van therapieën. Om een representatievere fibrin stollende karakterisering te verkrijgen, kan plasma worden vervangen om de stolselvorming te controleren omdat het lijkt op in vivo stollingsomstandigheden dichter dan een vereenvoudigd fibrinogen/trombin modelsysteem. Echter, als gevolg van de ingewikkelde aard van de stolling cascade, stolsel vorming met behulp van plasma draagt bij aan de complexiteit, waardoor het moeilijker is om de impact van individuele factoren te isoleren. Het gebruik van een vereenvoudigd fibrinogen/trombin model voorkomt dat de hele stollingscascade moet worden gestart, waardoor de uiteindelijke fibrinevormingsstap kan worden geïsoleerd. Door het opnemen van twee grote fibrinevormende componenten (fibrinogen en trorombine), creëert deze setup een zeer gecontroleerde stolselvormingsconditie. Het is ook belangrijk op te merken dat, terwijl de vereenvoudigde stolsel model hier wordt gebruikt, dit protocol kan ook worden gebruikt om meer complexe stolsels te karakteriseren door het opnemen van extra stollingsfactoren. In deze studie worden fibrinstolololtaktisatie met troebelheid en TEG uitgevoerd door verschillende fibrinogen- en trombineconcentraties, ionische sterkte, pH en totale eiwitconcentratie in de stollingsoplossing om verschillende in vivo stollingsomstandigheden na te bootsen¹⁴. Details met betrekking tot deze wijzigingen in het protocol zijn opgenomen in sectie 5.

Protocol

1. Bereiding van fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS)

OPMERKING: PBS werd gebruikt tijdens deze studie als de beschreven tests niet vereist de toevoeging van calcium. Het is belangrijk op te merken dat bij het toevoegen van calcium, vaak gebruikt om citrated bloedproducten opnieuw te verkalken, PBS moet worden vermeden als calcium is bekend dat neerslaan in fosfaatbuffers.

1. Maak een 0,01 M, pH 7.4 PBS buffer door het mengen van 137 mM natriumchloride, 1,8 mM kalium fosfaat monobasic, 10 mM natriumfosfaat dibasic en 2,7 mM kaliumchloride in DI water.
2. Controleer de pH-buffer met behulp van een pH-sonde en pas de pH aan met natriumhydroxide of zoutzuur indien nodig.
3. Gebruik deze PBS voor de bereiding van fibrinogeen en stollingstesten (tenzij anders vermeld).
   OPMERKING: Buffer wordt voorgesteld om fibrinogen poeder te reconstrueren, omdat rehydratatie in DI water kan resulteren in fibrinogen neerslag, zelfs bij 37 °C.

2. Bereiding en opslag van eiwitten

OPMERKING: In het protocol worden de eiwitvoorraadconcentraties in verschillende concentraties voor troebelheid en TEG bereid om de consistente verhouding van zout, DI-water, PBS en andere restfactoren in de uiteindelijke stollingsoplossingen mogelijk te maken.

1. Bereiding en opslag van fibrinogen
   OPMERKING: Verontreinigingen in commercieel verkrijgbaar fibrinogen omvatten een aanzienlijke hoeveelheid factor XIII, resthoeveelheden van andere stollingsfactoren, opslagbuffer en zouten. In aanwezigheid van calcium, factor XIII is bekend dat crosslink de fibrin stolsel netwerk. Dit effect draagt bij aan een aangescherpte stolselstructuur en verbeterde stolselsterkte die fibrinkarakterisering beïnvloedt. Commercieel beschikbare activiteitskits kunnen worden gebruikt om de xiiia-niveaus van actieve factor te bepalen. Om de variabiliteit veroorzaakt door factor XIIIa tot een minimum te beperken, moeten experimenten worden ontworpen met uitsluiting van calcium of aanvullende stappen om factor XIIIa te verwijderen, moeten in dit protocol worden opgenomen. Daarnaast moeten eiwitopslagzout en buffertype worden beoordeeld en zo nodig dialyse worden uitgevoerd om over te dragen aan een voorkeurstestwerkbuffer.
   1. Weeg en aliquot lyophilized fibrinogenpoeder (runderen of mens) in 2 mL-buizen bij 20 mg eiwit per buis en bewaar aliquots tot -20 °C gedurende maximaal 6 maanden.
   2. Laat fibrinogen aliquot 10 minuten op de dag van het experiment acclimatiseren aan RT (kamertemperatuur). Reconstitute fibrinogen door 600 μL PBS toe te voegen aan de aliquot 20 min voorafgaand aan gebruik.
   3. Neem 10 μL fibrinogeen en verdun het met 190 μL PBS in een UV-transparante 96-putplaat of een cuvette. Bepaal de concentratie van fibrinogen door absorptie op 280 nm te nemen via een commerciële spectrometer en de bijbehorende software.
   4. Bereken fibrinogenconcentratie (mg/mL) met behulp van de wet van Bier. Bereid 12 mg/mL (voor troebelheidstesten) en 3,2 mg/mL (voor TEG) fibrinogen-voorraadoplossingen door verdere verdunning met PBS (tenzij anders vermeld).
      OPMERKING: Fibrinogen concentratie bepaling (mg/mL) volgens de wet van Bier:
      
      Molaire extinctiecoëfficiënt: ṭ = 513.400 L mol^-1 cm^-1 bij 280 nm; Pathlength (L); Verdunningsfactor (D); Moleculair gewicht (MW) = 340.000 Da. ṭ wordt afgeleid door E^0,1% = 1,51 (280 nm) (uitstervingscoëfficiënt, gegeven door de leverancier) te vermenigvuldigen met MW.
2. Voorbereiding en opslag van trombine
   1. Gereconstitueerde lyophilized trorombine (runderen of menselijke, 1000 U-voorraad) in 200 μL gedeïmpliceerd (DI) water om 200 μL van 5000 U/mL trombinevoorraadoplossing te maken.
   2. Maak 5 μL (20 U/tube) aliquots van de oplossing en houd aliquots bevroren op −20 °C.
   3. Dooi trombin aliquots bij RT gedurende 15 minuten op de dag van het experiment en maken trorombine werkoplossing door het te verdunnen tot 20 U / mL voor troebelheid testen en 18 U / mL voor TEG met DI water (tenzij anders vermeld).
      OPMERKING: Er moeten voorzorgsmaatregelen worden genomen om de enzymactiviteit te behouden die kan worden bereikt door enzymen op ijs te houden tijdens het ontdooien en gebruik; er werd echter geen vermindering van de trorombinactiviteit waargenomen wanneer deze direct na het ontdooien bij RT werd gebruikt.

3. Troebelheid

1. Gebruik elke commercieel verkrijgbare spectrometer met een absorptiebereik van 350 - 700 nm en een bijbehorende software om stolsel troebelheid na verloop van tijd te controleren (zie Tabel van materialen).
2. Schakel de spectrometer in en open de bijbehorende analysesoftware.
3. Selecteer het tabblad Plaat 1 en open plaatinstellingen. Klik op abs-modus en Kinetic om een dynamische absorptiemeting in de loop van de tijd te controleren.
4. Selecteer 550 nm (of een waarde in het bereik van 350 – 700 nm) in het tabblad golflengte en pas de totale looptijd aan op 60 min met een interval van 30 s op het tabblad tijd. Selecteer putten van belang voor het lezen door het benadrukken van de putten. Pas indien nodig andere instellingen aan.
   OPMERKING: Het selecteren van een golflengte aan de onderkant van het bereik (ongeveer 350 nm) brengt een betere gevoeligheid, maar absorptie kan ook de detectielimiet van de spectrometer overschrijden. De meest gebruikte golflengte voor troebelheid meting is 405 nm in de literatuur; Dit protocol maakt echter gebruik van 550 nm om ervoor te zorgen dat de dynamische troebelheidswaarden binnen de detectielimiet voor alle experimenten vallen. Het geselecteerde leesinterval moet zo kort mogelijk zijn om het hoogste niveau van testgevoeligheid te bereiken. Dit zal afhangen van de spectrometer en het aantal putten wordt gelezen tijdens een bepaalde test.
5. Neem een UV transparante 96-put plaat. Pipette 140 μL PBS in een put die is geselecteerd om te lezen. Voeg 10 μL trombine (20 U/mL) toe en meng ze in de put.
   OPMERKING: Gebruik geen hoge bindtestplaten om niet-specifieke eiwitbinding aan het putoppervlak te minimaliseren. Dit kan de eiwitverspreiding in de oplossing beïnvloeden en resulteren in een hoge testvariabiliteit.
6. Begin de stolling onmiddellijk door 50 μL fibrinogen (12 mg/mL) in de put toe te voegen om een 200 μL stollingsoplossing te verkrijgen met een uiteindelijke concentratie van 3 mg/mL fibrinogen en 1 U/mL trombine. Meng de inhoud in de put door pipetting op en neer vijf keer zorgen om te voorkomen dat de oprichting van bubbels in de oplossing als ze absorptie beïnvloeden door het verstrooien van licht.
   OPMERKING: Gebruik een meerkanaals pipet wanneer u meerdere stolselmonsters tegelijkertijd op dezelfde plaat uitvoert. Nota tijdsverschillen tussen putten en de periode voorafgaand aan de eerste lezing door het instrument om stollingstijden te compenseren.
7. Plaats de 96-put plaat in de houder en klik op Start in de software om troebelheid te beginnen met lezen bij RT.
   OPMERKING: Als de test bij een verhoogde temperatuur wordt uitgevoerd, moeten de spectrometer, plaat en reagentia allemaal op de gewenste temperatuur worden gehouden voordat de stolsel wordt inwijdd.
8. Zodra voltooid, haal de troebelheid gegevens en het verkrijgen van een troebelheid tracing curve door plotten absorptie verandering in de tijd in een plotten software.
9. Derive Turb^Max (maximale troebelheid indicatief voor fibrin vezel dikte en fibrin netwerkdichtheid) door het nemen van de maximale absorptiewaarde van de curve na verloop van tijd.
   OPMERKING: Fibrin vezel massa /lengte verhouding kan worden berekend op basis van troebelheid waarden met behulp van de vergelijking in het volgende manuscript⁸.
10. Bereken 90% maximale troebelheid door Turb^Max met 90% te vermenigvuldigen. Ontlenen Turb^Time door het berekenen van de tijd van stolsel initiatie tot 90% maximale troebelheid.
    OPMERKING: De tijd tot 90% maximale troebelheid is een betrouwbaardere metrische dan tijd tot absolute maximale troebelheid als het beter vertegenwoordigt stolsel tijd door het elimineren van de zeer variabele uiteindelijke stolsel vorming periode. Aanvullende stollingsparameters zoals de begintijd van het stolsel (de tijd van het begin van de test tot wanneer de absorptie begint toe te nemen) en de stollingsvorming (Vmax, de grootste helling van het lineaire gebied in de troebelheidstraceringscurve) kunnen ook worden geëxtraheerd uit de troebelheidstracerings traceringen.

4. Trombo-lastografie (TEG)

1. Zet de tromboelastograaf analyzer aan en wacht tot de temperatuur stabiliseert bij 37 °C.
2. Open TEG - software. Zodra u bent ingelogd, maakt u een experimentnaam onder de sectie ID.
3. Voer een e-test uit voor alle kanalen door de softwareprompts op het scherm te volgen. Plaats de hendel terug naar de laadpositie zodra alle controles zijn voltooid.
   OPMERKING: Een TEG e-test is vereist en moet elke keer worden uitgevoerd wanneer u het instrument gebruikt. TEG stollingscontroletesten (met behulp van TEG-niveau 1- en niveau 2-controles) zijn vereist op de door de reguliere fabrikant voorgestelde intervallen wanneer deze worden gebruikt voor klinische monsters.
4. Klik op het tabblad TEG en voer voorbeeldgegevens in voor kanalen die worden gebruikt. Plaats een duidelijke ongecoate TEG-beker in het bijbehorende kanaal. Schuif de drager naar boven en druk 5 keer op de bekerbodem om de pin op de torsiestang aan te brengen. Laat de drager zakken en druk de beker naar beneden in de dragerbasis totdat deze "klikt".
5. Pipette 20 μL trombineoplossing (18 U/mL) in de TEG-beker. Begin de stolling onmiddellijk door 340 μL fibrinogen (3,2 mg/mL) in de TEG-beker toe te voegen om een 360 μL stollingsoplossing met een uiteindelijke concentratie van 3 mg/mL fibrinogen en 1 U/mL trombine in de beker te verkrijgen. Meng de inhoud door het op en neer pikken vijf keer.
   OPMERKING: Potentiële stollingsfactoren of andere onderdelen van belang moeten tijdens deze stap worden toegevoegd, omdat het voorzichtig is om altijd een eindvolume van 360 μL in de TEG-beker te behouden.
6. Schuif de door de kop geladen drager omhoog, verplaats de hendel naar de leespositie en klik op Start in de software om de TEG-lezing te starten.
7. Zodra TEG is voltooid (na ongeveer een uur), haalt u TEG-parameters op en verkrijgt u een TEG-traceringscurve door amplitude in de loop van de tijd in een plottingsoftware uit te plotten.
8. Verzamel MA als TEG^Max (maximale amplitude is indicatief voor stolselsterkte) en TMA als TEG^Time (tijd tot maximale amplitude) van de software.
   OPMERKING: MA wordt door de software berekend als de maximale amplitude op het moment dat de amplitude minder dan 5% afwijking heeft over een periode van 3 minuten. TMA wordt bepaald als de tijd van de maximale thrombus generatie snelheid (in de buurt van het split point) naar de MA. Andere parameters kunnen ook nuttig zijn om te beoordelen bij het uitvoeren van de stolselanalyse. Enkele voorbeelden van deze parameters zijn: R-time (de tijd van het begin van de test tot wanneer amplitude 2 mm bereikt), K (de tijd vanaf het einde van R tot wanneer amplitude 20 mm bereikt), alfa (helling van de lijn tussen R en K) en CLT (stolsel lysetijd).

5. Fibrin karakterisering onder verschillende stollingsomstandigheden

OPMERKING: Voer fibrine karakteriseringsexperimenten uit door een specifieke variabele te moduleren in de stollingsoplossingen zoals: fibrinogen- en trombineconcentraties, ionische sterkte, pH en totale eiwitconcentraties. Experimentele preparaten met deze voorbeeldvariabelen worden in deze sectie beschreven; echter, andere stollingsfactoren en voorwaarden van belang kan ook worden vervangen. Selecteer zorgvuldig een geschikt buffersysteem, rekening houdend met elke unieke testvereisten. Voor troebelheid en TEG-tests, omvatten een buffer alleen controle om een nauwkeurige achtergrond aftrekken te garanderen, terwijl het analyseren van het effect van deze variabelen.

1. Variërende fibrinogenconcentratie (1, 2, 3, 4, 5 mg/mL)
   1. Pas stap 2.1.4 aan om de fibrinogenvoorraad in verschillende concentraties voor te bereiden (4, 8, 12, 16, 20 mg/mL voor troebelheidstesten en 1.1, 2.1, 3.2, 4.2, 5.3 mg/mL voor TEG).
   2. Pas stap 3.6 aan om "50 μL fibrinogen (4, 8, 12, 16, 20 mg/mL) toe te voegen aan meerdere putten van de 96 well-plate" voor troebelheidstesten.
   3. Pas stap 4.5 aan om "340 μL fibrinogen (1.1, 2.1, 3.2, 4.2, 5.3 mg/mL) toe te voegen aan heldere TEG-cups" voor TEG.
2. Variërende trombineconcentratie (0,1, 0,3, 0,6, 0,8, 1, 2,5, 5, 10 U/mL)
   1. Pas stap 2.2.3 aan om trombinevoorraad in verschillende concentraties voor te bereiden (2, 6, 12, 16, 20, 50, 100, 200 U/mL voor troebelheidstesten en 1,8, 5,4, 10,8, 14,4, 18, 45, 90, 180 U/mL voor TEG).
   2. Pas stap 3.5 aan om "10 μL trombine (2, 6, 12, 16, 20, 50, 100, 200 U/mL) toe te voegen aan meerdere putten van de 96 well-plate" voor troebelheidstesten.
   3. Pas stap 4.5 aan op "pipet 20 μL trombine (1.8, 5.4, 10.8, 14.4, 18, 45, 90, 180 U/mL) in clear TEG cups" voor TEG.
3. Wisselende ionische sterkte (0,05, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17 en 0,3 M)
   1. Los natriumchloride op (21, 101, 111, 121, 131, 141 en 271 mM) samen met 1,8 mM kaliumfosfaatmonabasic, 10 mM natriumfosfaat dibasic en 2,7 m kaliumchloride in DI water om 0,01 M PBS-oplossingen te maken met verschillende ionische sterktes.
   2. Pas stap 1.3 aan om PBS te gebruiken die op verschillende ionische sterktes zijn gemaakt om fibrinogen- en stollingsoplossingen voor te bereiden op zowel troebelheids- als TEG-testen.
4. Variërende pH (5,8, 6,6, 7,3, 7,4, 7,5 en 8,0)
   1. Oplossen van natriumfosfaatdibasic (0,7, 3,2, 7,7, 8,1, 8,4, 9,5 mM) en kaliumfosfaatmonabasisch (8,2, 6,0, 2,0, 1.7, 1,4, 0,5 mM) samen met 2,7 mM kaliumchloride en natriumchloride (153, 147, 138, 137, 136, 134 mM) om 0,01 M PBS-oplossingen te maken met wisselende pH en een uiteindelijke ionische sterkte op 0,165 M.
   2. Controleer de pH-waarde van de buffer via de pH-sonde en pas indien nodig de pH aan.
   3. Pas stap 1.3 aan om PBS te gebruiken die bij verschillende pH is gemaakt om fibrinogeen en stollingsoplossing voor te bereiden op zowel troebelheid als TEG-testen.
5. Variërende albuminconcentratie (0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 mg/mL)
   1. Los 2 g lyofphilized albumine op in 500 μL PBS bij RT gedurende 20 minuten op de dag van het experiment.
   2. Bepaal de albuminconcentratie met dezelfde procedure vermeld in stap 2.1.3 en 2.1.4 met een molaire extinctiecoëfficiënt van 43.800 L mol⁻¹ cm⁻¹ (bij 280 nm) voor albumine.
   3. Bereid albumin voorraad op verschillende concentraties.
   4. Pas stap 3.5 aan op "Pipette 40 μL PBS in een put die is geselecteerd voor het lezen en voeg 10 μL trombine (20 U/mL)". Pas stap 3.6 aan "Start de stolling onmiddellijk door 50 μL fibrinogen (12 mg/mL) toe te voegen met 100 μL albumine (0, 40, 80, 100, 120, 160, 200 mg/mL) in meerdere putten tot een laatste concentratie van 3 mg/mL fibrinogen, 1 U/mL trombine en 0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 mg/mL album in putten."
   5. Pas stap 4.5 aan "Start de stolling onmiddellijk door een mengsel van 200 μL albumine toe te voegen (36, 72, 90, 108, 144, 180 mg/mL) en 140 μL 7,7 mg/mL fibrinogen in TEG-cups om een 360 μL-stollingsoplossing te verkrijgen met een uiteindelijke concentratie van 3 mg/mL fibribrinoen, 1 U/mL trombine en 0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 mg/mL albumin in TEG cups."

Results

De in figuur 1 getoonde experimenten zijn representatieve troebelheidstraceringskrommen van menselijke en runderfibrinstols op verschillende fibrinogenniveaus. Representatieve TEG-traceringscurven voor fibrinstolselvorming op verschillende fibrinogenniveaus worden weergegeven in figuur 2. Beide traceringscurven tonen aan dat na een vertragingsperiode na het initiëren van stolsel, stolsel troebelheid of stolselamplitude in de loop van de tijd toeneemt en niveaus ...

Discussion

Dit protocol toont het gebruik van twee verschillende stolsel karakterisering tools testen van een vereenvoudigde fibrinogen / trombin stolsel model met behulp van commercieel beschikbare componenten. Zowel TEG- als troebelheidstesten zijn eenvoudig uit te voeren. Ze bieden niet alleen eindpunt stolsel onderzoeken zoals max stolsel vorming (Turb^Max en TEG^Max) en stolsel vorming tijden (Turb^Time en TEG^Time),maar ook beoordelen de dynamische stolsel vorming proces. Dit maakt TEG ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate	Corning	3635	Non-treated acrylic copolymer, non-sterile
Albumin from human serum	Millipore Sigma	A1653	≥96%, lyophilized powder
Arium Mini Plus Ultrapure Water System	Sartorius	NA	DI water source
Bovine serum albumin	Millipore Sigma	A2153	≥96%, lyophilized powder
Disposable Cups and Pins for TEG 5000 (Clear)	Haemonetics	REF 6211
Fibrinogen, Bovine Plasma	Millipore Sigma	341573	contains more than 95% clottable protein
Fibrinogen, Plasmingogen-Depleted, Human Plasma	Millipore Sigma	341578	Contains ≥ 95% clottable proteins.
Phosphate buffered saline	Millipore Sigma	P3813	Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions
Potassium chloride	Millipore Sigma	60130	≥99.5% purity
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P9791	≥98% purity
SevenEasy pH Meter	Mettler Toledo	S20
Sodium chloride	Millipore Sigma	71378	≥99.5% purity
Sodium phosphate dibasic	Millipore Sigma	71636	≥99.5% purity
SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system	Molecular Devices	M5
TEG 5000 Thrombelastograph Hemostasis analyzer system	Haemonetics	07-022
Thrombin, Bovine	Millipore Sigma	605157
Thrombin, Human Plasma, High Activity	Millipore Sigma	605195