Intratumorale heterogeniteit is een inherent kenmerk van tumoren, waaronder gliomen. We ontwikkelden een eenvoudig en efficiënt protocol dat een combinatie van buffers en gradiëntcentrifugatie gebruikt om enkele kernen te isoleren uit vers bevroren glioomweefsels voor single nucleus RNA en ATAC-sequencingstudies.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Kernisolatie van vers bevroren hersentumoren voor single-nucleus RNA-seq en ATAC-seq
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Volwassen diffuse gliomen vertonen inter- en intratumorale heterogeniteit. Tot voor kort waren de meeste grootschalige moleculaire profileringsinspanningen gericht op bulkbenaderingen die leidden tot de moleculaire classificatie van hersentumoren. In de afgelopen vijf jaar hebben single cell sequencing-benaderingen verschillende belangrijke kenmerken van gliomen benadrukt. De meerderheid van deze studies hebben verse hersentumormonsters gebruikt om afzonderlijke cellen te isoleren met behulp van flowcytometrie of op antilichamen gebaseerde scheidingsmethoden. In de toekomst zal het gebruik van vers ingevroren weefselmonsters uit biobanken meer flexibiliteit bieden voor toepassingen met één cel. Bovendien, naarmate het eencellige veld vordert, zal de volgende uitdaging zijn om multi-omics-gegevens te genereren van een enkele cel of hetzelfde monstervoorbereiding om de tumorcomplexiteit beter te ontrafelen. Daarom zullen eenvoudige en flexibele protocollen die gegevensgeneratie mogelijk maken voor verschillende methoden zoals single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) en single nucleus Assay voor Transposase-Accessible Chromatin met high-throughput sequencing (snATAC-seq) belangrijk zijn voor het veld.
Recente ontwikkelingen op het gebied van eencellige cellen in combinatie met toegankelijke microfluïdische instrumenten zoals het 10x genomics-platform hebben eencellige toepassingen in onderzoekslaboratoria vergemakkelijkt. Om heterogeniteit van hersentumoren te bestuderen, ontwikkelden we een verbeterd protocol voor de isolatie van enkele kernen van vers bevroren gliomen. Dit protocol voegt bestaande eencellige protocollen samen en combineert een homogenisatiestap gevolgd door filtratie en buffergemedieerde gradiëntcentrifugatie. De resulterende monsters zijn zuivere enkelvoudige kernsuspensies die kunnen worden gebruikt om genexpressie- en chromatinetoegankelijkheidsgegevens van één kern te genereren uit hetzelfde kernpreparaat.
Inleiding
Diffuse lagere graad gliomen (LGG), de meest voorkomende primaire hersentumor bij volwassenen, zijn infiltratieve neoplasmata die vaak ontstaan in de hersenhelft. LGG's vertonen zowel inter- als intra-tumor heterogeniteit, die niet alleen wordt aangedreven door de tumorpopulatie, maar ook door de niet-kwaadaardige cellen die ingewikkeld betrokken zijn bij de ontwikkeling en progressie vantumoren 1,2,3,4,5.
In het afgelopen decennium is er een lawine van genomische gegevens verzameld op het gebied van gliomen. Deze gegevens zijn voornamelijk afkomstig van bulk tumor sequencing studies en hebben enorm bijgedragen aan de moleculaire karakterisering, en de huidige classificatie van hersentumoren5,6,7,8,9,10,11. Hoewel deze studies het brede moleculaire landschap onthulden dat geassocieerd is met gliomen, is er nog steeds een teleurstellend gebrek aan vooruitgang met betrekking tot therapeutische interventie. Een van de obstakels voor behandelingsresistentie bij hersentumoren is intra-tumor heterogeniteit. Om dit probleem aan te pakken, hebben verschillende studies zich gericht op de genomische, transcriptomische, proteomische en epigenetische heterogeniteit die aanwezig is in een tumor op een enkelcellig niveau12,13,14,15,16,17.
Hoewel er de afgelopen jaren opmerkelijke technologische vooruitgang is geboekt op het gebied van eencellige cellen, is een van de belangrijkste beperkende factoren de beschikbaarheid van verse monsters die nodig zijn om de cellen te isoleren en deze experimenten uit te voeren. Om deze beperking te overwinnen, zijn er verschillende succesvolle pogingen geweest om assays uit te voeren, zoals snRNA-seq en snATAC-seq van bevroren weefsels, met behulp van kernen in plaats van cellen18,19. De meeste van deze methoden zijn afhankelijk van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) of filtratiestrategieën. Zowel single cell als single nuclei benaderingen hebben hun sterke en nadelen. Eencellige benaderingen onderhouden mitochondriale transcripten, die, hoewel informatief kunnen zijn, ook de transcriptoomdekking kunnen verminderen vanwege hun hoge overvloed. Enkelvoudige kernisolatiebenaderingen elimineren een hoog percentage van de mitochondriale fractie, waardoor een meer diepgaande dekking van de nucleaire transcripten mogelijk is20.
Er zijn verschillende commercieel beschikbare platforms die de afgelopen jaren zijn gebruikt om gegevens over genomica met één cel te testen, waaronder RNA-seq en ATAC-seq. Een van de meest prominente platforms is het 10x Genomics Chromium-platform voor eencellige genexpressie en atac-profilering met één cel. Omdat het platform werkt met behulp van microfluïdische kamers, kunnen puin of aggregaten het systeem verstoppen, wat leidt tot verlies van gegevens, reagentia en waardevolle klinische monsters. Daarom hangt het succes van eencellige studies grotendeels af van de nauwkeurige isolatie van enkele cellen / kernen.
Het protocol dat we hierin zullen demonstreren, is een licht gewijzigde combinatie van de DroNc-seq- en Omni-ATAC-seq-protocollen en maakt gebruik van een vergelijkbare benadering van recente studies die snRNA-seq gebruiken om neurologische aandoeningen en neuronale celtypen in het menselijk brein te begrijpen18,19,21,22,23,24. Het protocol maakt gebruik van een combinatie van enzymatische / mechanische dissociatie van bevroren monsters gevolgd door filtratie en gradiëntcentrifugatie en maakt een snelle en nauwkeurige isolatie van enkele kernen van vers bevroren glioomweefsels mogelijk. We hebben dit protocol met succes gebruikt om snRNA-seq- en snATAC-seq-gegevens te genereren van hetzelfde kernpreparaat uit hersentumormonsters.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Vers ingevroren glioommonsters werden verkregen van het National Center for Tumor diseases (NCT)-weefselbank in Heidelberg, Duitsland. Het gebruik van patiëntenmateriaal werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Medische Faculteit van Heidelberg en geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle patiënten die in de studie waren opgenomen.
1. Experimentele voorbereiding
- Voer alle stappen uit op ijs of bij 4 °C.
- Pre-chill tubes, schalen, scheermesjes, Douncers en stampers tot 4 °C.
- Bereid alle buffers van tevoren voor. Deze buffers zijn stabiel bij kamertemperatuur. Steriele filtratie wordt aanbevolen, vooral voor sucrose. De stampreparaten zijn aangepast van Corces et al.19. Zie de tabellen 1-7.
- Verwijder monsters van vloeibare stikstof of -80 °C diepvriesopslag en bewaar op droogijs tot stap 2.1.
2. Weefseldissectie en dissociatie
- Breng vers ingevroren weefselmonster (10-60 mg) over in een voorgekoelde petrischaal. Hak vers ingevroren weefsel met een scheermesje tot kleine stukjes op ijs.
- Voeg 500 μL gekoelde kernlysisbuffer toe aan een voorgekoelde buis van 1,5 ml. Plaats de weefselstukken in de buis van 1,5 ml met de kernlysisbuffer en breng over naar een Douncer(Tabel van materialen).
OPMERKING: Er zijn twee Dounce homogenisator stampers: "losse" of "A" stamper voor initiële monsterreductie en "tight" of "B" stamper voor volledige monsterhomogenisatie. - Dounce de weefselstukken met de "losse" stamper gedurende ongeveer 20 slagen, totdat de wrijving wordt verminderd. Als er vuil aanwezig is, kan het monster worden voorgeklaard door filtratie met een zeef van 100 mm.
- Dounce met de "strakke" stamper gedurende 20 slagen om volledige weefselhomogenisatie te bereiken.
- Breng het homogenaat (ongeveer 500 μL) over in een voorgekoelde buis van 2 ml. Voeg 1 ml gekoelde lysisbuffer toe. Meng zachtjes en incubeer op ijs gedurende 5 min. Meng voorzichtig met een pipetpunt met brede boring en herhaal 1-2 keer tijdens de incubatie.
- Filtreer het gehele homogenaat met behulp van een zeefgaas van 30 μm, verzamel het in een Falcon-buis van 15 ml en breng het terug in een nieuwe voorgekoelde buis van 2 ml. Een enkele zeef is meestal voldoende voor het gehele homogenaat.
- Controleer onder een lichtmicroscoop om de verwijdering van groot vuil en de intactheid van het kernmembraan te verifiëren. Kernen moeten rond zijn en het kernmembraan mag niet worden vervormd. Als er vuil aanwezig is, kunnen kernen opnieuw worden gefilterd.
- Centrifugeer de kernen bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C op een tafelcentrifuge. Verwijder het supernatant en laat ~50 μL achter met pellet die de kernen bevat. Resuspend de pellet voorzichtig in nog eens 1 ml kernlysisbuffer en incubeer gedurende 5 minuten op ijs.
- Centrifugeer de kernen bij 500 x g gedurende 5 min bij 4°C. Verwijder het supernatant zonder storende pellet, voeg 500 ml 1x homogenisatiebuffer (HB) toe(tabel 4)en incubeer gedurende 5 minuten zonder resuspendatie. Resuspend de kernen vervolgens in nog eens 1,0 ml 1x HB.
- Centrifugeer de kernen bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant en resuspend de kernen voorzichtig in 200 μL 1x HB in een nieuwe buis van 2,0 ml.
3. Gradiënt centrifugeren
- Voeg 200 μL 50% iodixanoloplossing(tabel 5)toe om een eindconcentratie van 25% iodixanol te krijgen. Meng goed 10 keer met pipet op 300 ml.
- Voeg 300 μL 29% iodixanoloplossing(tabel 6)toe onder het 25% mengsel. Gebruik een P1000 fijne punt om vermenging van de lagen te voorkomen.
- Voeg 300 μl 35% Iodixanol-oplossing (tabel 7) toe onder het 29% mengsel. Gebruik een P1000 fijne punt om vermenging van de lagen te voorkomen.
Let op: Deze stap vereist een geleidelijke verwijdering van de pipetpunt tijdens het pipetteren om overmatige volumeverplaatsing te voorkomen. - Plaats de monsters in een zwenkbakcentrifuge, draai gedurende 20 minuten op 3.500 x g bij 4°C met de rem uit.
- Verwijder de monsters voorzichtig zonder te schudden en observeer onder licht. Een heldere witte band van 95% zuivere kernen moet zichtbaar zijn tussen de tweede en derde laag(figuur 1).
4. Isolatie van kernen
- Adem de bovenste lagen op tot de witte kernenband in de interfase van 29%-35%.
- Verzamel de kernenband in een volume van 200 ml, breng over naar een verse buis en filter met een filter van 20 μm(tabel met materialen).
OPMERKING: De kernen hoeven niet te worden geresuspendeerd voorafgaand aan filtratie. - Controleer onder een lichtmicroscoop om de verwijdering van groot vuil en de intactheid van het kernmembraan te verifiëren. Kernen moeten rond zijn en het kernmembraan mag niet worden vervormd.
- Tel kernen met Trypan blauwe kleuring op een hemocytometer en aliquot kernen voor snRNA-seq/snATAC-seq.
5. Single nuclei RNA en ATAC seq
- Verwerk de kernen onmiddellijk met behulp van de eencellige genexpressie en eencellige ATAC-reagenskits(Tabel met materialen).
OPMERKING: De kernmonsterconcentraties voor het 10x Genomics-systeem zijn 1500-3000 kernen per μL voor snRNA-seq en 3500-7000 kernen per m μL voor snATAC-seq. De kernen kunnen worden verdund met behulp van 1x PBS. - Volg de resulterende bibliotheken in de Genomics Core Facility.
- Voer een kwaliteitscontroleanalyse van de gegevens uit. Kernen worden opgenomen voor verdere analyse als ze Unique Molecular Identifier (UMI) >1000, aantal genen >500 en procent mitochondriale genen <5% bevatten en binnen het gemiddelde + drie standaardafwijkingen van de UMIs en genen liggen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Single nucleus genomics is een evoluerend veld met beperkte gegevens en protocollen. Een kritische factor die de uitkomst van enkelvoudige kernen assays beïnvloedt, is de isolatie van zuivere en intacte kernen. We combineerden twee gepubliceerde protocollen (DroNc-seq en Omni-ATAC-seq protocollen) om hoogwaardige en zuivere kernen te isoleren van vers ingevroren glioomweefselblokken in een relatief korte tijd, waardoor de stabiliteit van de transcripten behouden blijft(Figuur 1).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het gebied van intra-tumorale heterogeniteit bevindt zich in een spannende fase, met nieuwe assays en platforms die worden ontwikkeld om de bestaande kennis uit te dagen en uit te breiden. Intratumorale heterogeniteit is een cruciale factor die bijdraagt aan ziekteprogressie en resistentie tegen de huidige behandelingsmodaliteiten bij gliomen28. Recente studies over hersentumoren hebben zich gericht op dit belangrijke aspect door gebruik te maken van transcriptomische en epigenomische assays met é...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We danken het Single Cell Open Lab (scOpenLab) van het Duitse kankercentrum (DKFZ) voor de nuttige discussies. Dit onderzoek werd ondersteund door het Duitse Cancer Aid, Max-Eder Program subsidienummer 70111964 (S.T.).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115-100ML | |
| Dounce Homogenizer | Active motif | 40401 | |
| EDTA (0.5 M) | Thermo Scientific | R1021 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
| Iodixanol (aka Optiprep) | Stem cell technologies | 07820 | |
| MACs Smart Strainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Mg(Ac)2 | Sigma | 63052-100ML | |
| NP-40 | Abcam | ab142227 | |
| Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma | NUC101-1KT | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Pre-Separation Filters (20 µm) | Miltenyi Biotec | 130-101-812 | |
| Safe lock tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Safe lock tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Single Cell ATAC | 10x Genomics | ||
| Single Cell Gene Expression | 10x Genomics | ||
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Wide Bore pipette tips (1000 µL) | Themo Fisher Scientific | 2079GPK | |
| Wide Bore pipette tips (200 µL) | Themo Fisher Scientific | 2069GPK |
Referenties
- Huse, J. T., Holland, E. C. Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma and medulloblastoma. Nature Reviews Cancer. 10 (5), 319-331 (2010).
- Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell Stem Cell. 14 (3), 275-291 (2014).
- Filbin, M. G., Suva, M. L. Gliomas Genomics and Epigenomics: Arriving at the Start and Knowing It for the First Time. Annual Review of Pathology. 11, 497-521 (2016).
- Ferris, S. P., Hofmann, J. W., Solomon, D. A., Perry, A. Characterization of gliomas: from morphology to molecules. Virchows Archive. 471 (2), 257-269 (2017).
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Eckel-Passow, J. E., et al. Glioma Groups Based on 1p/19q, IDH, and TERT Promoter Mutations in Tumors. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2499-2508 (2015).
- Suzuki, H., et al. Mutational landscape and clonal architecture in grade II and III gliomas. Nature Genetics. 47 (5), 458-468 (2015).
- Cancer Genome Atlas Research. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
- Noushmehr, H., et al. Identification of a CpG island methylator phenotype that defines a distinct subgroup of glioma. Cancer Cell. 17 (5), 510-522 (2010).
- Yan, H., et al. IDH1 and IDH2 mutations in gliomas. The New England Journal of Medicine. 360 (8), 765-773 (2009).
- Yan, H., Bigner, D. D., Velculescu, V., Parsons, D. W. Mutant metabolic enzymes are at the origin of gliomas. Cancer Research. 69 (24), 9157-9159 (2009).
- Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175-188 (2016).
- Tanay, A., Regev, A. Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism. Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).
- Wu, M., Singh, A. K. Microfluidic Flow Cytometry for Single-Cell Protein Analysis. Methods in Molecular Biology. 1346, 69-83 (2015).
- Schwartzman, O., Tanay, A. Single-cell epigenomics: techniques and emerging applications. Nature Reviews Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).
- Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nature Medicine. 26 (5), 792-802 (2020).
- Mathys, H., et al. Single-cell transcriptomic analysis of Alzheimer's disease. Nature. 570 (7761), 332-337 (2019).
- Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
- Al-Dalahmah, O., et al. Single-nucleus RNA-seq identifies Huntington disease astrocyte states. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 19(2020).
- Jakel, S., et al. Altered human oligodendrocyte heterogeneity in multiple sclerosis. Nature. 566 (7745), 543-547 (2019).
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. , (2018).
- Lake, B. B., et al. Integrative single-cell analysis of transcriptional and epigenetic states in the human adult brain. Nature Biotechnology. 36 (1), 70-80 (2018).
- Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
- Bready, D., Placantonakis, D. G. Molecular Pathogenesis of Low-Grade Glioma. Neurosurgery Clinics of North America. 30 (1), 17-25 (2019).
- Venteicher, A. S., et al. Decoupling genetics, lineages, and microenvironment in IDH-mutant gliomas by single-cell RNA-seq. Science. 355 (6332), (2017).
- Tirosh, I., et al. Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in human oligodendroglioma. Nature. 539 (7628), 309-313 (2016).
- Weng, Q., et al. Single-Cell Transcriptomics Uncovers Glial Progenitor Diversity and Cell Fate Determinants during Development and Gliomagenesis. Cell Stem Cell. 24 (5), 707-723 (2019).
- Neftel, C., et al. An Integrative Model of Cellular States, Plasticity, and Genetics for Glioblastoma. Cell. 178 (4), 835-849 (2019).
- Al-Ali, R., et al. Single-nucleus chromatin accessibility reveals intratumoral epigenetic heterogeneity in IDH1 mutant gliomas. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 201(2019).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
