Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Mitigatie van Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilisatie

3.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61545

⸱

3 december 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Pediatrics, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier gepresenteerd is een protocol voor het toevoegen van peptide CD47 (pepCD47) aan metalen stents met behulp van polybisfosfonaat chemie. Functionalisatie van metalen stents met behulp van pepCD47 voorkomt de bevestiging en activering van ontstekingscellen waardoor hun biocompatibiliteit wordt verbeterd.

Samenvatting

De belangrijkste complicaties geassocieerd met bare metal stents en drug eluting stents zijn in-stent restenose en late stent trombose, respectievelijk. Het verbeteren van de biocompatibiliteit van metaalstenten blijft dus een belangrijke uitdaging. Het doel van dit protocol is om een robuuste techniek van metalen oppervlaktemodificatie te beschrijven door biologisch actieve peptiden om de biocompatibiliteit te vergroten van bloedcontacten met medische implantaten, waaronder endovasculaire stents. CD47 is een immunologische soortspecifieke marker van het zelf en heeft ontstekingsremmende eigenschappen. Studies hebben aangetoond dat een 22 aminozuur peptide die overeenkomt met het Ig-domein van CD47 in het extracellulaire gebied (pepCD47), ontstekingsremmende eigenschappen heeft, zoals het volledige eiwit. In vivo studies bij ratten, en ex vivo studies in konijn en menselijk bloed experimentele systemen van ons lab hebben aangetoond dat pepCD47 immobilisatie op metalen verbetert hun biocompatibiliteit door het voorkomen van inflammatoire cel gehechtheid en activering. Dit artikel beschrijft het stapsgewijze protocol voor de functionalisering van metalen oppervlakken en peptidebevestiging. De metalen oppervlakken worden gewijzigd met behulp van polyallylamine bisfosfaat met latente thiolgroepen (PABT), gevolgd door deprotectie van thiolen en versterking van thiol-reactieve locaties via reactie met polyethyleenimine geïnstalleerd met pyridyldithio groepen (PEI-PDT). Ten slotte worden pepCD47, waarin terminale cysteïneresten zijn opgenomen die via een dubbele 8-amino-3,6-dioxa-octanoyl-spacer op het metalen oppervlak zijn aangesloten, aan het metalen oppervlak bevestigd. Deze methode van peptide bevestiging aan metalen oppervlak is efficiënt en relatief goedkoop en kan dus worden toegepast om de biocompatibiliteit van verschillende metalen biomaterialen te verbeteren.

Inleiding

Percutane coronaire interventie is de eerste lijn van de therapie voor de behandeling van coronaire hartziekten (CAD) en in de eerste plaats gaat stenting de zieke slagaders. Echter, in-stent restenose (ISR) en stent trombose zijn veel voorkomende complicaties in verband met stent inzet1. Bloedinteractie bij de bloedstentinterface wordt gekenmerkt door een bijna onmiddellijke adsorptie van plasma-eiwitten op het metalen oppervlak, gevolgd door bloedplaatjes en ontstekingscelbevestiging en activering2. Het vrijkomen van de inflammatoire cytokines en chemokines uit geactiveerde ontstekingscellen leidt tot de fenotypische modificatie van de vasculaire gladde spiercellen (VSMC's) in de tunica-media en activeert hun centrimentale migratie naar het intimale compartiment. Proliferatie van geactiveerde VSMC in de intima resulteert in intimale laagverdikking, lumenvernauwing en in-stent restenose3. Drug eluting stents (DES) werden ontwikkeld om VSMC proliferatie te voorkomen; deze geneesmiddelen hebben echter een off-target cytotoxisch effect op de endotheelcellen4,5. Daarom is late stenttrombose een veel voorkomende complicatie in verband met DES6,7. Stents gemaakt van biologisch afbreekbare polymeren, zoals poly-L-lactide hebben aangetoond veel belofte in de dierproeven en de eerste klinische proeven, maar werden uiteindelijk herinnerd toen de "real-life" klinisch gebruik aangetoond hun minderwaardigheid aan de3e generatie DES8. Daarom is er een noodzaak om de biocompatibiliteit van bare metal stents te verbeteren voor betere patiëntresultaten.

CD47 is een alomtegenwoordig uitgedrukt transmembrane eiwit dat de aangeboren immuunrespons remt wanneer gebonden aan zijn cognate receptor Signal Regulatory Protein alpha (SIRPα)9. De SIRPα-receptor heeft een itosineremmend motief (ITIM) en de signaleringsgebeurtenissen op SIRPα - CD47-interactie resulteert uiteindelijk in de downregulatie van ontstekingscelactivering10,11,12,13. Onderzoek in ons lab heeft aangetoond dat recombinant CD47 of zijn peptidederivaat, wat overeenkomt met het 22 aminozuur Ig-domein van het extracellulaire gebied van CD47 (pepCD47), de immuunrespons van de gastheer kan verminderen op een reeks klinisch relevante biomaterialen14,15,16. Onlangs hebben we aangetoond dat pepCD47 kan worden geïmmobiliseerd tot roestvrijstalen stentoppervlakken en de pathofysiologische respons die gepaard gaat met restenose aanzienlijk verminderen. Van belang, de pepCD47 gemodificeerde oppervlakken zijn vatbaar voor relevante gebruiksomstandigheden zoals langdurige opslag en ethyleenoxide sterilisatie17. Daartoe kan pepCD47 een nuttig therapeutisch doel zijn om de klinische beperkingen van endovasculaire stents aan te pakken.

De strategie voor de covalente bevestiging van pepCD47 aan een metalen oppervlak omvat een reeks nieuwe chemische modificaties van het metalen oppervlak. De metalen oppervlakken worden eerst bekleed met polyallylamine bisfosfonaat met latente thiolgroepen (PABT), gevolgd door de deprotectie van de thiolen en de bevestiging van polyethyleenimine (PEI) met geïnstalleerde pyridyldithiogroepen (PDT). PDT-groepen PEI die niet zijn ingenomen in de reactie met onbeschermde PABT-thiolen worden vervolgens gereageerd met pepCD47 waarin thiolen in de terminale cysteïneresiduen zijn verwerkt, wat resulteert in binding van pepCD47 aan het metalen oppervlak via een disulfide-binding14,17,18. We gebruikten een fluorofofoër geconjugeerde pepCD47 (TAMRA-pepCD47) om de inputconcentratie van peptide te bepalen die resulteert in de maximale oppervlakteimmobilisatie van het peptide. Ten slotte evalueerden we de acute en chronische ontstekingsremmende capaciteit van de met pepCD47 gecoate metalen oppervlakken, ex vivo, met behulp van respectievelijk het Chandler-lusapparaat en monocytenbevestiging/macrofaagexpansietest.

Dit document biedt een systematisch protocol voor de bevestiging van thiolated peptiden aan het metalen oppervlak; het bepalen van de maximale immobilisatiedichtheid van het peptide; en het beoordelen van de ontstekingsremmende eigenschappen van gecoat metalen pepcD47-oppervlakken die zijn blootgesteld aan volbloed en geïsoleerde monocyten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle menselijke monsters voor dit experiment werden verkregen in overeenstemming met de IRB van het Children's Hospital van Philadelphia. Alle dierproeven werden uitgevoerd na goedkeuring door IACUC van het Children's Hospital van Philadelphia.

1. Coating kale metalen oppervlakken met PEI-PDT

  1. Was de roestvrijstalen foliebonnen (1 cm x 1 cm of 0,65 cm x 1 cm) of roestvrijstalen meshschijven met 2-isopropanol in een shaker (60 °C, snelheid van 200 rpm) gedurende 5 minuten. Voer deze stap 2x uit. Was vervolgens 2x met chloroform (60 °C, snelheid van 200 tpm) gedurende 10 min per stuk.
  2. Plaats de gereinigde roestvrijstalen monsters in een oven op 220 °C gedurende 30 minuten.
  3. Bereid 5 mL van 0,5% PABT-oplossing voor door 25 mg polyallylaminesiofosfonaat op te lossen met latente thiolgroepen (PABT) en 5 mg kaliumbicarbonaat (KHCO3) in 5 mL DDW en incuto bij 72 °C in een shaker bij 200 tpm voor 30 min.
    LET OP: Voor PABT synthese verwijzen naar eerder gepubliceerde literatuur18.
  4. Dompel de gebakken folies of mesh schijven onder in 0,5% waterige oplossing van PABT en incubaal in een shaker (72 °C, snelheid van 200 rpm) gedurende 1 uur.
  5. Was de PABT-gemodificeerde monsters met gedeïsmiseerd gedestilleerd water (DDW) voor 5x, breng de exemplaren in een nieuw flesje en was opnieuw met DDW voor 5x.
  6. Bereid in totaal 5 mL TCEP-oplossing (12 mg/mL) voor door 60 mg Tris (2-carboxyethyl) fosfinehydrchloride (TCEP) op te lossen in 5 mL van 0,1 M azijnbuffer (0,57 mL glaciale azijnzuur, 820 mg natriumacetaat in 100 mL DDW).
  7. Behandel de PABT-gemodificeerde monsters met TCEP gedurende 15 minuten op kamertemperatuur (RT) op een shaker.
    OPMERKING: TCEP wordt gebruikt om de thiolgroepen te beschermen.
  8. Ontgas DDW in een ronde bodemkolf met behulp van een vacuümgender apparaat, zoals een lyofiel en was de TCEP behandelde folies of mesh schijven met ontgaste DDW voor 5x. Breng de monsters in een nieuw flesje, en bovendien wassen 5x met ontgast DDW.
    OPMERKING: Het is van het grootste belang om snel te werken om oxidatie van thiolen op het metalen oppervlak door atmosferische zuurstof te voorkomen.
  9. Bereid 5 mL van 1% PEI-PDT-oplossing voor door 212,5 μL voorraad PEI-PDT en 125 μL natriumacetaat van 0,4 M in ontgaste DDW te verdunnen. Voer stap 1.9 gelijktijdig uit met stap 1.8 om de blootstelling van de monsters aan atmosferische lucht te minimaliseren.
    OPMERKING: De synthese van PEI-PDT wordt beschreven in eerder gepubliceerde literatuur18.
  10. Incubeer de gewassen roestvrijstalen exemplaren met 1% PEI-PDT. Vervang lucht door argongas, sluit de flesjes luchtdicht af en meng op een shaker bij RT voor 1 uur. Ga onmiddellijk verder met de peptide vervoeging of bewaar op 4 °C tot 1 week.

2. Bijlage en kwalitatieve/kwantitatieve beoordeling van fluorofofoër geconjugeerde pepCD47 retentie op metalen oppervlak met behulp van fluorescentiemicroscopie en fluorimetrie

  1. Was folie coupons of mesh schijven bereid zoals beschreven in de sectie 1, stappen 1.1-1.10 hierboven met DDW 5x. Breng de monsters naar een nieuw flesje en was met DDW voor extra 5x. Tot slot wassen 2x met ontgaste ethanol en 2x met ontgast dimethyl formamide (DMF).
  2. Bereid tetramethylrhodamine (TAMRA)-geconjugeerde pepCD47 voorraadoplossing door tamra-geconjugeerd pepCD47-poeder in ontgassen dimethylformamide (DMF) op te lossen tot een uiteindelijke concentratie van 1 mg/mL. Aliquot de voorraad oplossing in 1 mL toewijzingen. Bewaar in goed afgesloten buizen onder argonatmosfeer bij -20 °C.
  3. Verdun 1 mg/mL van de voorraadoplossing van TAMRA-geconjugeerde pepCD47 met ontgaste DMF om de volgende concentraties fluorofophore vervoeging pepCD47 - 10, 30, 100 en 200 μg/mL voor te bereiden.
    OPMERKING: Als TAMRA-geconjugeerde pepCD47 lijkt te zijn neergeslagen, verminder de voorraad TAMRA-geconjugeerde pepCD47 oplossing met behulp van TCEP kralen in verhouding 1:1, bij RT voor 20 min. Merk op dat voordat u de TAMRA-geconjugeerde pepCD47 toevoegt aan de TCEP-kralen, de TCEP-kralenoplossing draait, de supernatant verwijdert en vervolgens verder gaat met de toevoeging van de TAMRA-geconjugeerde pepCD47.
  4. Incubeer de PEI-PDT gemodificeerde folie coupons met 10, 30, 100 of 200 μg/mL tamra-gevoegde pepCD47 in drievouden voor elke aandoening op een shaker bij RT onder argon atmosfeer gedurende 1 uur. Incubate PEI-PDT gemodificeerde mesh schijven, evenals mesh schijf niet gewijzigd dan stap 1.2 (bare metal controls) met 100 μg/mL tamra-conjugated pepCD47 in drievouden bij RT onder argon atmosfeer op een shaker voor 1 h.
    LET OP: Vanaf deze stap worden de flesjes verpakt in aluminiumfolie om de inhoud tegen licht te beschermen.
  5. Was de fluorofofofore geconjugeerde pepCD47-gecoate oppervlakken om het niet-covalente aangebrachte peptide in de volgende volgorde te verwijderen: DMF (3x), DMF/DDW om 1:1, DDW (3x), 0,3% SDS in 20 mM Tris pH 7.4 (3x, 5 min elk bij 70 °C op een shaker), DDW (3x), wissel flesjes en een laatste DDW-was.
  6. Plaats de besturing en covalently geconjugeerde mesh schijven op een microscoop glas, voeg 50 μL PBS en plaats een coverslip. Image mesh schijven met behulp van een omgekeerde fluorescentie microscoop uitgerust met een rhodamine filter set. Neem representatieve beelden bij 100x vergroting.
  7. Bereid 15 mL van 12 mg/mL TCEP-oplossing door 180 mg TCEP op te lossen in 1:1 v mengsel van methanol en 0,1 M azijnbuffer.
  8. Incubeer elke gewassen folie met 1 mL TCEP-oplossing op een shaker bij RT gedurende 15 minuten.
  9. Bereid de volgende normen voor door de TAMRA-vervoegde pepCD47-voorraad (1 mg/mL) – 100 μg/mL, 10 μg/mL, 1 μg/mL, 0,1 μg/mL en 0,01 μg/mL in de serie te verdunnen. Gebruik de TCEP-oplossing als verdunningsmiddel.
  10. Analyseer de TAMRA-conjugated pepCD47 die vrijkomt van het metalen oppervlak tegen de kalibratiecurve gegenereerd met behulp van de normen door fluorimetrie op 544/590 nm excitatie en emissie golflengten.

3. Het bevestigen van menselijke pepCD47 aan PEI-PDT gemodificeerde oppervlakken

  1. Was PEI-PDT gecoate monsters geformuleerd zoals beschreven in sectie 1, stappen 1.1-1.10 hierboven, met ontgastE DDW 5x, verander de flacon en was met ontgastE DDW 5x.
  2. Bereid menselijke pepCD47 voorraadoplossing (1 mg/mL) door het oplossen van menselijk pepCD47 poeder in ontgast 50% azijnzuur om een concentratie van 1 mg/mL te bereiken.
  3. Bereid de werkconcentratie van menselijke pepCD47 (100 μg/mL) voor door 500 μL van de voorraad menselijke pepCD47 op te lossen in 4.500 μL ontgast 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
  4. Incubeer de gewassen PEI-PDT gecoate monsters met 100 μg/mL pepCD47 bij RT met 1 h schudden.
  5. Was de menselijke pepCD47-gecoate monsters om overtollig peptide te verwijderen in de volgende volgorde PBS (3x), DDW (3x), 0,2% Tween-20 (3x, 5 min per stuk), DDW (3x), wissel flesjes en de uiteindelijke DDW was.
    OPMERKING: Menselijke pepCD47 gecoate oppervlakken kunnen tot 6 maanden droog worden opgeslagen bij 4 °C.

4. Coating van de PEI-PDT gemodificeerde oppervlakken met vervormde sequentie (Scr)

  1. Los het roerige sequentiepoeder op in ontgast 0,1% azijnzuur om een voorraadoplossing van 1 mg/mL voor te bereiden.
  2. Bereid een oplossing van 100 μg/mL roerei door 500 μL van de in 4.500 μL ontgaste 0,1% azijnzuur op te lossen.
  3. Bedek de gewassen PEI-PDT exemplaren met 100 μg/mL roerei bij RT met schudden gedurende 1 uur.
  4. Om ongebonden roerei te verwijderen, was de oppervlakken in de volgende volgorde 0,01% azijnzuur (3x), DDW (3x), 0,2% Tween-20 (3x, 5 min), DDW (3x), wissel flesjes en een DDW-was.

5. Chandler lus voor het analyseren van cellulaire bevestiging aan metalen oppervlakken

  1. Bedek de metalen folies (0,65 cm x 1cm) met menselijke pepCD47 of roerei peptide volgens de beschrijving op sectie 1 gevolgd door 3 of 4.
  2. Snijd 1/4" PVC buizen in drie 38 cm lange stukken.
  3. Plaats tot 8 ongewijzigde, roerei of pepCD47 gemodificeerde metalen folies in drie verschillende buizen.
  4. Verzamel 30 mL bloed van gezonde menselijke donoren vrij van anti-bloedplaatjes medicijnen volgens institutionele IRB protocol. Preload spuit met 1 mL van 4% natriumcitraat om stolling van verzameld bloed te voorkomen.
  5. Doe 10 mL bloed in elke buis met behulp van een spuit van 10 mL en sluit de uiteinden aan met metalen adapters. Plaats de met bloed gevulde buizen op de wielen van het Chandler loop apparaat.
  6. Geef het bloed langs de metalen folies door wielrotatie bij 37 °C bij de snelheid berekend om de schaar van 25 dyns/cm2 voor 4 uur te produceren.
  7. Giet het bloed uit de buizen en gooi het bloed volgens de IRB-eisen weg.
  8. Snijd de buizen met behulp van de scalpel om de folies te halen uit elke buis.
  9. Bereid 2% glutaraldehydeoplossing voor door de 10 ml glutaraldehydeoplossing van 10 ml te verdunnen met behulp van 10 mL natriumcaanoodylaatbuffer met 0,1 M natriumchloride.
  10. Incubeer de folies in 2% glutaraldehydeoplossing gedurende 15 minuten en bewaar 's nachts op 4 °C. Voor het analyseren, was de metalen folies 3x met PBS.

6. Het analyseren van cellulaire bevestiging aan metalen oppervlakken met behulp van CFDA kleurstof

  1. Warm 8 mL PBS in 15 mL buis in een waterbad ingesteld op 37 °C.
  2. Bereid de CFDA -kleurstofoplossing (carboxy-fluorescein diacetaat, succinimidylester) als volgt voor - voeg 90 μL DMSO toe aan één CFDA-kleurstoffluis om een voorraadconcentratie van 10 mM te bereiken. Bereid vervolgens de werkconcentratie van 93,75 μM voor door 75 μL van de boude CFDA toe te voegen aan 8 mL warme PBS. Meng door de buizen een paar keer om te keren en bedek de buis met aluminiumfolie.
    LET OP: Het is raadzaam om de CFDA-kleurstof voor elk gebruik vers te bereiden.
  3. Incubeer elke folie met 1 mL CFDA kleurstof in een 24 putplaat. Bedek de plaat met aluminiumfolie en broed de plaat 15 min op 37 °C.
  4. Was de metalen folies 3x met PBS om overtollige kleurstof te verwijderen. Beeld met behulp van de omgekeerde fluorescentie microscoop.

7. Monocyte bevestiging en macrofaag uitzetting op de pepCD47-gemodificeerde en kale metalen oppervlakken

  1. Verzamel 10 mL perifeer bloed via de vena cava toegang tijdens het offeren van een 400-450 g mannelijke Sprague-Dawley rat. Meng onmiddellijk met 1.000 IE natriumheparine om stolling te voorkomen.
  2. Pipette 10 mL dichtheidsgradiënt medium in een conische buis van 50 mL. Meng het bloed met 5 mL PBS, en zorgvuldig laag verdund bloed over de dichtheid gradiënt medium met behulp van een Pasteur pipet. Centrifuge in een swingende emmerrotor bij 800 x g en 18-25 °C voor 20 minuten met minimale instellingen van acceleratie en vertraging.
  3. Met behulp van een Pasteur pipet, het verzamelen van een ondoorzichtige laag van buffy jas op de interface tussen plasma en Ficoll. Verdun buffy coat 1:3 met PBS en centrifuge bij 550 x g en 4 °C gedurende 10 minuten tot buffy coat cells.
  4. Schorsen buffy coat cellen in 3 mL van ACK lyse buffer om lyse besmetten erythrocyten. Incubeer op ijs voor 4 min. Voeg 12 mL celscheidingsbuffer (CSB; 0,5% BSA, 0,5% FBS, 2 mM EDTA/PBS) toe.
  5. Centrifuge bij 550 x g en 4 °C gedurende 10 minuten. Schort de pellet opnieuw op in 10 mL CSB.
  6. Centrifuge bij 200 x g en 4 °C gedurende 10 minuten om bloedplaatjes te elimineren. Herhaal het twee keer.
  7. Schort de pellet opnieuw op in 500 μL CSB. Voeg 10 μg toe van elk van de volgende antiratantilichamen van de muis: CD8a (kloon OX-8), anti-CD5 (kloon OX-19), anti-CD45RA (kloon OX-33) en anti-CD6 (kloon OX-52).
  8. Incubeer bij 4 °C op een verticale buisdrammer gedurende 1 uur. Voeg 9,5 mL CSB toe. Centrifuge bij 300 x g en 4 °C gedurende 10 minuten. Gooi supernatant weg, schort de pellet opnieuw op in 10 mL CSB en herhaal centrifugatie.
  9. Schort de pellet opnieuw op in 500 μL CSB. Voeg 150 μL geitenantimuis IgG microbeads toe. Incubeer bij 4 °C op een verticale buisdrammer gedurende 20 min. Voeg 9,5 mL CSB toe. Centrifuge bij 300 x g en 4 °C gedurende 10 minuten.
  10. Gooi de supernatant weg. Schort de pellet opnieuw op in 1 mL CSB.
  11. Plaats een LS-kolom in een magnetische scheidingsteken.  Prime de LS kolom met 3 mL CSB. Gooi de kolomdoorvoer weg. Voeg 1 mL opnieuw opgehangen celpellet toe aan stap 7.10. Begin met het verzamelen van de doorvoer. Nadat de stroom stopt, voegt u 5 mL CSB toe en blijft u de kolomdoorvoer verzamelen totdat de stroom stopt.
  12. Centrifugeer de kolomdoorvoer (6 mL) met negatief geselecteerde monocyten bij 300 x g en 4 °C gedurende 10 min. Schort de resulterende kleine pellet opnieuw op in 2 mL RPMI-1640 medium aangevuld met 10% FCS, 1% pen/strep en 100 ng/mL rat macrofaag kolonie stimulerende factor (M-CSF).
  13. Tel de monocyten met hemocytometer. Stel de monocytconcentratie in op 5 x 105 cellen/mL.
  14. Voeg 1 mL-volumes monocytpensuspensie toe aan de afzonderlijke putten van een 12 putplaat met de kale roestvrijstalen foliemonsters (N=3) of roestvrijstalen monsters die zijn aangepast met rattenpeptCD47 (N=3) per 1.1-1.10 en 3.1-3.6.
  15. Verander het medium op dag 3 en 5 na het zaaien. Op dag 6 was je de cellen na het zaaien met PBS en bevestig je met 4% paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Was twee maal met PBS gedurende 5 minuten.
  16. Verwijder de roestvrijstalen folies en plaats ze individueel in een nieuwe 12 putplaat. Draai de folies niet om.
  17. Incubeer in 0,5% Tween-20/PBS gedurende 15 minuten om de cellen te permeabiliseren. Was twee maal met PBS gedurende 5 minuten.
  18. Blok in 10% geitenserum/PBS gedurende 20 minuten. Het serum aanzuigen. Niet wassen. Voeg muis anti-rat CD68 antilichaam (verdund 1:100 in 1%BSA/ PBS). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Was 3x in PBS gedurende 5 minuten per stuk.
  19. Voeg geit anti-muis IgG Alexa Fluor 546 (verdund 1:200 in 1% BSA/ PBS). Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten. Was in PBS gedurende 5 minuten. Counterstain met 1 μg/mL Hoechst 33342 kleurstof in het donker bij kamertemperatuur gedurende 10 min. Was 3x in PBS gedurende 5 minuten per stuk.
  20. Draai de folies en het beeld met behulp van een fluorescerende microscoop met de omgekeerde optiek. Leg afbeeldingen vast bij 200x vergroting met blauwe en rode filterinstellingen.
  21. Tel de bijgevoegde monocyten in de afzonderlijke afbeeldingen en berekende de groepsgemiddelden en standaarddeviaties.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De metalen oppervlakken worden thiol-reactief gemaakt voor peptidebevestiging via een reeks chemische modificaties, zoals geïllustreerd in figuur 1. PABT incubatie gevolgd door PEI-PDT behandeling maakt het metalen oppervlak vatbaar voor peptide bevestiging. Peptide CD47 (pepCD47) met cysteïne residu op C-terminus verbonden met de kern pepCD47 sequentie door middel van een flexibele dubbele AEEAc brug is covalent bevestigd aan de thiol-reactieve oppervlakken via disulfide obligaties. Met beh...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We demonstreren en beschrijven een relatief nieuwe chemische strategie om therapeutische peptidemoieties toe te brengen aan een roestvrijstalen oppervlak met het overkoepelende doel om de reactiviteit van het oppervlak te verminderen met ontstekingscellen in bloed. De hierin beschreven bisfosfonaatchemie omvat coördinerende bindingsvorming tussen de metaaloxiden en bisfosfonaatgroepen van PABT. De dikte van polybisfosfonaatmonolaag gevormd op het metalen oppervlak bedraagt niet meer dan 5 nm18, en...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Protocol ontwikkeling en studies gepresenteerd in dit document werden ondersteund door NIH (NBIB) R01 financiering (# EB023921) aan IF en SJS, en NIH (NHLBI) R01 financiering (# HL137762) aan IF en RJL.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 M Tris-HCLInvitrogen15567-027pH - 7.5
4% GlutaraldehydeElectron Microscopy Sciences16539-07
4% Sodium CitraatSigmaS5770
ACK lysing bufferQuality Biologicals118-156-721
anti-CD45RA Ab (muis anti-rat; clone OX-19)Biolegend202301
anti-CD5 Ab (muis anti-rat; clone OX-19)Biolegend203501
anti-CD6 Ab (muis anti-rat; clone OX-52)BD Biosciences550979
anti-CD68 Ab (muis anti-rat; clone ED-1)BioRadMCA341
anti-CD8a Ab (muis anti-rat; clone OX-8)Biolegend201701
Chloroform Certified ACSFisher ChemicalC298-500
Dimethyl Formammide (DMF)Alfa Aesar39117
Embra roestvrijstalen rasterElectron Microscopy SciencesE200-SSroestvrijstalen gaasmaskeschijven
Ficoll HypaqueGE Healthcare17-1440-02
Glacial azijnzuurACROS organic148930025
geiten anti-muis IgG Alexa FluorThermoFisherA11030
Heparine natriumSagent Pharmaceuticals402-01
Mens pepCD47Bachem4099101
IsopropanolFisher ChemicalA426P-4
MetaalaanpassersLeur Fitting6515IND1-weg adapter 316 ss 1/4"-5/16" hoes einde
MethanolRICCA chemical company4829-32
MicroscoopNikon EclipseTE300
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)Gibco14190-136
Kaliumbicarbonaat (KHCO3)Fisher ChemicalP184-500
PVC buizenTerumo-CVS600501/4" X 1/16 8'
Natriumcacodylaatbuffer met 0,1 M natriumchlorideElectron Microscopy Sciences11653
Natriumdodecylsulfaat (SDS)Bio-Rad laboratories161-0302
Natriumacetaat (C2H3NaO2)Alfa AesarA13184
Src peptideBachem4092599
Roestvrijstalen (AISI 304) cilindervormige monsters met een lumenMicrogroup, Medway, MA200973281 cm X 6 mm OD
Roestvrijstalen folies (AISI 316L)Goodfellow, Coraopolis, PA100 mm X 100 mm X 0.05 mm
Tetramethylrhodamine-geconjugeerd pepCD47 (TAMRA-pepCD47)Bachem4100277
TMB (3,3’,5,5’ -tetramethylbenzidine) substraat en tris (2-carboxyethyl) fosfine hydrochloride (TCEP)Thermo ScientificPG82089
Tween-20Bio-Rad laboratories170-6531
Vybrant CFDA SE Cell Tracer KitInvitrogenV12883

Referenties

  1. Buccheri, D., Piraino, D., Andolina, G., Cortese, B. Understanding and managing in-stent restenosis: a review of clinical data, from pathogenesis to treatment. Journal Thoracic Disease. 8 (10), 1150-1162 (2016).
  2. van Oeveren, W. Obstacles in haemocompatibility testing. Scientifica. 2013, Cairo. 392584(2013).
  3. Mitra, A. K., Agrawal, D. K. In stent restenosis: bane of the stent era. Journal of Clinical Pathology. 59 (3), 232-239 (2006).
  4. Iqbal, J., Gunn, J., Serruys, P. W. Coronary stents: historical development, current status and future directions. British Medical Bulletin. 106, 193-211 (2013).
  5. Hoffmann, R., et al. Patterns and mechanisms of in-stent restenosis. A serial intravascular ultrasound study. Circulation. 94 (6), 1247-1254 (1996).
  6. Stefanini, G. G., Windecker, S. Stent thrombosis: no longer an issue with newer-generation drug-eluting stents. Circulation: Cardiovascular Interventions. 5 (3), 332-335 (2012).
  7. Palmerini, T., et al. Clinical outcomes with bioabsorbable polymer- versus durable polymer-based drug-eluting and bare-metal stents: evidence from a comprehensive network meta-analysis. Journal of the American College of Cardiology. 63 (4), 299-307 (2014).
  8. Omar, W. A., Kumbhani, D. J. The Current Literature on Bioabsorbable Stents: a Review. Current Atherosclerosis Reports. 21 (12), 54(2019).
  9. Slee, J. B., Christian, A. J., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Addressing the Inflammatory Response to Clinically Relevant Polymers by Manipulating the Host Response Using ITIM Domain-Containing Receptors. Polymers (Basel). 6 (10), 2526-2551 (2014).
  10. Oldenborg, P. A., et al. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).
  11. vanden Berg, T. K., vander Schoot, C. E. Innate immune 'self' recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
  12. Tengood, J. E., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of CD47-modified biomaterials to mitigate the immune response. Experimental Biology Medicine (Maywood). 241 (10), 1033-1041 (2016).
  13. Tsai, R. K., Rodriguez, P. L., Discher, D. E. Self inhibition of phagocytosis: the affinity of 'marker of self' CD47 for SIRPalpha dictates potency of inhibition but only at low expression levels. Blood Cells, Molecules and Diseases. 45 (1), 67-74 (2010).
  14. Slee, J. B., et al. Enhanced biocompatibility of CD47-functionalized vascular stents. Biomaterials. 87, 82-92 (2016).
  15. Finley, M. J., et al. Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces. Biomaterials. 33 (24), 5803-5811 (2012).
  16. Stachelek, S. J., et al. The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation. Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2011).
  17. Inamdar, V. V., et al. Stability and bioactivity of pepCD47 attachment on stainless steel surfaces. Acta Biomaterialia. 104, 231-240 (2020).
  18. Fishbein, I., et al. Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries. Circulation. 117 (16), 2096-2103 (2008).
  19. Moser, K. V., Humpel, C. Primary rat monocytes migrate through a BCEC-monolayer and express microglia-markers at the basolateral side. Brain Research Bulletin. 74 (5), 336-343 (2007).
  20. vander Giessen, W. J., et al. Marked inflammatory sequelae to implantation of biodegradable and nonbiodegradable polymers in porcine coronary arteries. Circulation. 94 (7), 1690-1697 (1996).
  21. Fishbein, I., et al. Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (1), 159-164 (2006).
  22. Mouro-Chanteloup, I., et al. Evidence that the red cell skeleton protein 4.2 interacts with the Rh membrane complex member CD47. Blood. 101 (1), 338-344 (2003).
  23. Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces. Biomaterials. 34 (34), 8640-8649 (2013).
  24. Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits. Journal of Visualized Experiments. (90), e51871(2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Immobilisatie van CD47 peptidemodificatie van metalen oppervlakkenprotocol voor peptideconjugatiePABT PEI PDT functionaliseringfluorescentiemicroscopieanalysecompatibiliteit met flowcytometrieverbetering van de biocompatibiliteit van stentsbevestiging van therapeutische peptidencoating van metallische biomaterialen
Mitigatie van Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilisatie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.