Methodenartikel

Vertraagde intramyocardial levering van stamcellen na Ischemie Reperfusie Letsel in een Murine Model

4.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61546

⸱

3 september 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Medicine, Mayo Clinic, 2Department of Radiology and Molecular Imaging Program at Stanford (MIPS), Stanford University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Stamcellen worden voortdurend onderzocht als mogelijke behandelingen voor personen met myocardiale schade, maar hun verminderde levensvatbaarheid en retentie in gewond weefsel kan hun werkzaamheid op lange termijn beïnvloeden. In dit manuscript beschrijven we een alternatieve methode voor stamcellevering in een murinemodel van ischemie reperfusieletsel.

Samenvatting

Er is aanzienlijke belangstelling voor het gebruik van stamcellen (SC's) voor het herstel van de hartfunctie bij personen met myocardiale verwondingen. Meestal wordt cardiale stamceltherapie bestudeerd door scs gelijktijdig te leveren met de inductie van myocardiaal letsel. Deze aanpak bevat echter twee belangrijke beperkingen: de vroege vijandige pro-inflammatoire ischemische omgeving kan de overleving van getransplanteerde SC's beïnvloeden, en het vertegenwoordigt niet het subacute infarct scenario waar SC's waarschijnlijk zullen worden gebruikt. Hier beschrijven we een tweedelige reeks chirurgische ingrepen voor de inductie van ischemie-reperfusieletsel en de levering van mesenchymale stamcellen (MSCs). Deze methode van stamcel toediening kan zorgen voor de langere levensvatbaarheid en retentie rond beschadigd weefsel door het omzeilen van de eerste immuunrespons. Een model van ischemie reperfusie letsel werd geïnduceerd bij muizen vergezeld van de levering van mesenchymale stamcellen (3.0 x 105), stabiel uitdrukken van de verslaggever gen firefly luciferase onder de constitutief uitgedrukte CMV promotor, intramyocardially 7 dagen later. De dieren werden afgebeeld via echografie en bioluminescente beeldvorming voor de bevestiging van letsel en injectie van cellen, respectievelijk. Belangrijk is dat er geen extra complicatiepercentage was bij het uitvoeren van deze twee-procedure benadering voor SC-levering. Deze methode van stamcel toediening, gezamenlijk met het gebruik van state-of-the-art reporter genen, kan zorgen voor de in vivo studie van levensvatbaarheid en retentie van getransplanteerde SCs in een situatie van chronische ischemie vaak klinisch gezien, terwijl ook het omzeilen van de eerste pro-inflammatoire reactie. Samengevat hebben we een protocol opgesteld voor de vertraagde levering van stamcellen in het myocardium, dat kan worden gebruikt als een potentiële nieuwe aanpak bij het bevorderen van regeneratie van het beschadigde weefsel.

Inleiding

Hart- en vaatziekten blijven wereldwijd de meest voorkomende oorzaak van morbiditeit en mortaliteit. Cardiale ischemische gebeurtenissen zijn gevonden om schadelijk te zijn voor de algehele functie van het myocardium en de omliggende cellen1. Slechts ̴0,45-1,0% van de cardiomyocyten zal elk jaar regenereren na myocardiale schade optreedt2. Ondanks de groeiende vraag en de inherente focus op het ontwikkelen van behandelingen, therapieën die helpen bij de regeneratie van gewond weefsel zijn moeilijk vast te stellen en nog steeds verdere optimalisatie3,4,5. Stamceltherapieën zijn geïntroduceerd als een alternatief pad om beschadigd weefsel te verjongen na een ischemische gebeurtenis; echter, de vooruitgang van deze therapieën is uitgedaagd door de beperkte overleving en het behoud van de cellen naar een gewond gebied6.

De micro-omgeving van het hart na een ischemische gebeurtenis kan worden gekarakteriseerd als hypoxische, pro-oxidant en pro-inflammatoire, met vijandige omstandigheden voor therapeutische stamcellen om zich aan te passen aan overleving7,8. Als een immuunrespons wordt geactiveerd na letsel, naïeve lymfocyten, macrofagen, neutrofielen en mastcellen proberen om de schade te herstellen door het verwijderen van stervende cellen en moduleren van het proces voor weefsel remodelleren9,10,11. Binnen de eerste 3 dagen na ischemie is ontsteking op zijn hoogtepunt met het vrijkomen van pro-inflammatoire cytokinen met een groot aantal neutrofielen en monocyten in het gebied10,12. Na 7 dagen is een groot deel van de ontsteking verdwenen en begint de overgang naar herstellende cellen, die doorgaan tot de herinrichtingscascade is voltooid, ongeveer 14 dagen bij muizen13. Onze chirurgische methode is een mogelijke alternatieve benadering van de introductie van biologische in het myocardium om de piek aangeboren immuunrespons na ischemie reperfusieletsel te omzeilen. Tegelijkertijd zal het mogelijk maken voor de studie van eventuele behandelingen in een toestand van subacute / chronische ischemie waar er verschillende variabelen te overwegen in vergelijking met acute hartinfarct.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De experimenten werden uitgevoerd op vrouwelijke C57BL/6 muizen, leeftijd 10-12 weken en 20-25 g lichaamsgewicht. Alle dierprocedures voldeden aan de normen die zijn vermeld in de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Institute of Laboratory Animal Resources, National Academy of Sciences, Bethesda, MD, USA) en werden goedgekeurd door het Mayo Clinic College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Voorbereiding en intubatie

  1. Autoclave alle chirurgische instrumenten voor de operatie. Als meerdere operaties in één sessie moeten worden uitgevoerd, reinigt u de instrumenten na elk dier en steriliseert u opnieuw met een hete kraalsteriliator.
  2. Verdoven de muizen met 3,5-4% isoflurane op 1 L/min O2 in een inductiekamer.
  3. Beheer Buprenorfine SR 1 mg/kg (pijnstillend) onderhuids, weeg het dier en voer het gewicht in de beademing.
  4. Scheer de linkerkant van de borst van het borstbeen tot het niveau van de schouder en breng ontharingscrème aan om overtollige vacht te verwijderen.
  5. Voor de ischemie reperfusie procedure handhaven van de positieve eind-expiratoire druk (PEEP) op de ventilator op 2 cmH2O. Voor de vertraagde injectie van cellen procedure verander de PEEP tot 3 cmH2O om longinstorting te voorkomen.
  6. Intuberen het dier met behulp van een 20 G endotracheale buis, over te brengen naar een gecontroleerde verwarming pad om een lichaamstemperatuur van 35-37 °C te handhaven.
  7. Plaats de muis op een ventilator in laterale recumbency met craniale uiteinde aan de linkerkant en caudal einde aan de rechterkant.
  8. Houd anesthesie op 2-2,5% isoflurane op 1 L/min O2 voor de rest van de procedure.
  9. Scrub het chirurgische gebied afwisselend povidone-jodium en alcohol swabs drie keer en van toepassing oogheelkundige zalf op beide ogen.

2. Reperfusieletsel van ischemie

  1. Met behulp van een #10 blad scalpel maken een verticale incisie 2,5 mm naar rechts van de meest linkse tepel in het gezichtsveld.
  2. Met behulp van een schaar gesneden door de oppervlakkige spierlagen tot de intercostale spieren en ribben zichtbaar zijn.
  3. Tijdens het tillen van de ribben en het omliggende weefsel, snijd door de intercostale ruimte tussen de 4e en 5e ribben, dan steek het ooglid oprolmechanisme in de open ruimte.
  4. Trek het pericardium in met gebogen tangen, en beweeg de long omhoog en uit het zicht.
  5. Visualiseer LAD slagader en, met behulp van een 9-0 nylon hechting, door het myocardium onder de slagader 2,5 mm distaal aan de linker oorschelp en bind een losse vierkante knoop.
  6. Snijd 1 cm polyethyleen buizen en plaats het in de losse knoop.
  7. Zet de hechting rond de slang vast, bevestig ischemie en laat na 35 minuten los.
    OPMERKING: Bevestig ischemie door bleekheid en ventriculaire aritmie.
  8. Na het loslaten van de ligatie en het verwijderen van de slang, wacht 5 minuten om reperfusie van het myocardium te bevestigen.
  9. Plaats een 24 G IN-katheterbuis in de borstholte een intercostale ruimte rechts van de opening.
  10. Sluit de intercostale incisie met een 6-0 absorbeerbare hechting in een eenvoudig onderbroken patroon.
  11. Sluit de spierlaag met een 6-0 opneembare hechting in een continu hechtingspatroon.
  12. Na het sluiten van de oppervlakkige spierlaag, verwijder de borstbuis terwijl het terugtrekken van de lucht uit thoracale holte met behulp van een 1 mL tuberculine spuit.
  13. Sluit de huidincisie met een 6-0 opneembare hechting in een continu horizontaal matraspatroon
    LET OP: Nylon hechtingen en een discontinu hechtingspatroon kunnen ook worden gebruikt voor de huidlaag.
  14. Toedien 1,5 mL warme zoutoplossing onderhuids en breng triple-antibiotica zalf toe op de incisieplaats om infectie te voorkomen.
  15. Zet isoflurane uit en laat het dier door de ventilator op 100% O2 ademen totdat het continu kan ademen zonder hulp.
  16. Breng de muis naar een beddenvrije kooi of een kooi met bedekt beddengoed (papieren handdoek of laken) op een warm pad met een temperatuur van 35-37 °C tot volledig hersteld.

3. Muis mesenchymale stamcellevering

OPMERKING: De stam van muizen die voor de procedure worden gebruikt, is een inteeltlijn en wordt als genetisch identiek beschouwd. De mesenchymale stamcellen werden verkregen uit dieren van dezelfde stam en, door protocol ontwerp, immunosuppressie werd niet geïnduceerd1.

  1. Voltooi de voorbereidings- en intubatiestappen zoals eerder gedaan voor de eerste procedure.
  2. Verwijder de hechting van de huidlaag met een schaar en tang.
  3. Met een #10 scalpel, maak een incisie op dezelfde locatie als de vorige operatie.
  4. Blijf de scalpel gebruiken om littekenweefsel door te snijden totdat de hechting van de spierlaag zichtbaar is
  5. Met behulp van de schaar en tang verwijder de hechting en snijd de spierlaag open.
  6. Visualiseer en verwijder de hechtingen die de ribben bij elkaar houden en blijf de intercostale spier van de vorige incisie doorsnijden.
    OPMERKING: De longen kunnen zich aan de borstwand hebben vastgehangen, als dit gebeurt, gebruik dan stompe of gebogen tangen om ze zorgvuldig te scheiden en los te laten.
  7. Plaats het ooglid retractor in de intercostale ruimte en zoek het gebied van de vorige ligatie.
  8. Laad de mesenchymale stamcellen (3,0 x 105), opgehangen in 20 μL PBS, in een insulinespuit van 30 G, buig de naald lichtjes als dat nodig is voor de juiste hoek om te injecteren.
    OPMERKING: Mesenchymale stamcellen (MSCs) werden geïsoleerd uit het vetweefsel van 4-6 weken oude C56BL/6 muizen. Vroege passagecellen (p3) werden getransduceerd met een vector die het vuurvliegende luciferase-gen onder de CMV-promotor uitdrukte om in vivo cel levensvatbaarheidsmonitoring mogelijk te maken. Adipose-afgeleide muis MSC werden gekenmerkt door flow cytometrie en de cellen waren positief voor CD44, CD29, CD90 en CD105, maar negatief voor de hematopoietische marker CD4514. Voorafgaand aan de injectie werden MSC's gekweekt voor ten minste één passage om het verlies van cellen uit het ontdooiproces te voorkomen.
  9. Bewegen in de richting van de top naar de basis van het hart steek de spuit in het peri-infarct gebied totdat de naald opening is volledig in het myocard.
  10. Eenmaal binnen langzaam injecteren van de cellen in het myocard, wacht 3 s, verwijder dan de naald.
  11. Observeer het hart gedurende 3 minuten goed om zeker te zijn van geen abnormale reacties op de cellen, zoals ventriculaire fibrillatie.
  12. Plaats een 24 G IV katheterbuis in de borstholte een intercostale ruimte aan de rechterkant van de opening.
  13. Sluit de intercostale, spier- en huidlagen en verwijder de borstbuis op dezelfde manier als de eerste procedure.
  14. Toedien 1,5 mL warme zoutoplossing onderhuids en breng triple-antibiotica zalf toe op de incisieplaats om infectie te voorkomen.
  15. Zet isoflurane uit en laat het dier door de ventilator op 100% O2 ademen totdat het continu kan ademen zonder hulp.
  16. Breng de muis naar een beddenvrije kooi of een kooi met bedekt beddengoed (papieren handdoek of laken) op een warm pad met een temperatuur van 35-37 °C tot volledig hersteld.

4. Postoperatieve zorg na beide procedures

  1. Observeer het dier continu totdat spontane ademhaling, sternale recumbency en normale beweging is vastgesteld.
  2. Blijf observatie elke 15-30 min voor ten minste 3 uur op de dag van de operatie.
  3. Controleer de muizen op wonddehiscence of abnormale pijn eenmaal per dag gedurende 5 dagen, dan 2-3 keer per week.
  4. Als het dier na 72 uur na de operatie tekenen van pijn vertoont (d.w.z. gebogen rug, minimale beweging, grimacing of smerige vacht) na 72 uur, geef dan een extra dosis buprenorfine SR pijnstillend.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Ischemie reperfusie letsel werd geïnduceerd in muizen op dag 0, gevolgd door een postoperatieve echocardiogram en elektrocardiogram op de dag voorafgaand aan de implantatie van stamcellen. Echografie en elektrocardiogram analyse bevestigd infarct en verminderde ventriculaire contractielfunctie (Figuur 1A-D). Verder onderzoek van de gegevens toonde aan dat de uitwerpfractie en fractionele verkorting werden verminderd bij muizen die ischemische schade opliepen, terwijl de eind...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Meer dan 85 miljoen mensen wereldwijd worden getroffen door hart- en vaatziekten3. De hoge prevalentie van deze ischemische gebeurtenissen rechtvaardigt verdere ontwikkeling en uitbreiding van alternatieve therapieën voor het bevorderen van de regeneratie van beschadigd weefsel. Traditionele methoden maken gebruik van de ischemie reperfusie procedure in een acute omgeving met latere toediening van therapeutica1. Ontstekingsreacties zijn op zijn hoogtepunt tussen 3-4 dagen n...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.9% NaCl Irrigation, USPBaxter0338-0048-04
11x12" Press n' Seal surgical drape, autoclavableSAI Infusion TechnologiesPSS-SD
24G 3/4" IV catheter tubeJelco4053
28G x 1/2" 1mL allergy syringeBD305500Injectie van pijnstiller
30G x 1/2" 3/10cc insulin syringeUlticare08222.0933.56Injectie van stamcellen
6-0 S-29, 12" Vicryl sutureEthiconJ556GIntercostale, incisie sluiting van oppervlakkige spier en huidlaag
9-0 BV100-4, 5" Ethilon sutureEthicon2829GLigatie van de LAD-slagader
Absorbent underpadThermo Fischer Scientific14-206-64Voor onder het dier
Alcohol prep pads, 2 ply, mediumCoviden6818
Anti-fog face maskHalyard49235
Bonn Strabismus scissors, curved, bluntFine Science Tools14085-09
Buprenorphine HCL SR LAB 1mg/ml, 5 mlZooPharm PharmacyBuprenorfine narcotisch pijnstiller geformuleerd in een polymeer dat de absorptie vertraagt waardoor de duur van de werking wordt verlengd (72 uur activiteitsduur).
Castroviejo needle holders, curvedFine Science Tools12061-01
Curity sterile gauze spongesCoviden397310
Delicate suture tying forceps, 45 angle bentFine Science Tools11063-07
Electric RazorWahlVerwijdering van vacht
Isoflurane 100 mlCardinal HealthPI23238Anestheticum
Lab coat
Monoject 1 mL hypodermic syringeCoviden8881501400
Moria iris forceps, curved, serrated (x2)Fine Science Tools11370-31
Moria speculum retractorFine Science Tools17370-53
Mouse endotracheal intubation kitKent Scientific
Nair depilatory creamJohnson & JohnsonVerwijdering van vacht
Optixcare eye lube plusAventixSteriele oculair smeermiddel
Physiosuite ventilatorKent Scientific
PolyE Polyethylene tubingHarvard Apparatus72-0191Tijdelijke compressie van LAD-slagader
Povidone-iodine swabsPDIS41125
Scalpel, 10-bladeBard-Parker371610
Sterile 3" cotton tipped applicatorsCardinal HealthC15055-003
Sterile 6" tapered cotton tip applicatorsPuritan25-826-5WC
Sterile glovesCardinal HealthN8830
Sterilization pouchesMedlineMPP100525GS
Surgery cap
Surgical MicroscopeLeicaM125
Suture tying forceps, straight (x2)Fine Science Tools10825-10
Transpore surgical tape3M1527-1
Triple antibiotic ointmentG&W Laboratories11-2683ILNC2Topische toepassing om infecties te voorkomen
Vannas-Tübingen Spring Scissors, curvedFine Science Tools15004-08
Vetflo vaporizerKent Scientific

Referenties

  1. Franchi, F., et al. The Myocardial Microenvironment Modulates the Biology of Transplanted Mesenchymal Stem Cells. Molecular Imaging Biology. , (2020).
  2. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  3. Writing Group, M., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 38(2016).
  4. Gersh, B. J., Simari, R. D., Behfar, A., Terzic, C. M., Terzic, A. Cardiac cell repair therapy: a clinical perspective. Mayo Clinic Protocol. 84 (10), 876-892 (2009).
  5. Terzic, A., Behfar, A. Regenerative heart failure therapy headed for optimization. European Heart Journal. 35 (19), 1231-1234 (2014).
  6. Beegle, J., et al. Hypoxic preconditioning of mesenchymal stromal cells induces metabolic changes, enhances survival, and promotes cell retention in vivo. Stem Cells. 33 (6), 1818-1828 (2015).
  7. Kubli, D. A., Gustafsson, A. B. Mitochondria and mitophagy: the yin and yang of cell death control. Circulation Research. 111 (9), 1208-1221 (2012).
  8. Psaltis, P. J., et al. Noninvasive monitoring of oxidative stress in transplanted mesenchymal stromal cells. JACC Cardiovascular Imaging. 6 (7), 795-802 (2013).
  9. Peet, C., Ivetic, A., Bromage, D. I., Shah, A. M. Cardiac monocytes and macrophages after myocardial infarction. Cardiovasc Research. 16 (6), 1101-1112 (2020).
  10. Swirski, F. K., Nahrendorf, M. Cardioimmunology: the immune system in cardiac homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (12), 733-744 (2018).
  11. Zhang, Z., et al. Mesenchymal Stem Cells Promote the Resolution of Cardiac Inflammation After Ischemia Reperfusion Via Enhancing Efferocytosis of Neutrophils. Journal of the American Heart Association. 9 (5), 014397(2020).
  12. Saxena, A., Russo, I., Frangogiannis, N. G. Inflammation as a therapeutic target in myocardial infarction: learning from past failures to meet future challenges. Translational Research. 167 (1), 152-166 (2016).
  13. Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis. Circulation Research. 119 (1), 91-112 (2016).
  14. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Vertraagde stamceltoedieningmesenchymale stamcellenintramyocardiale injectiebioluminescente beeldvormingchirurgisch protocolbewaking van de hartfunctiebeoordeling van de cellevensvatbaarheidbehandeling na letsel

Gerelateerde artikelen