Planarian Scrunching als een kwantitatieve gedragsuitlezing voor schadelijke stimuli sensing

Samenvatting

Zoetwaterplanariërs vertonen drie gangen (glijden, peristaltiek en scrunching) die te onderscheiden zijn door kwantitatieve gedragsanalyse. We beschrijven een methode om scrunching te induceren met behulp van verschillende schadelijke stimuli, kwantificering daarvan, en onderscheid van peristaltiek en glijden. Met behulp van gen knockdown, tonen we de specificiteit van scrunching als een kwantitatieve fenotypische uitlezing.

Samenvatting

Zoetwaterplanarianen glijden normaal gesproken soepel door ciliary voortstuwing aan hun ventrale kant. Bepaalde omgevingsomstandigheden kunnen echter spiergestuurde vormen van beweging veroorzaken: peristaltiek of scrunching. Terwijl peristalse het gevolg is van een ciliary defect, scrunching is onafhankelijk van cilia functie en is een specifieke reactie op bepaalde stimuli, met inbegrip van amputatie, schadelijke temperatuur, extreme pH, en ethanol. Dus, deze twee spieren-gedreven gangen zijn mechanistisch verschillend. Ze kunnen echter moeilijk kwalitatief te onderscheiden zijn. Hier bieden we een protocol voor het induceren van scrunching met behulp van verschillende fysieke en chemische stimuli. We beschrijven de kwantitatieve karakterisering van scrunching, die kan worden gebruikt om het te onderscheiden van peristaltiek en glijden, met behulp van vrij beschikbare software. Aangezien scrunching een universele planaire gang is, zij het met kenmerkende soortenspecifieke verschillen, kan dit protocol in grote lijnen worden toegepast op alle soorten planarianen, wanneer u passende overwegingen gebruikt. Om dit aan te tonen, vergelijken we de reactie van de twee meest populaire planaire soorten die worden gebruikt in gedragsonderzoek, Dugesia japonica en Schmidtea mediterranea, met dezelfde set van fysieke en chemische stimuli. Bovendien maakt de specificiteit van scrunching het mogelijk om dit protocol te gebruiken in combinatie met RNA-interferentie en/of farmacologische blootstelling om de betrokken moleculaire doelen en neuronale circuits te ontleden, waardoor mogelijk mechanistisch inzicht kan worden verschaft in belangrijke aspecten van nociception en neuromusculaire communicatie.

Inleiding

Naast hun populariteit voor stamcel- en regeneratieonderzoek^1,2,,3, zoetwaterplanarianen zijn al lang gebruikt in gedragsstudies^4,5, profiterend van hun relatief grote omvang (een paar millimeter in lengte), gemak en lage kosten van laboratoriumonderhoud, en breed spectrum van waarneembaar gedrag. De introductie van computer visie en geautomatiseerde tracking om planaire gedragsstudies^{6,7,8,9,10,11} hebben kwantitatieve differentiatie van gedragsfenotypen mogelijk gemaakt. Dierlijk gedrag is een directe uitlezing van de neuronale functie. Omdat het vaatstelsel van gemiddelde grootte en complexiteit is, maar geconserveerde sleutelelementen deelt met het gewervelde brein^12,13,14,kan het bestuderen van planarian gedrag inzicht geven in geconserveerde mechanismen van neuronale werking die moeilijk direct kunnen worden onderzocht in complexere organismen. Planarianen zijn dus een waardevol model voor vergelijkende neurobiologiestudies^{8,12,15,16,17,18,19,20,21}. Bovendien zorgt het aquatisch milieu voor snelle en facile blootstelling aan chemische stoffen om hun effect op de hersenfunctie te bestuderen bij het regenereren en volwassen planarianen, waardoor ze een populair systeem voor neurotoxicologie^{22,23,24,25,26}.

Planarianen bezitten drie verschillende gangen, aangeduid als zweefvliegen, peristaltiek, en scrunching. Elke gang wordt tentoongesteld onder specifieke omstandigheden: glijden is de standaard gang, peristaltiek treedt op wanneer ciliary functie wordt aangetast^7,27, en scrunching is een ontsnapping gang - onafhankelijk van trilharen functie - in reactie op bepaalde schadelijke stimuli⁷. We hebben aangetoond dat scrunching een specifieke reactie is, opgewekt door het gevoel van bepaalde chemische of fysieke signalen, waaronder extreme temperaturen of pH, mechanisch letsel of specifieke chemische inductoren, en dus geen algemene stressrespons is^7,28,29.

Vanwege de specificiteit en stereotiepe parameters, die gemakkelijk kunnen worden gekwantificeerd met behulp van dit protocol, scrunching is een krachtige gedragsfenotype dat onderzoekers in staat stelt om mechanistische studies ontleden zintuiglijke trajecten en neuronale controle van gedrag^25,28uit te voeren. Bovendien is aangetoond dat scrunching een gevoelig eindpunt is om nadelige chemische effecten op de ontwikkeling van het zenuwstelsel en de functie in neurotoxicologiestudies 22^,,24,^25,30te testen .²⁴ Zoals verschillende zintuiglijke paden lijken te convergeren om scrunching induceren door middel van verschillende mechanismen²⁸, scrunching verschilt van andere planarian gedrag, omdat verschillende, maar specifieke, stimuli kunnen worden gebruikt om aparte neuronale circuits ontleden en bestuderen hoe verschillende signalen zijn geïntegreerd om de singcrunch fenotype te produceren.

Belangrijk is dat er soortenverschillen bestaan, waarbij de ene chemische stof scrunching kan uitlokken bij de ene planaire soort, maar een andere gedragsreactie in een andere. We hebben bijvoorbeeld ontdekt dat anandamide scrunching induceert bij de planaire soorten Dugesia japonica, maar peristaltiek induceert in Schmidtea mediterranea²⁸. Dit voorbeeld benadrukt het belang van het betrouwbaar kunnen onderscheiden van de verschillende gangen, omdat ze de fenotypische manifestaties zijn van verschillende moleculaire mechanismen. Het onderscheid tussen scrunching en peristaltiek is echter moeilijk met behulp van kwalitatieve observationele gegevens, omdat beide gangen op spierstelsels zijn gericht en kwalitatieve gelijkenissen hebben^7,28. Om de gangen te onderscheiden is het dus noodzakelijk om cilia imaging of een kwantitatieve gedragsstudie uit te voeren, die onderscheid mogelijk maakt op basis van karakteristieke parameters^7,28. Omdat cilia imaging is experimenteel uitdagend en vereist gespecialiseerde apparatuur, zoals een high-vergroting samengestelde microscoop en een high-speed camera^7,28, het is niet zo breed toegankelijk voor onderzoekers als kwantitatieve gedragsanalyse.

Hier presenteren we een protocol voor (1) de inductie van scrunching met behulp van verschillende fysieke (schadelijke temperatuur, amputatie, bijna-UV-licht) en chemische (allyl isothiocyanaat (AITC), cinnamaldehyde) stimuli en (2) de kwantitatieve analyse van planair gedrag met behulp van vrij beschikbare software. Door vier parameters te kwantificeren (frequentie van lichaamslengteschommelingen, relatieve snelheid, maximale amplitude en asymmetrie van lichaamsverlenging en samentrekking)⁷, kan scrunching worden onderscheiden van zweefvliegen, peristaltiek en andere gedragstoestanden die in de literatuur worden gemeld, zoals slangachtige voortbeweging¹⁵ of epilepsies¹⁵. Bovendien, terwijl scrunching wordt bewaard onder verschillende planaire soorten⁷, elke soort heeft zijn eigen karakteristieke frequentie en snelheid; daarom, zodra de glijdende en knarsende snelheden van een soort zijn bepaald, kan de snelheid alleen worden gebruikt als een middel om scrunching van glijden en peristaltiek²⁹te onderscheiden. Het protocol gaat uit van een voorafgaande opleiding in computationele beeldanalyse of gedragsstudies en kan dus ook worden toegepast voor planaire gedragsexperimenten in een onderwijslaboratoriumcontext op bachelorniveau. Voorbeeldgegevens om protocolaanpassing te vergemakkelijken worden verstrekt in het supplementaire materiaal.

Protocol

1. Kwantitatieve planaire gedragstesten

1. Experimentele installatie
   1. Plaats een dimbaar LED-paneel op een vlak oppervlak. Het LED-paneel dient twee doeleinden: (1) om een uniforme witte achtergrond te bieden en (2) om te worden gebruikt als een verstelbare lichtbron om het juiste contrast te verkrijgen. Plaats een petrischaalarena van 100 mm op het LED-paneel.
      OPMERKING: Om de doorvoer te verhogen, kan een multi-well plaat worden gebruikt als een arena^23,24, maar grotere arena's vergemakkelijken geautomatiseerde beeldanalyse.
   2. Monteer een camera op een ringstandaard boven de arena(figuur 1A). Pas de camerapositie, hoogte en scherpstelling zo nodig aan, zodat de hele arena gecentreerd is binnen het gezichtsveld en scherp is(figuur 1B).
      OPMERKING: De cameraresolutie moet hoog genoeg zijn om een planarian duidelijk te onderscheiden van de homogene achtergrond van het LED-paneel.
   3. Vul de arena met de juiste exposure media (planarian water of chemische oplossing) tot half-maximum volume (dit zal worden aangeduid als een bad). Dit komt overeen met ongeveer 25 mL voor een petrischaaltje van 100 mm. Schakel het LED-paneel in en schakel alle andere lichtbronnen uit die de opnamekwaliteit negatief kunnen beïnvloeden (d.w.z. lichtbronnen in de buurt die een schittering op de arena produceren).
      LET OP: Beheer gevaarlijke chemische oplossingen op de juiste manier door het dragen van volledige persoonlijke beschermingsmiddelen (PPE) en het verplaatsen van de experimentele setup naar een rookkap indien nodig. Volg de federale en staatsvoorschriften inzake afvalverwerking.
   4. Laat een planarian naar het midden van de arena met behulp van een transfer pipet. Begin met opnemen. Gegevens opnemen als beeldsequenties in een native Fiji^31-indeling (TIFF, GIF, JPEG, PNG, DICOM, BMP, PGM of FITS; zie afbeeldingsanalysesectie 1.2).
      OPMERKING: Omdat gedrag en gevoeligheid voor externe stimuli verschillen tussen individuele planarianen, is het belangrijk om gegevens te verzamelen over een voldoende groot aantal biologische replica's, naast het uitvoeren van technische replicaties. We hebben gewerkt met maximaal 10 middelgrote (4-7 mm) planarianen in een 100 mm petrischaaltje tegelijk. Terwijl de tijd efficiënt, meerdere planarianen in de Petri schotel in een keer maken data-analyse moeilijker, omdat planarianen kunnen paden kruisen.
      1. Voor zweefexperimenten u opnemen met ten minste 1 frame per seconde (FPS). Voor scrunching / peristaltiek experimenten, opnemen met behulp van een FPS die ten minste twee keer de scrunching / peristaltiek frequentie van de planaire soorten. Als de planaire soort een onbekende scrunching/peristalsis frequentie heeft, gebruik dan 10 FPS als uitgangspunt en verhoging/afname indien van toepassing.
      2. Bij het gebruik van een chemische oplossing, breng de planarian met behulp van zo weinig mogelijk druppels van planarian water, zodat de concentratie van de chemische oplossing niet significant wordt veranderd.
   5. Voor zweefexperimenten, record 1-2 minuten van glijden gedrag. Voor scrunching/ peristaltiek experimenten, record lang genoeg om ten minste 3 opeenvolgende oscillaties die zich in een rechte lijn vast te leggen. Nadat het experiment is voltooid, beëindigt u de opname.
      OPMERKING: Voor scrunching/peristalsis experimenten, als een planarian niet voldoet aan de beëindiging criterium binnen een bepaalde periode die moet worden consistent over replica's en wordt empirisch bepaald op basis van de stimulus, eindigt de opname en test een andere planarian.
      1. Als de planarian de grens van de arena bereikt zonder te voldoen aan de beëindiging criterium, pipet de planarian terug naar het centrum van de arena.
         OPMERKING: Vermijd herhaalde pipetting van een individu voor het opnemen, omdat dit zijn gedrag kan veranderen.
   6. Haal de planarian(s) uit de arena en gooi de planaire water- of chemische oplossing weg in geschikte afvalcontainers. Planarianen die in planarian water waren kunnen aan hun huiscontainer worden teruggegeven.
      OPMERKING: Vermijd kruisbesmetting door verschillende arena's te gebruiken voor verschillende media (d.w.z. glijden in planaire waterexperimenten mag niet worden uitgevoerd in een arena die voorheen werd gebruikt voor scrunching/peristaltiek-experimenten met chemische blootstelling).
      1. Seriële spoelplanariërs blootgesteld aan een chemische oplossing in 3 schone 100 mm petrischaaltjes gevuld met 25 mL planarian water om alle chemicaliën grondig te verdunnen. Als scrunching of peristalsis werd veroorzaakt, plaats deze planarianen in een aparte container. Planarianen kunnen worden teruggestuurd naar hun huis container na een maand, omdat de meeste cellen zou zijn omgedraaid tegen die tijd¹.
         OPMERKING: Als er meerdere verschillende experimenten nodig zijn voor dezelfde populatie van planarianen, bijvoorbeeld voor een RNAi-populatie, laat planarianen zich 24 uur herstellen voordat ze het volgende experiment uitvoeren. Bestel de experimenten zodanig dat het minst invasieve experiment eerste is en het meest invasieve experiment (bijvoorbeeld amputatie) als laatste wordt uitgevoerd.
      2. Als het uitvoeren van meerdere experimenten in dezelfde arena, goed ontdoen van het bad oplossing en verwijder eventuele slijm paden door afvegen van de arena met een papieren handdoek tussen de runs.
         LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken.
2. Kwantitatieve analyse van planariërlijk gedrag
   1. Uitvoeren van planaire gedrag testen zoals beschreven in punt 1.1.
   2. Open de raw-afbeeldingsreeks voor een experiment in Fiji(Bestand > Importeren > Afbeeldingsreeks)en selecteer de eerste afbeelding in de afbeeldingsreeks. Schakel in het venster Volgordeopties het selectievakje 'Namen numeriek sorteren' in en klik op 'OK'. Zodra de afbeeldingsreeks is geladen, converteert u de afbeeldingsreeks naar 8-bits(Afbeelding > Tekst > 8-bits)en gebruikt u het pijlgereedschap of de schuifregelaar onder aan de afbeeldingsstapel om de afbeeldingsreeks te bekijken of door te pannen.
      OPMERKING: Voor zweefexperimenten kunnen alle gegevens worden gebruikt zolang de planarian duidelijk zichtbaar is tijdens de opname. Het is echter meestal voldoende om de vrije beweging in het midden van de arena te analyseren door het relevante deel(en) te extraheren zoals hieronder beschreven.
   3. Om een periode en regio van belang te extraheren, trekt u een interessegebied dat het volledige pad van een planarian omvat met behulp van het rechthoeksgereedschap(figuur 2A, 2B). Klik met de rechtermuisknop op de afbeeldingsstapel en selecteer Dupliceren...,schakel het selectievakje voor Stapel duplicerenin, voer de eerste en laatste frames van de reeks van belang in en klik op OK. Als meerdere planarianen werden gelijktijdig afgebeeld, herhaal deze regio selectie en duplicatie stap voor elke planarian in de arena, zodat er zo veel open beeld stapels als er planarians in de arena. De volgende stappen (stap 1.2.4-1.2.10) moeten één voor één op elke afbeeldingsstapel worden uitgevoerd.
      1. Voor zweefproeven, extract een periode van glijden waar de planarian beweegt ten minste twee keer zijn lichaamslengte.
         OPMERKING: Hoe meer glijdende gegevens per planarian worden geëxtraheerd, hoe betrouwbaarder de gegevens zullen zijn. De planarian hoeft niet te bewegen in een rechte lijn voor de zweefvliegen analyse.
      2. Voor scrunching/peristalsis experimenten, extract een instantie wanneer de planarian ondergaat een minimum van drie opeenvolgende (idealiter meer) lichaam oscillaties in een rechte lijn, ervoor te zorgen dat elke oscillatie is een volledige verlenging-contractie cyclus, als volledige oscillaties zijn nodig om nauwkeurig te bepalen van de frequentie.
         OPMERKING: Hoe meer schommelingen die kunnen worden geëxtraheerd, hoe betrouwbaarder de gegevens zullen zijn. Gebruik geen sequenties waar de planarian draait als deze zal resulteren in onjuiste lengte metingen.
   4. Pas een drempelwaarde toe op de gedupliceerde afbeeldingsstapel(Afbeelding > Aanpassen > Drempelwaarde)om de afbeelding te binariseren en de planarian uit de achtergrond te halen. Pas de schuifbalken zo nodig aan, zodat de gehele vediërs rood worden gemarkeerd. De exacte waarden zijn afhankelijk van de beeldkwaliteit. Laat de vakken voor donkere achtergrond, Stack histogram, en Niet opnieuw bereik ongecontroleerd. Blader door de afbeeldingsstapel om een goed drempelbereik te garanderen (d.w.z. de planarian is goed gescheiden van de achtergrond in de hele stapel) en klik vervolgens op Toepassen.
   5. Stel in het venster Stapel converteren naar binair de methode in op Standaard en de achtergrond op licht. Schakel alle vakjes in dit venster uit en klik op OK. Een binarized beeld dat een zwarte planarian op een witte achtergrond toont zal verschijnen(Cijfer 2C). Zorg ervoor dat de hele planarian zichtbaar is in alle frames van de beeldreeks.
      OPMERKING: Ongewenste objecten in de binarized beeldreeks die kleiner of groter zijn dan de planarianen, kunnen in de daaropvolgende analyse worden gefilterd met behulp van een groottefilter(figuur 2Ciii).
   6. Stel metingen in door te klikken op Analyseren > Metingen instellen. Schakel de selectievakjes in voor Gebied, Massacentrum, Stapelpositieen Ellips passen en klik op OK.
      OPMERKING: Deze parameters hoeven slechts één keer per Fiji-sessie te worden ingesteld.
   7. Selecteer de open afbeeldingsstack en selecteer Analyseren > Deeltjes analyseren.
   8. Selecteer in het venster Deeltjes analyseren de optie Weergeven > Maskers om een nieuwe stapel te openen met alle objecten die zijn gedetecteerd met de gekozen parameters. Dit kan worden gebruikt om visueel te controleren of alleen metingen van de planarian worden uitgevoerd. Bij deze stap kan een filter van grootte worden ingesteld om ongewenste ruis te verwijderen door het geschatte gebied van de planarian (in pixel^2-eenheden) in de aanwezige ruimte in te voeren. Schakel de selectievakjes in voor Weergaveresultaten en Resultaten wissen en klik op OK.
      OPMERKING: Als de index (eerste kolom) in het venster Resultaten niet gelijk is aan het segmentnummer voor alle rijen, betekent dit dat er te veel of te weinig objecten zijn bijgehouden. Een mogelijkheid voor deze discrepantie is de aanwezigheid van andere objecten naast de planarian of dat de planarian niet werd gevolgd in specifieke frames.
   9. Blader door de stapel maskerafbeelding met de schuifregelaar onder aan het deelvenster. Als er ruis is of als er frames zijn die geen planarian hebben, sluit u het venster Resultaten en de stapel van de maskerafbeelding. Herhaal stap 1.2.7-1.2.8 door het gebiedsfilter aan te passen om alleen andere objecten dan de planarian te verwijderen.
      OPMERKING: Als de planarian ontbreekt in het frame in het masker, suggereert dit dat de ondergrens van het gebiedsfilter te hoog is ingesteld.
   10. Sla in het venster Resultaten de gegevens op met Bestand>Opslaan als. Voeg de CSV-extensie toe aan de bestandsnaam om gegevens op te slaan als waarden die door komma's zijn gescheiden. Zodra gegevens voor de afbeeldingsstack zijn opgeslagen, sluit u de respectievelijke afbeeldingsstapel en de vensters Resultaten en Masker.
   11. Importeer gegevens en analyseer verder met behulp van spreadsheetsoftware of freeware. Raadpleeg punt 1.3 om de zweefsnelheid te berekenen. Raadpleeg sectie 1.4 voor het berekenen van de volledige parameterset scrunching/peristalsis.
       LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken.
   12. Als u de pixel wilt bepalen tot conversie met de werkelijke lengte, opent u een afbeelding in Fiji met een referentielengte (bijvoorbeeld de diameter van de arena). Selecteer het lijngereedschap en teken een lijn over de bekende lengte.
   13. Pixeleenheden converteren naar een standaardeenheid met lengte door op Analyseren > Schaal instellen te klikken. Voer de lengte in die overeenkomt met de lijn die op de afbeelding is getekend in het vak Bekende afstand en wijzig de lengte-eenheid van pixel naar de gekozen standaardeenheid met lengte. De conversiefactor wordt naast Schaalgeschreven.
       OPMERKING: Een pixelconversiewaarde is niet vereist voor zweefvliegen of scrunching/peristalsis-analyses in de secties 1.3 en 1.4.
3. Berekening van de zweefsnelheid
   1. Met behulp van het gegevensbestand dat is opgeslagen in sectie 1.2, laadt u het centrum van massa (COM) x- en y-coördinaten en de belangrijkste asgegevens. Als de gegevens worden opgeslagen als een door komma's gescheiden waardenbestand, komen deze lijsten overeen met respectievelijk de kolommen 'XM', 'YM' en 'Major'.
   2. Bereken de verplaatsing (d) van het planaire massacentrum in pixels voor elk frame ten opzichte van het volgende frame met behulp van de gegevenskolommen "XM" en "YM". Verplaatsing d) wordt gegeven door:
      
      waarbij x₁ en y₁ verwijzen naar de COM-coördinaten (XM, YM) van één frame en x₂ en y₂ verwijzen naar de COM-coördinaten (XM, YM) van het volgende frame.
   3. Stel de planaire lichaamslengte in^th als het 95e percentiel van de "Major" kolom. Aangezien de planarianen een gedrag van de muurvoorkeur³²tentoonstellen , zorgt dit ervoor dat de berekende planarian lichaamslengte representatief is van wanneer de planarian langwerpig²⁴is .
   4. Normaliseer verplaatsing door planaire lichaamslengte door de pixelverplaatsingen per frame te delen door de planaire lichaamslengte (l). Genormaliseerde verplaatsing (d_n) wordt gegeven door:
      
   5. Genereer een lijst met genormaliseerde snelheden door de genormaliseerde verplaatsingen te delen door de tijd die per frame is verstreken (omgekeerd van de geregistreerde FPS). Genormaliseerde zweefsnelheid (s_n) wordt gegeven door:
      
   6. Bereken de genormaliseerde zweefsnelheid van de planarian door het gemiddelde van de lijst met genormaliseerde snelheden (n)_nte nemen . De standaarddeviatie kan worden gebruikt als een onzekerheidsmeting voor de planarian.
   7. Herhaal stap 1.3.1-1.3.6 voor elke planarian te analyseren. Gemiddeld en neem de standaarddeviatie van de glijdende snelheden voor alle planarianen om de glijdende snelheid en bijbehorende onzekerheid, respectievelijk, voor een planarianbevolking te krijgen.
4. Onderscheid van scrunching en peristalsis gangen met behulp van de volledige parameter set
   1. Laad de lijst met belangrijke asgegevens uit het gegevensbestand dat is opgeslagen in sectie 1.2. Als de gegevens worden opgeslagen als een door komma's gescheiden waardenbestand, komt dit overeen met de kolom Major.
   2. Maak een lijst met elk gegevenspunt in de kolom Major, te beginnen met 0. Converteer deze lijst naar de verstreken tijd per frame door te delen door de opgenomen FPS.
   3. Plot de belangrijke kolom gegevens met betrekking tot de verstreken tijd om een scrunching / peristalsis oscillatie plot te genereren (Figuur 3A). Met behulp van de oscillatieplot, trim de gegevens tot ten minste drie opeenvolgende, rechte lijn oscillaties (figuur 3Bi). Trim de gegevens om te beginnen en te eindigen op lokale pieken (maximale verlenging van oscillatie) of troggen (minimale verlenging van oscillatie).
      OPMERKING: Als lokale extrema niet ongeveer gelijk zijn (pieken/dalen verschillen dramatisch in hoogtes), suggereert dit dat de trillingen niet rechtlijnig zijn(figuur 3Bii). Haal een andere reeks van ten minste drie opeenvolgende, rechte lijnschommelingen. Zie punt 1.2.
   4. Bevestig dat de oscillatievolgorde van de rente is geëxtraheerd en bijgesneden goed door replotting de bijgesneden Belangrijke gegevens met betrekking tot de tijd. Gebruik deze lijst met bijgesneden gegevens voor alle volgende berekeningen.
   5. Als u de oscillatiefrequentie (ν_m)wilt berekenen, deelt u het aantal schommelingen (O_n) door het totale aantal gegevenspunten in de bijgesneden lijst met hoofdasgegevens (N). Vermenigvuldig FPS met deze waarde om frequentie te krijgen in trillingen per seconde.
      
   6. Maximale rek berekenen (|Δε| _max), trek de absolute minimale lichaamslengte (l_min) af van de absolute maximale lichaamslengte (l_max). Normaliseer tot langwerpige lichaamslengte door te delen door de absolute maximale lichaamslengte.
      
   7. Als u de snelheid per lichaamslengte(v^{* m)}_mwilt berekenen, vermenigvuldigt u de berekende maximale rek met de oscillatiefrequentie.
      
      OPMERKING: Snelheid alleen kan worden gebruikt om onderscheid te maken tussen scrunching en peristaltiek gangen⁷.
   8. Voor het berekenen van de fractie van de tijd besteed langwerpige (f_long), neem de afgeleide van de bijgesneden grote as gegevenslijst met betrekking tot de tijd. Verdeel het aantal positieve gegevenspunten (d.w.z. wanneer het derivaat >0 (n_p)is, door het totale aantal gegevenspunten in de belangrijkste asgegevenslijst(n_t)).
      
      OPMERKING: Scrunching planarians vertonen een asymmetrische fractie van de tijd besteed aan het verlengen, terwijl planarianen uitvoeren peristaltiek besteden evenveel tijd lang langwerpig en aanbestedende⁷.
   9. Herhaal stap 1.4.1-1.4.8 voor elke planarian te analyseren. Bereken een planaire bevolkingsparameter die is ingesteld door de gemiddelde en standaarddeviatie van elke parameter te nemen.
      OPMERKING: De parameterset kan worden gebruikt om te bepalen of het oscillatiegedrag scrunching, peristalsis of een andere vorm van bewegingsvrijheid is met periodieke veranderingen in de lichaamsvorm. Zowel scrunching als peristalsis hebben vaste parameters voor een bepaalde soort⁷, waarbij scrunching parameters over het algemeen groter zijn dan peristaltiekparameters⁷. Hoewel het mogelijk is dat een van de parameters buiten het soortspecifieke bereik kan vallen, zoals we eerder hebben waargenomen bij chemische inductie^28,moet het waargenomen gedrag overeenkomen met ten minste 3 van de 4 gepubliceerde parameters die moeten worden gecategoriseerd als peristaltiek of scrunching.

2. Scrunching inductie

1. Fysieke stimuli (schadelijke temperatuur, UV-licht, amputatie)
   1. Voor alle experimenten met fysieke stimuli verwijzen we naar sectie 1.1 voor de experimentele opstelling.
      OPMERKING: Het is het beste om een grote arena te gebruiken, zoals een 100 mm petrischaal, voor fysieke stimuli experimenten om meer open ruimte te bieden voor het manoeuvreren van een pipet en/ of scheermesje.
   2. Om scrunching via schadelijke temperatuur te veroorzaken, wordt hitteplanariair water in een glazen beker (ten minste 100 μL per te testen planarian) tot 65 °C op een hete plaat.
      1. Plaats een planarian in het midden van de arena. Wacht tot de planaire oriënteert zich rechtop en begint te glijden. Begin met opnemen.
      2. Met behulp van een P-200 pipet, langzaam pipette 100 μL van de 65 °C planarian water post-faryngeally op de staart van de planarian om scrunching te induceren.
         LET OP: Zorg ervoor dat het verwarmde vediliaanse water op 65°C blijft. Verwarm het water indien nodig op tot 65°C voordat u met een ander experiment begint. Aangezien druk ook kan leiden tot scrunching, is langzame pipetting noodzakelijk. Pipetten kamertemperatuur water op dezelfde manier als in het experiment kan dienen als een controle en praktijk optie.
      3. Stop de opname zodra scrunching is gestopt. Plaats de planarian in een herstel container en de media uit te wisselen in de petrischaal met verse, kamertemperatuur planarian water als het uitvoeren van meer experimenten.
   3. Om scrunching via amputatie te induceren, breng een planarian naar het centrum van de arena en wacht tot de planaire oriënteert zich rechtop en begint glijden. Begin met opnemen.
      1. Amput de planarian met een schoon scheermesje. Amputaties kunnen overal worden gedaan langs de planarian, zolang de cut locatie is consistent over experimenten.
         OPMERKING: Scrunching parameters worden geëxtraheerd uit het voorste stuk. Vermijd dus het zicht van de camera op dit deel van de planarianen bij het aanbrengen van de snede door vanaf het achterste uiteinde te naderen. Plastic afdekslipjes werken ook goed voor het snijden en zijn een veiligere optie, vooral in een onderwijsomgeving.
      2. Stop de opname zodra het voorste stuk is gestopt met scrunching. Verwijder beide stukken, plaats ze in een aparte container en laat ze 7 dagen regenereren. Geamputeerde planarianen kunnen opnieuw worden opgenomen in de thuiscontainer zodra ze geregenereerd zijn.
   4. Om scrunching te induceren met behulp van bijna-UV-licht, bevestig de juiste filters (bijvoorbeeld Roscolux filters) aan de cameralens om de hoeveelheid gereflecteerd near-UV-licht dat wordt verzameld door de camera te verminderen en kan interfereren met de beeldvorming van de planarian de reactie. In plaats van het LED-paneel te gebruiken om de arena van onderaf te verlichten, gebruik je omgevingsrode verlichting waarvoor planarianen ongevoelig zijn³³.
      1. Vul een 100 mm petrischaalarena met planarian water en plaats een enkele planarian (5-9 mm) in het midden van de arena. Begin met opnemen op 10 FPS.
      2. Houd een UV-laseraanwijzer van klasse II (405 ± 10 nm, uitgangsvermogen <5 mW) ongeveer 30 cm van de arena. Plaats de laseraanwijzer in een hoek van 45° van de glijdende vlier en laat de laseraanwijzer vervolgens 5-10 seconden halverwege schijnen tussen het achterste uiteinde van de keelholte en de staartpunt om scrunching te veroorzaken.
         OPMERKING: De kracht van de laseraanwijzer kan worden gemeten met behulp van een bijna UV-gevoelige vermogensmeter.
      3. Wacht tot de planarian weer begint te glijden voordat u nog twee stimulaties van hetzelfde individu probeert te testen op reproduceerbaarheid van de reactie. Als de planarian hetzelfde gedrag blijft vertonen, stop dan met opnemen en stop de planarian terug in zijn container. Als het gedrag verandert tussen stimulaties, zullen aanvullende tests aantonen welke respons het meest prominent is.
         OPMERKING: Planarianen kunnen worden ongevoelig voor bijna-UV-licht en zal stoppen met reageren. Opeenvolgende stimulaties vereisen een rusttijd van 8-10 seconden.
2. Chemische stimulus (AITC)
   1. Om scrunching te induceren met behulp van een chemische stof, bijvoorbeeld, de TRPA1 agonist AITC²⁸, worden planarianen idealiter ondergedompeld in een bad van de chemische stof. Indien nodig kan pipetting worden toegepast zoals beschreven in punt 2.1.2.3.
      LET OP: AITC is ontvlambaar, acuut giftig, kan huid- en oogirritatie, ademhalings- en huidsensibilisatie veroorzaken en is gevaarlijk voor het waterleven. AITC olie moet worden behandeld in een rookkap. Voordat u voorraadoplossingen van AITC maakt, moet u passende PBM's (nitrilhandschoenen en een laboratoriumjas) aantrekken en passende afvalcontainers voor vloeibaar en vloeibaar gevaarlijk afval opzetten.
   2. Maak in een rookkap een 10 mM voorraadoplossing van AITC in planarian water in een 50 mL centrifugebuis. Deze voorraadoplossing is tot een maand bruikbaar wanneer deze bij 4°C wordt opgeslagen.
      1. Bereid uit deze voorraad een 25 mL werkoplossing van 100 μM AITC in planarian water in een 50 mL centrifuge buis. Deze 100 μM AITC oplossing zal worden gebruikt om scrunching in planarianen te induceren.
         OPMERKING: 100 μM AITC induceert consistente scrunching in D. japonica en S. mediterranea planarians²⁸. Voor andere aquatische planariërs kan 100 μM dienen als startconcentratie en kan dienovereenkomstig worden aangepast.
      2. De experimentele opstelling instellen (zie punt 1.1). Vul de arena met de AITC werkoplossing en plaats deze in een secundaire container. De secundaire container moet ten minste twee keer het volume van de arena bevatten.
         LET OP: Experimenten kunnen worden uitgevoerd in een rookkap voor extra veiligheid.
      3. Breng maximaal 10 planarianen naar het midden van de arena en beginnen met opnemen.
      4. Zodra de planarianen ongevoelig worden en stoppen met scrunching, stop met opnemen. Verwijder de planarianen uit de AITC-oplossing en spoel af (zie punt 1.1). Gooi vast en vloeibaar AITC-afval in geschikte afvalcontainers.
      5. Controleer de specificiteit van het antwoord op AITC met RNAi naar TRPA1²⁸ volgens standaardprotocollen.

Resultaten

Extraoculaire bijna-UV-waarneming in S. mediterranea planarians is TRPA1-afhankelijk en is voorgesteld om te worden gekoppeld aan H₂O₂ release¹⁷. Omdat H₂O₂ blootstelling trpa1-afhankelijke scrunching in S. mediterranea en D. japonica planarians²⁸induceert, kunnen de stappen in punt 2.1.4 worden gebruikt om te testen of blootstelling aan bijna-UV-licht bij beide soorten scrunching veroorzaakt. Terwijl

Discussie

Met behulp van dit protocol kan men kwantitatief de effecten van fysische en chemische stimuli^7,28,,29 of genetische manipulatie (RNAi)^28,29 op planaire bewegingsvrijheid bestuderen. Om de ruimtelijke resolutie te maximaliseren, is het het beste om de camera zo dicht mogelijk bij de arena te verplaatsen, terwijl de hele arena zich in het gezichtsveld bevindt. Om de doorv...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Allyl isothiocyanate, 95% (AITC)	Sigma-Aldrich	377430-5G	VOORZICHTIG:  Ontvlambaar en acuut toxisch; hanteer in een afzuigkap met geschikte PBE.
Camera lens, 2/3 25mm F/1.4	Tamron	23FM25SP
Cell culture plates, 6 well, tissue culture treated	Genesee Scientific	25-105
Centrifuge tubes, 50 mL polypropylene, steriele	MedSupply Partners	62-1019-2
Cinnamaldehyde, >95%	Sigma-Aldrich	W228613-100G-K
Dimmable A4 LED Tracer Light Box	Amazon	B07HD631RP
Flea3 USB3 camera	FLIR	FL3-U3-13E4M
Heat resistant gloves	Fisher Scientific	11-394-298
Hot plate	Fisher Scientific	HP88854200
Instant Ocean Sea Salt, bereid in gedeïoniseerd water	Instant Ocean	SS15-10	Bereid in gedeïoniseerd water op 0,5 g/L.
Montjüic zouten, bereid in Milli-Q water	Sigma-Aldrich	various	Bereid in milli-Q water op 1,6 mM NaCl, 1,0 mM CaCl2, 1,0 mM MgSO4, 0,1 mM MgCl2, 0,1 mM KCl, 1,2 mM NaHCO3; pas pH aan tot 7,0 met HCl.
Petri schotels, 100 mm x 20 mm, steriele polystyreen	Simport	D210-7
Pipette, 20-200 μL bereik	Rainin	17008652
PYREX 150 mL beker	Sigma-Aldrich	CLS1000150
Razor blade, 0,22 mm	VWR	55411-050
Roscolux kleurfilter:  Golden Amber	Rosco	R21	Alternatief: koop de Roscolux Designer Color Selector (Musson Theatrical product #SBLUX0306) die alle 3 kleurfilters bevat.
Roscolux kleurfilter:  Medium Red	Rosco	R27
Roscolux kleurfilter:  Storaro Red	Rosco	R2001
Samco transfer pipette, 62 µL grote opening	Thermo Fisher	691TS
Support stand	Fisher Scientific	12-947-976
Thermometer	VWR	89095-600
UV laser pointer	Amazon	B082DGS86R	Dit is een Klasse II laser (405nm ±10nm) met een uitgangsvermogen <5 mW.