Differentiatie van monocyten in fenotypisch verschillende macrofagen na behandeling met Human Cord Blood Stem Cell (CB-SC)-Afgeleide Exosomen

Samenvatting

Exosoom toepassing is een opkomende tool voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en regeneratieve geneeskunde. We stellen een exosoom isolatieprotocol op met een hoge zuiverheid om exosomen te isoleren van nieuw geïdentificeerde stamcellen genaamd CB-SC voor mechanistische studies. We cocultuur cb-sc-afgeleide exosomen met menselijke monocyten, wat leidt tot hun differentiatie in fenotypically verschillende macrofagen.

Samenvatting

Stamcel educator (SCE) therapie is een nieuwe klinische aanpak voor de behandeling van type 1 diabetes en andere auto-immuunziekten. SCE-therapie circuleert de bloedmononucleaire cellen van de geïsoleerde patiënt (bijvoorbeeld lymfocyten en monocyten) via een aferesemachine, co-culturen van de patiënt bloed mononucleaire cellen met aanhangende navelstrengbloed afgeleide stamcellen (CB-SC) in de SCE-apparaat, en vervolgens keert deze "opgeleide" immuuncellen naar het bloed van de patiënt. Exosomen zijn nano-sized extracellulaire vesicles tussen 30\u2012150 nm bestaande in alle biofluïde en celkweek media. Om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan SCE-therapie verder te onderzoeken en de acties van exosomen die vrijkomen bij CB-SC te bepalen, onderzoeken we welke cellen deze exosomen phagocytiseren tijdens de behandeling met CB-SC. Door dio-gelabelde CB-SC-afgeleide exosomen met menselijke perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC) mede te kweken, ontdekten we dat cb-SC-afgeleide exosomen voornamelijk werden overgenomen door menselijke CD14-positieve monocyten, wat leidde tot de differentiatie van monocyten in type 2 macrofagen (M2), met spindelachtige morfologie en expressie van M2-geassocieerde oppervlaktemoleculaire markers. Hier presenteren we een protocol voor de isolatie en karakterisering van cb-SC-afgeleide exosomen en het protocol voor de co-cultuur van CB-SC-afgeleide exosomen met menselijke monocyten en het toezicht op M2 differentiatie.

Inleiding

Navelstrengbloedstamcellen (CB-SC) zijn uniek type stamcellen die zijn geïdentificeerd uit menselijk navelstrengbloed en onderscheiden zich van andere bekende soorten stamcellen zoals mesenchymale stamcellen (MSC) en hematopoietische stamcellen (HSC)¹. Op basis van hun unieke eigenschappen van immuunmodulatie en hun vermogen om zich strak aan het oppervlak van petrischaaltjes te houden, ontwikkelden we een nieuwe technologie die is aangewezen als Stem Cell Educator (SCE) therapie in klinische studies^2,3. Tijdens de SCE-therapie worden de perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC) van een patiënt verzameld en verspreid via een celafscheider en co-gekweekt met aanhangende CB-SC in vitro. Deze "opgeleide" cellen (CB-SC-behandelde PBMC) worden vervolgens teruggegeven aan de circulatie van de patiënt in een gesloten-lus systeem. Klinische studies hebben al aangetoond dat de klinische veiligheid en werkzaamheid van SCE-therapie voor de behandeling van auto-immuunziekten, waaronder type 1 diabetes (T1D)^2,4 en alopecia areata (AA)⁵.

Exosomen zijn een familie van nanodeeltjes met diameters variërend 30\u2012150 nm en bestaan in alle biofluïde en celkweek media⁶. Exosomen zijn verrijkt met vele bioactieve moleculen, waaronder lipiden, mRNAs, eiwitten en microRNAs (miRNA), en spelen een belangrijke rol in cel-tot-cel communicatie. De laatste tijd zijn exosomen aantrekkelijker geworden voor onderzoekers en farmaceutische bedrijven vanwege hun therapeutische mogelijkheden in klinieken^7,8,9. Onlangs hebben onze mechanistische studies aangetoond dat CB-SC-vrijgegeven exosomen bijdragen aan de immuunmodulatie van SCE therapie¹⁰.

Hier beschrijven we het protocol om het mechanisme van SCE-therapie te verkennen gericht op monocyten door CB-SC-vrijgegeven exosomen. Ten eerste werden door CB-SC vrijgegeven exosomen geïsoleerd van door CB-SC afgeleide geconditioneerde media met behulp van ultracentrifugeringsmethoden en gevalideerd door stromingscytometrie, western blot (WB) en dynamic light scattering (DLS). Ten tweede werden cb-SC-afgeleide exosomen gelabeld met een groene fluorescerende lipofiele kleurstof: Dio. Ten derde werden ze samen met PBMC gecoökt om de positieve percentages van dio-gelabelde CB-SC-afgeleide exosomen te onderzoeken op de verschillende subpopulaties van PBMC door flow cytometrie. Dit protocol biedt richtlijnen om de werking van exosomen te bestuderen die ten grondslag liggen aan de immuunmodulatie van stamcellen.

Protocol

Het protocol volgt de richtlijnen van de institutionele human research ethische commissie van Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health. Menselijke buffy jas bloed eenheden werden gekocht bij de New York Blood Center (New York, NY). Menselijke navelstrengbloed eenheden werden verzameld van gezonde donoren en gekocht bij Cryo-Cell International bloedbank (Oldsmar, FL). Zowel New York Blood Center als Cryo-Cell hebben alle accreditaties voor bloedcollecties en distributies ontvangen, met IRB-goedkeuring en ondertekende toestemmingsformulieren van donoren.

1. Celkweek en bereiding van door CB-SC afgeleid geconditioneerd medium

1. Breng 25 mL navelstrengbloed(Tabel van materialen) over meer dan 20 mL dichtheidsgradiënt medium (γ = 1.077) over in een conische buis van 50 mL.
2. Centrifuge bij 1.690 x g gedurende 20 minuten bij 20 °C in een slingerende bakrotor zonder rem.
3. Breng de mononucleaire cellaag (buffy coat) voorzichtig over naar een nieuwe 50 mL conische buis. Vul de conische buis met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tot 40 mL. Meng en centrifuge tot pelletcellen met 751 x g gedurende 10 minuten bij 20 °C.
4. Gooi de supernatant weg en voeg 15 mL ACK lyse buffer(Tabel van materialen)toe aan de celpellet. Cellen opnieuw ophangen door pipeting. Dan incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
   LET OP: Deze stap verwijdert de rode bloedcellen.
5. Vul de conische buis met 25 mL PBS. Centrifuge op 751 x g gedurende 5 min en gooi supernatant om pelleted mononucleaire cellen te verkrijgen.
6. Was 2x met 40 mL PBS om de resterende lysebuffer te verwijderen.
7. Centrifuge op 751 x g gedurende 5 min om de cellen pellet.
8. Gooi de supernatant weg en schort snoerbloedmononucleaire cellen opnieuw op met 10 mL chemisch gedefinieerd serumvrij medium(Tabel van materialen)per buis.
9. Combineer navelstrengbloed mononucleaire cellen tot één buis.
10. Neem 20 μL celsuspensie en meng met 20 μL van 0,4% trypanblauwe oplossing(Tabel van materialen)in een buis van 1,5 mL.
11. Laad in de kamerdia en kwantificeer het celnummer en de levensvatbaarheid van de cel met een geautomatiseerde celteller.
    OPMERKING: Celsuspensie wordt verdund bij 1:10 als de celconcentratie hoger is dan 1 x 10⁷ cellen/mL.
12. Zaadmononucleaire cellen in 150 mm x 15 mm petrischaaltjes bij 1 x 10⁶ cellen/mL, 25 mL/schotel in chemisch gedefinieerd serumvrij celkweekmedium.
13. Incubeer bij 37 °C onder 8% CO_{2-omstandigheden} gedurende 10\u201214 dagen tot CB-SC meer dan 80% samenvloeiing bereikt.
14. Gooi de supernatant weg en was met 15 mL PBS per petrischaaltje; Verwijder vervolgens de PBS.
    LET OP: CB-SC zijn stevig aan petrischaaltjes bevestigd.
15. Herhaal stap 1.14 twee keer.
16. Voeg 25 mL chemisch gedefinieerd serumvrij medium per petrischaaltje toe.
17. Incubeer bij 37 °C onder 8% CO_{2-omstandigheden} gedurende 3\u20124 dagen.
18. Verzamel het CB-SC-afgeleide geconditioneerde medium in 50 mL conische buizen.

2. Karakterisering van CB-SC

1. Maak CB-SC los door 10 mL op PBS gebaseerde celdissociatiebuffer op en neer te spuiten met een pipetpunt van 5 mL(Tabel van materialen).
2. Centrifuge met 1.690 x g gedurende 5 minuten aan pelletcellen en opnieuw op te schorten in 200 μL PBS.
3. Fix en permeabilize cellen voor intracellulaire vlekken via kleuring voorbereiding kit(Tabel van materialen).
4. Voeg 5 μL Fc-blokker(Tabel van materialen)per monster toe en broed gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
   OPMERKING: De fc-blokker remt niet-specifieke binding bij het beitsen met antilichamen.
5. Voeg fluorescentie-geconjugeerde muis anti-menselijke monoklonale antilichamen, waaronder CD34, CD45, SOX2, OCT3/4, CD270, en Galectin 9 op 25 μg /mL (Tabel van materialen) tot 100 μL volume van de cellen. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met lichtbescherming.
6. Na het bevlekken, was cellen met 1 mL PBS en centrifuge op 751 x g gedurende 10 min tot pelletcellen.
7. Stel cellen opnieuw op met 200 μL PBS en breng over in een buis van 5 mL.
8. Voer stroomcytometrie uit om de expressie van CB-SC-geassocieerde boven specifieke markeringen te valideren.

3. Isolatie van uit CB-SC afgeleide exosomen

1. Centrifugeren het geconditioneerde medium verzameld van stap 1.18 bij 300 x g gedurende 10 min bij 4 °C. Breng de supernatant over naar een nieuwe 50 mL conische buis.
2. Centrifuge de supernatant verzameld van stap 3.1 op 2.000 x g gedurende 20 min bij 4 °C. Breng de supernatant over naar een nieuwe 50 mL conische buis.
3. Centrifuge de supernatant verzameld van stap 3.2 op 10.000 x g gedurende 30 min bij 4 °C. Breng de supernatant over naar een nieuwe 50 mL conische buis.
   LET OP: De rotor met vaste hoek wordt gebruikt zodat de celpellets aan de zijkant van de buis worden neergeslagen. Markeer de zijkant van de dop en teken een cirkel aan de zijkant van de buis waar de pellet wordt verwacht.
4. Filtersupernatants verzameld vanaf stap 3.3 met een filter van 0,22 μm (Tabel van materialen).
5. Breng 15 mL media over naar elke 10 kDa centrifugaalfiltereenheid(Tabel van materialen).
6. Centrifuge op 4.000 x g gedurende 30 minuten om de geconcentreerde exosoom media te isoleren.
7. Breng de geconcentreerde exosomen over naar een ultracentrifugebuis. Dan, pellet exosomen op 100.000 x g gedurende 80 min bij 4 °C.
8. Gooi de supernatant weg en hang de pelletexosomen opnieuw op in 10 mL PBS.
9. Centrifuge bij 100.000 x g gedurende 80 minuten bij 4 °C om de exosomenpellet te verzamelen.
10. Schort de exosomenpel opnieuw op in 200 μL PBS door op en neer te pipetten.

4. Karakterisering van uit CB-SC afgeleide exosomen

1. Kwantificeren van de totale eiwitconcentratie van exosoompreparaat door bicinchoninic acid assay (BCA) kit
   1. Pipette 10 μL van elk albumin standaard en geïsoleerd exosoom monster bereid in stap 3.10 in een 96-put plaat in duplicaat.
   2. Voeg 200 μL van het werkende reagens uit de BCA-kit toe aan elke put. Meng de inhoud van de plaat grondig op de plaatshaker gedurende 10 s.
      OPMERKING: Werkreagens (WR): 50-delige reagens A met 1-delige reagens B.
   3. Bedek de platen met folie en broed ze 30 minuten bij 37 °C.
   4. Koel de platen af op kamertemperatuur (RT).
   5. Meet monsterabsorptie op 562 nm via een plaatlezer.
2. Bereiding en kleuring van exosomen voor stroomcytometrie
   1. Leg exosomen vast door 20 μL anti-menselijke CD63 magnetische kralen (4,5 μm grootte)(Tabel van materialen)toe te voegen aan 25 μg cb-SC-afgeleide exosomen bereid in stap 3.10 in totaal 100 μL volume pbs.
   2. Incubeer de buis 's nachts (18\u201222 h) bij 4 °C op de shaker bij 800 rpm.
   3. Centrifugeren de buis op 300 x g voor 30 s om het monster te verzamelen aan de onderkant van de buis.
   4. Voeg 300 μL isolatiebuffer (0,1% runderserum albumine (BSA) toe in PBS) en meng voorzichtig door pipetting.
      OPMERKING: Deze stap wast de kralengebonden exosomen.
   5. Plaats de buis 1 min op een magneetstandaard (Tabel van materialen) en gooi de supernatant weg.
   6. Herhaal stap 4.2.4\u20124.2.5.
   7. Schort de kralengebonden exosomen opnieuw op met 400 μL isolatiebuffer.
   8. Aliquot 100 μL kraalgebonden exosomen aan elke buis.
   9. Voeg fluorescentie-geconjugeerde antilichamen (CD9-FITC, CD81-PE en CD63-FITC op respectievelijk 25 μg/mL) toe aan elke stroombuis met CD63-kraal-gevangen exosomen.
      OPMERKING: Isotype-matched IgGs dienen als negatieve controles.
   10. Incubeer gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur met lichtbescherming op de shaker bij 800 rpm.
   11. Herhaal stap 4.2.4\u20124.2.5.
   12. Schort de kraalgebonden exosomen opnieuw op in 200 μL isolatiebuffer en breng over op 5 mL-stroombuizen.
   13. Plaats de buizen in de monstercarrousel van de stroomcytometer.
   14. Open het protocol voor exosoomtesten.
   15. Voer het monster automatisch uit met stroomcytometer.
3. Exosoom detectie door westerse vlek
   OPMERKING: Westerse vlek is een gevestigde methode en we zullen niet ingaan op details van de methode zelf.
   1. Lyse de pellets van CB-SC-afgeleide exosomen van stap 3.10 met 100 μL RIPA buffer, pipet 20x, dan plaats op ijs gedurende 5 min.
   2. Kwantificeer de eiwitconcentratie exosoom lysaat door BCA kit en laad 25 μg eiwit per put.
   3. Scheid de eiwitten door gel elektroforese gedurende 40 min bij 150 V.
   4. Breng het eiwit over op polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan met behulp van semi-droge overdrachtsmethode¹¹.
   5. Blokkeer het membraan met 5% vetvrije melk gedurende 30 minuten.
   6. Incubeer met 2 μg/mL anti-menselijke Alix (Tabel van materialen) en 1 μg/mL anti-menselijke Calnexin antilichamen ( Tabel vanmaterialen).
   7. Detecteer het eiwit door chemiluminescentie met een digitaal beeldvormingssysteem.
4. Exosoomvalidatie door dynamic light scattering (DLS)
   1. Verdun 10 μg uit CB-SC-afgeleide exosoommonsters in 1 mL PBS.
   2. Breng het verdunde monster 1 mL over in wegwerp halfmicro cuvette(Tabel van materialen).
   3. Plaats de cuvette in het DLS-instrument. Stel de brekingsindex (RI) in als 1,39 voor alle voorbeeldmonitor.
   4. Voer monsters uit bij 25 °C en verkrijg drie metingen per fractie om een gemiddelde grootteverdeling te krijgen.
5. Exosoomvalidatie door transmissieelektronenmicroscopie (TEM)
   1. Coat formvar op 300 mesh koperen roosters¹² (Tabel van materialen).
   2. Versterk de formvar met de extra laag verdampte koolstof op koperen roosters¹².
      LET OP: Een dergelijke coatingbenadering is uitstekend geschikt voor monsterondersteuning.
   3. Laad 10 μL exosoommonsters op roosters en laat aan de lucht drogen.
   4. Negatief vlekken monsters met uranyl acetaat gedurende 5 min.
   5. Was drie keer met DI-water en laat het drogen aan de lucht.
   6. Observeer en fotografeer de monsters onder TEM. Stel de acceleraterende spanning in op 200 kV en spotgrootte op 2.

5. Maatregel Meting met het label CB-SC-afgeleide exosomen van de verschillende subpopulaties van PBMC

1. Label CB-SC-afgeleide exosomen met groene fluorescerende lipofiele kleurstof Dio
   1. Breng 100 μg uit CB-SC-afgeleide exosomen (bereid in stap 3.10) over in een centrifugebuis van 15 mL.
   2. Verdun het monster met PBS tot 5 mL.
   3. Voeg groene fluorescerende lipofiele kleurstof Dio (Tabel van materialen) tot de werkconcentratie 5 μM bereikt.
   4. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht.
   5. Breng het monster in een ultracentrifugebuis.
   6. Centrifuge met 100.000 x g gedurende 80 minuten om dio-gelabelde CB-SC-afgeleide exosomen te pelleteren.
   7. Schort de gelabelde exosomen opnieuw op in 200 μL PBS.
2. Voorbereiding van menselijke PBMC
   1. Breng 25 mL menselijke buffycoat(Tabel van materialen)over meer dan 20 mL dichtheidsgradiënt medium (γ = 1.077) over in een 50 mL conische buis.
   2. Herhaal stap 1.2 tot en met 1.11.
   3. Breng 1 x 10⁶ PBMC over in een niet-weefselbehandelde hydrofobe 24-putplaat (1 mL/put).
      OPMERKING: Een niet-weefsel behandelde plaat werd gebruikt om te voorkomen dat het aanhangen van monocyten.
3. Co-cultuur Dio-gelabelde exosomen met PBMC
   1. Breng 40 μL Dio-gelabelde CB-SC-afgeleide exosomen die in stap 5.1.7 zijn bereid, over naar elke PBMC-bevattende put in een 24-putplaat met behulp van een pipet van 200 μL. Voeg hetzelfde volume PBS toe om putten te bedienen.
   2. Meng door pipetting 10x. Incubeer voor 4 uur.
   3. Verzamel 200 μL exosoombehandelde PBMC en label met Hoechst 33342 gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
   4. Centrifuge op 300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gooi de supernatant weg en hang de celpellet opnieuw op in 100 μL PBS.
   5. Zet cellen op microscoopdia's.
   6. Observeer en fotografeer de interactie van door Dio gelabelde CB-SC-afgeleide exosomen met Hoechst 33342-label PBMC met behulp van een microscoop.
   7. Breng de resterende cellen van stap 5.3.3 over in een buis van 1,5 mL.
   8. Centrifuge bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Gooi de supernatant weg en hang de celpellet opnieuw op in 200 μL PBS.
   9. Voeg 5 μL Fc-blokker per monster toe. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
   10. Voeg antilichamen (CD3, CD4, CD8, CD11c, CD14, CD19 en CD56 op 25 μg/mL) toe aan vlek PBMC.
       OPMERKING: Isotype-matched IgGs dienen als negatieve controles.
   11. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met lichtbescherming.
   12. Voeg 1 mL PBS en centrifuge toe bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om de cellen te pelleteren.
   13. Schort de cellen opnieuw op met 200 μL PBS. Voeg 5 μL propidium jodide toe.
   14. Gebruik stroomcytometrie om het niveau van dio-gelabelde exosoomopname in verschillende subpopulatie van PBMC te evalueren.

6. Onderzoek de werking van uit CB-SC afgeleide exosomen op monocyten

1. Isolatie menselijke CD14-positieve monocyten
   1. Breng 3 x 10⁷ menselijke PBMC over in een 15 mL buis.
   2. Centrifuge bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
   3. Plaats de scheidingskolom (Tabel van materialen) in de magneetafscheider ( Tabel vanmaterialen).
   4. Was scheidingskolommen drie keer met 2 mL koude lopende buffer(Tabel van Materialen).
   5. Schort de cellen opnieuw op in 300 μL koude PBS. Voeg 60 μL CD14 microbeads toe. Meng goed en broed op ijs gedurende 15 minuten.
   6. Voeg 6 mL koude PBS toe. Centrifuge bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
   7. Stel de pelletvormige cellen opnieuw op in 500 μL koude lopende buffer.
   8. Breng cellen over naar de scheidingskolom (voorbereid in stap 6.14) en laat ze passeren.
   9. Was de scheidingskolom drie keer met 2 mL lopende buffer per wasbeurt. Til de kolom van de magneetafscheider en plaats deze in een centrifugebuis van 15 mL.
      OPMERKING: De buis van 15 mL moet op ijs worden geplaatst vanwege de hechting van CD14-positieve monocyten aan de buis bij kamertemperatuur.
   10. Breng 2 mL koude lopende buffer naar de bovenkant van de kolom en isoleren van de CD14-positieve cellen in de 15 mL buis.
   11. Centrifuge bij 300 x g gedurende 10 min bij 4 °C om de CD14-positieve cellen te pelleteren.
   12. Schort de cellen opnieuw op met 2 mL koud chemisch gedefinieerd serumvrij medium(Tabel van materialen).
   13. Breng 50 μL cellen over in een buis van 1,5 mL.
   14. Vlek met 10 μL krome oranje geconjugeerde anti-menselijke CD14 mAb (Tabel van materialen) gedurende 20 min.
       OPMERKING: Isotype-matched IgGs dienen als negatieve controles.
   15. Voeg 1 mL PBS toe aan de cellen. Centrifuge op 300 x g gedurende 10 min tot pelletcellen.
   16. Stel cellen opnieuw op in 200 μL PBS en breng deze over naar een buis van 5 mL. Bepaal de zuiverheid van CD14-positieve monocyten door flow cytometrie.
2. Behandeling van monocyten met uit CB-SC-afgeleide exosomen
   1. Zaad 1 x 10⁶ gezuiverde monocyten met chemisch gedefinieerd serumvrij kweekmedium (Tabel van materialen) in weefselkweekbehandelde 6-putplaat (2 mL/well).
   2. Incubeer voor 2 uur bij 37 °C onder 5% CO₂.
   3. Gooi de supernatant met 1 mL pipet weg. Voeg 2 mL van 37 °C voorverwarmd chemisch gedefinieerd serumvrij kweekmedium(Tabel van materialen)voorzichtig toe.
      LET OP: Monocyten werden binnen 2 uur aan de plaat gehangen. Drijvende cellen werden geïdentificeerd als dode of andere celverontreinigingen.
   4. Voeg 80 μg CB-SC-afgeleide exosomen geïsoleerd van stap 3.10 tot monocyte culturen in een 6-well plaat met een totaal volume van 2 mL.
      OPMERKING: Hetzelfde volume PBS is toegevoegd om putten te bedienen.
   5. Incubeer bij 37 °C onder 5% CO₂ gedurende 3\u20124 dagen.
   6. Fotografeer de celmorfologie met behulp van een omgekeerde microscoop op 200× vergroting (Tabel van materialen).
   7. Maak cellen los door op en neer te pipetten in 1 mL van een PBS-gebaseerde celdissociatiebuffer met 1 mL pipetpunt.
   8. Oogst de resterende cellen via een celschraper.
      OPMERKING: Aangezien primaire monocyten of gedifferentieerde macrofagen stevig hechten, blijven sommige cellen na de behandeling aan de onderkant kleven met dissociatiebuffer. Daarom worden deze cellen geoogst met een celschraper.
   9. Verzamel cellen op 1.690 x g gedurende 5 minuten. Cellen opnieuw opschorten in 200 μL PBS.
   10. Voeg 5 μL Fc blocker (25 μg/mL) toe om niet-specifieke binding te blokkeren.
   11. Voeg antilichamen (CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 en CD209 op 25 μg/mL, Tabel van Materialen)toe aan cellen. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
       OPMERKING: Isotype-matched IgGs dienen als negatieve controle
   12. Voeg 1 mL PBS toe aan cellen en centrifuge op 300 x g gedurende 10 minuten. Gooi de supernatant weg en schors opnieuw met 200 μL PBS.
   13. Voeg 5 μL propidiumjodide per monster (200 μL) toe en breng cellen over naar een nieuwe 5 mL-stroombuis.
   14. Voer de stroomcytometrie uit en evalueer de niveaus van cd14-, CD80-, CD86-, CD163-, CD206- en CD209-expressies.

Resultaten

Aanvankelijk werden het fenotype en de zuiverheid van CB-SC onderzocht door stromingscytometrie met CB-SC-geassocieerde markers zoals leukocyten gemeenschappelijk antigeen CD45, ES-celspecifieke transcriptiefactoren OCT3/4 en SOX2. CB-SC tonen hoge niveaus van CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 en galectine 9 expressie, maar geen uitdrukking van CD34 (Figuur 1A). Flow cytometrie analyse bevestigde de expressie van exosoom-specifieke markers, waaronder CD9, CD81, en CD63 waren op CB-SC-afgeleide exoso...

Discussie

Toepassing van exosomen is een opkomend gebied voor klinische diagnose, medicijnontwikkelingen en regeneratieve geneeskunde. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol met betrekking tot de voorbereiding van cb-SC-afgeleide exosomen en de functionele studie van exosomen over de differentiatie van menselijke monocyten. Het huidige protocol toonde aan dat functionele CB-SC-afgeleide exosomen worden geïsoleerd door sequentiële centrifugatie en ultracentrifugatie met een hoge zuiverheid en het vertonen van de immuunmodul...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1.5 ml Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	05-408-129
15 ml conical tube	Falcon	352196
24-well plate	Falcon	351147	Non-tissue culture plate
3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio)	Millipore sigma	D4292-20MG	Bewaar bij 4 °C
300 Mesh Grids	Ted Pella	1GC300
50 mL conical tube	Falcon	352070
6-well plate	Falcon	353046	Tissue culture plate
96-well plate	Falcon	353072	Tissue culture plate
ACK Lysis Buffer	Lonza	10-548E	100 ml
Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit	Millipore sigma	UFC901024
Anti-Human Alix	Biolegend	634501	bewaar bij 4 °C, RRID: AB_2268110
Anti-Human Calnexin	Biolegend	699401	bewaar bij 4 °C, RRID: AB_2728519
Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7	BD Bioscience	561356	bewaar bij 4 °C, RRID: AB_10611859
Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange	Beckman Coulter	B36294	bewaar bij 4 °C, RRID: AB_2728099
Anti-Human CD163 antibody, PE	BD Bioscience	556018	bewaar bij 4 °C, RRID: AB_396296
Anti-Human CD19 antibody, PC5	Beckman Coulter	IM2643U	bewaar bij 4 °C, RRID: AB_131160
Anti-Human CD206 antibody, FITC	BD Bioscience	551135	bewaar bij 4 °C, RRID: AB_394065
Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421	BD Bioscience	564127	bewaar bij 4 °C, RRID: AB_2738610
Anti-Human CD270 antibody, PE	Biolegend	318806	bewaar bij 4 °C, RRID: AB_2203703
Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue	Biolegend	300431	bewaar bij 4 °C, RRID: AB_1595437
Anti-Human CD34 antibody, APC	Beckman Coulter	IM2427U	bewaar bij 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD4 antibody, APC	BD Bioscience	555349	bewaar bij 4 °C, RRID: AB_398593
Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7	Beckman Coulter	IM3548U	bewaar bij 4 °C, RRID: AB_1575969
Anti-Human CD56 antibody, PE	Beckman Coulter	IM2073U	bewaar bij 4 °C, RRID: AB_131195
Anti-Human CD63 antibody,PE	BD Bioscience	561925	bewaar bij 4 °C, RRID: AB_10896821
Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750	Beckman Coulter	A94686	bewaar bij 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD80 antibody, APC	Beckman Coulter	B30642	bewaar bij 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD81 antibody, FITC	BD Bioscience	561956	bewaar bij 4 °C, RRID: AB_394049
Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750	Beckman Coulter	B30646	bewaar bij 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD9 antibody, FITC	ThermoScientic	MA5-16860	bewaar bij 4 °C, RRID: AB_2538339
Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421	Biolegend	348919	bewaar bij 4 °C, RRID: AB_2716134
Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660	ThermoScientic	50-5841-82	bewaar bij 4 °C, RRID: AB_11218882
Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488	ThermoScientic	53-9811-82	bewaar bij 4 °C, RRID: AB_2574479
BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23227
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A1933
Buffy coat	New York Blood Center		40-60 ml/unit
Cell scraper	Falcon	353085
Disposable semi-micro cuvette	VWR	97000590
Dissociation buffer	Gibco	131510014	100 ml
Dual-Chanber cell counting slides	Bio-Rad	1450015
Exosome-Human CD63 Detection reagent	ThermoFisher Scientific	10606D	bewaar bij 4 °C
Ficoll-Paque PLUS density grandient media	GE Health	17-1440-03	500 ml
Fixed-Angle Rotor(25°)	Thermo Scientifc	75003698	Maxium 24,700 x g
Gallios flow cytometer	Beckman Coulter		3 lasers 10 Color Max
Human cord blood	Cryo-Cell International		40-100 ml/unit
Human Fc Block	BD Bioscience	564220	bewaar bij 4 °C
Immun-Blot PVDF membrane	Bio-Rad	1620177
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm	Millipore Sigma	SLGP033RS
Optima XE-90 Ultracentriguge	Beckman Coulter