Exosoom toepassing is een opkomende tool voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en regeneratieve geneeskunde. We stellen een exosoom isolatieprotocol op met een hoge zuiverheid om exosomen te isoleren van nieuw geïdentificeerde stamcellen genaamd CB-SC voor mechanistische studies. We cocultuur cb-sc-afgeleide exosomen met menselijke monocyten, wat leidt tot hun differentiatie in fenotypically verschillende macrofagen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Differentiatie van monocyten in fenotypisch verschillende macrofagen na behandeling met Human Cord Blood Stem Cell (CB-SC)-Afgeleide Exosomen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Stamcel educator (SCE) therapie is een nieuwe klinische aanpak voor de behandeling van type 1 diabetes en andere auto-immuunziekten. SCE-therapie circuleert de bloedmononucleaire cellen van de geïsoleerde patiënt (bijvoorbeeld lymfocyten en monocyten) via een aferesemachine, co-culturen van de patiënt bloed mononucleaire cellen met aanhangende navelstrengbloed afgeleide stamcellen (CB-SC) in de SCE-apparaat, en vervolgens keert deze "opgeleide" immuuncellen naar het bloed van de patiënt. Exosomen zijn nano-sized extracellulaire vesicles tussen 30\u2012150 nm bestaande in alle biofluïde en celkweek media. Om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan SCE-therapie verder te onderzoeken en de acties van exosomen die vrijkomen bij CB-SC te bepalen, onderzoeken we welke cellen deze exosomen phagocytiseren tijdens de behandeling met CB-SC. Door dio-gelabelde CB-SC-afgeleide exosomen met menselijke perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC) mede te kweken, ontdekten we dat cb-SC-afgeleide exosomen voornamelijk werden overgenomen door menselijke CD14-positieve monocyten, wat leidde tot de differentiatie van monocyten in type 2 macrofagen (M2), met spindelachtige morfologie en expressie van M2-geassocieerde oppervlaktemoleculaire markers. Hier presenteren we een protocol voor de isolatie en karakterisering van cb-SC-afgeleide exosomen en het protocol voor de co-cultuur van CB-SC-afgeleide exosomen met menselijke monocyten en het toezicht op M2 differentiatie.
Inleiding
Navelstrengbloedstamcellen (CB-SC) zijn uniek type stamcellen die zijn geïdentificeerd uit menselijk navelstrengbloed en onderscheiden zich van andere bekende soorten stamcellen zoals mesenchymale stamcellen (MSC) en hematopoietische stamcellen (HSC)1. Op basis van hun unieke eigenschappen van immuunmodulatie en hun vermogen om zich strak aan het oppervlak van petrischaaltjes te houden, ontwikkelden we een nieuwe technologie die is aangewezen als Stem Cell Educator (SCE) therapie in klinische studies2,3. Tijdens de SCE-therapie worden de perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC) van een....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het protocol volgt de richtlijnen van de institutionele human research ethische commissie van Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health. Menselijke buffy jas bloed eenheden werden gekocht bij de New York Blood Center (New York, NY). Menselijke navelstrengbloed eenheden werden verzameld van gezonde donoren en gekocht bij Cryo-Cell International bloedbank (Oldsmar, FL). Zowel New York Blood Center als Cryo-Cell hebben alle accreditaties voor bloedcollecties en distributies ontvangen, met IRB-goedkeuring en ondertekende toestemmingsformulieren van donoren.
1. Celkweek en bereiding van door CB-SC afgeleid geconditioneerd med....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Aanvankelijk werden het fenotype en de zuiverheid van CB-SC onderzocht door stromingscytometrie met CB-SC-geassocieerde markers zoals leukocyten gemeenschappelijk antigeen CD45, ES-celspecifieke transcriptiefactoren OCT3/4 en SOX2. CB-SC tonen hoge niveaus van CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 en galectine 9 expressie, maar geen uitdrukking van CD34 (Figuur 1A). Flow cytometrie analyse bevestigde de expressie van exosoom-specifieke markers, waaronder CD9, CD81, en CD63 waren op CB-SC-afgeleide exoso.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Toepassing van exosomen is een opkomend gebied voor klinische diagnose, medicijnontwikkelingen en regeneratieve geneeskunde. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol met betrekking tot de voorbereiding van cb-SC-afgeleide exosomen en de functionele studie van exosomen over de differentiatie van menselijke monocyten. Het huidige protocol toonde aan dat functionele CB-SC-afgeleide exosomen worden geïsoleerd door sequentiële centrifugatie en ultracentrifugatie met een hoge zuiverheid en het vertonen van de immuunmodul.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Dr Zhao is een oprichter van Tianhe Stem Cell Biotechnology Inc Dr Zhao is een uitvinder van Stem Cell Educator technologie. Alle andere auteurs hebben geen financiële belangen die relevant kunnen zijn voor het ingediende werk.
Dankbetuigingen
We zijn de heer Poddar en de heer Ludwig dankbaar voor de genereuze financiering via Hackensack UMC Foundation. We waarderen Laura Zhao voor Engelse montage.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1.5 ml Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352196 | |
| 24-well plate | Falcon | 351147 | Non-tissue culture plate |
| 3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio) | Millipore sigma | D4292-20MG | Bewaar bij 4 °C |
| 300 Mesh Grids | Ted Pella | 1GC300 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | Tissue culture plate |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | Tissue culture plate |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | 100 ml |
| Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit | Millipore sigma | UFC901024 | |
| Anti-Human Alix | Biolegend | 634501 | bewaar bij 4 °C, RRID: AB_2268110 |
| Anti-Human Calnexin | Biolegend | 699401 | bewaar bij 4 °C, RRID: AB_2728519 |
| Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7 | BD Bioscience | 561356 | bewaar bij 4 °C, RRID: AB_10611859 |
| Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange | Beckman Coulter | B36294 | bewaar bij 4 °C, RRID: AB_2728099 |
| Anti-Human CD163 antibody, PE | BD Bioscience | 556018 | bewaar bij 4 °C, RRID: AB_396296 |
| Anti-Human CD19 antibody, PC5 | Beckman Coulter | IM2643U | bewaar bij 4 °C, RRID: AB_131160 |
| Anti-Human CD206 antibody, FITC | BD Bioscience | 551135 | bewaar bij 4 °C, RRID: AB_394065 |
| Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421 | BD Bioscience | 564127 | bewaar bij 4 °C, RRID: AB_2738610 |
| Anti-Human CD270 antibody, PE | Biolegend | 318806 | bewaar bij 4 °C, RRID: AB_2203703 |
| Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue | Biolegend | 300431 | bewaar bij 4 °C, RRID: AB_1595437 |
| Anti-Human CD34 antibody, APC | Beckman Coulter | IM2427U | bewaar bij 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD4 antibody, APC | BD Bioscience | 555349 | bewaar bij 4 °C, RRID: AB_398593 |
| Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7 | Beckman Coulter | IM3548U | bewaar bij 4 °C, RRID: AB_1575969 |
| Anti-Human CD56 antibody, PE | Beckman Coulter | IM2073U | bewaar bij 4 °C, RRID: AB_131195 |
| Anti-Human CD63 antibody,PE | BD Bioscience | 561925 | bewaar bij 4 °C, RRID: AB_10896821 |
| Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | A94686 | bewaar bij 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD80 antibody, APC | Beckman Coulter | B30642 | bewaar bij 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD81 antibody, FITC | BD Bioscience | 561956 | bewaar bij 4 °C, RRID: AB_394049 |
| Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | B30646 | bewaar bij 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD9 antibody, FITC | ThermoScientic | MA5-16860 | bewaar bij 4 °C, RRID: AB_2538339 |
| Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421 | Biolegend | 348919 | bewaar bij 4 °C, RRID: AB_2716134 |
| Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660 | ThermoScientic | 50-5841-82 | bewaar bij 4 °C, RRID: AB_11218882 |
| Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoScientic | 53-9811-82 | bewaar bij 4 °C, RRID: AB_2574479 |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A1933 | |
| Buffy coat | New York Blood Center | 40-60 ml/unit | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Disposable semi-micro cuvette | VWR | 97000590 | |
| Dissociation buffer | Gibco | 131510014 | 100 ml |
| Dual-Chanber cell counting slides | Bio-Rad | 1450015 | |
| Exosome-Human CD63 Detection reagent | ThermoFisher Scientific | 10606D | bewaar bij 4 °C |
| Ficoll-Paque PLUS density grandient media | GE Health | 17-1440-03 | 500 ml |
| Fixed-Angle Rotor(25°) | Thermo Scientifc | 75003698 | Maxium 24,700 x g |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | 3 lasers 10 Color Max | |
| Human cord blood | Cryo-Cell International | 40-100 ml/unit | |
| Human Fc Block | BD Bioscience | 564220 | bewaar bij 4 °C |
| Immun-Blot PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Optima XE-90 Ultracentriguge | Beckman Coulter | ||
Referenties
- Zhao, Y. Stem cell educator therapy and induction of immune balance. Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).
- Zhao, Y., et al. Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration followin....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
