Methodenartikel

Superresolutie live celbeeldvorming van subcellulaire structuren

DOI:

10.3791/61563

⸱

13 januari 2021

 , 
1Department of Biology, The Johns Hopkins University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor superresolutie live-cell imaging in intact weefsel. We hebben de voorwaarden gestandaardiseerd voor beeldvorming van een zeer gevoelige volwassen stamcelpopulatie in zijn inheemse weefselomgeving. Deze techniek omvat het balanceren van temporele en ruimtelijke resolutie om de directe observatie van biologische verschijnselen in levend weefsel mogelijk te maken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er is al lang een cruciale afweging tussen ruimtelijke en temporele resolutie in beeldvorming. Beeldvorming buiten de diffractiegrens van licht is traditioneel beperkt tot alleen te gebruiken op vaste monsters of levende cellen buiten weefsel gelabeld met een sterk fluorescerend signaal. De huidige live celbeeldvormingstechnieken met superresolutie vereisen het gebruik van speciale fluorescentiesondes, hoge verlichting, meerdere beeldverwervingen met verwerking na acquisitie of vaak een combinatie van deze processen. Deze vereisten beperken de biologische monsters en contexten waarop deze techniek kan worden toegepast aanzienlijk.

Hier beschrijven we een methode om superresolutie (~ 140 nm XY-resolutie) time-lapse fluorescentie live celbeeldvorming in situ uit te voeren. Deze techniek is ook compatibel met een lage fluorescerende intensiteit, bijvoorbeeld EGFP of mCherry endogene tagged at lowly expressed genes. Als proof-of-principle hebben we deze methode gebruikt om meerdere subcellulaire structuren in de Drosophila testis te visualiseren. Tijdens weefselvoorbereiding worden zowel de cellulaire structuur als de weefselmorfologie gehandhaafd binnen de ontlede testis. Hier gebruiken we deze techniek om de dynamiek van microtubuli, de interacties tussen microtubuli en het kernmembraan, evenals de aanhechting van microtubuli aan centromeren in beeld te brengen.

Deze techniek vereist speciale procedures bij monstervoorbereiding, monstermontage en immobilisatie van monsters. Bovendien moeten de monsters na dissectie enkele uren worden bewaard zonder de cellulaire functie en activiteit in gevaar te brengen. Hoewel we de omstandigheden voor live superresolutiebeeldvorming specifiek in Drosophila mannelijke kiembaanstamcellen (GSC's) en voorloperkiemcellen in ontleed testisweefsel hebben geoptimaliseerd, is deze techniek breed toepasbaar op een verscheidenheid aan verschillende celtypen. Het vermogen om cellen onder hun fysiologische omstandigheden te observeren zonder in te boeten aan ruimtelijke of temporele resolutie zal dienen als een onschatbaar hulpmiddel voor onderzoekers die cruciale vragen in de celbiologie willen beantwoorden.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het visualiseren van subcellulaire structuren en eiwitdynamiek in levende cellen met een resolutie voorbij de diffractiegrens van licht is meestal zeer uitdagend1-3. Terwijl meerdere superresolutietechnieken zoals Stochastische-Optische-Reconstructie-Microscopie (STORM), Foto-Geactiveerde-Lokalisatie-Microscopie (PALM) en Gestimuleerde-Emissie-Uitputting (STED)4,5,6 microscopie zijn ontwikkeld, beperken complicaties in de monstervoorbereiding evenals de noodzaak om levensvatbaarheid en activiteit ex vivo te behouden, het gebruik van conventionele superresolutiemicroscopie voor het weergeven van levende monsters. Conventionele confocale microscopie kan geen ruimtelijke resolutie bereiken die verder gaat dan ~230 nm XY-resolutie en is vaak onvoldoende om ingewikkelde cellulaire substructuren5,6te observeren . Een recente ontwikkeling in confocale microscopie, Airyscan superresolutiebeeldvorming, kan echter ongeveer 140 nm (XY-resolutie)7,8 bereiken en heeft een relatief eenvoudig monstervoorbereiding dat compatibel is met live beeldvorming. Aangezien dit beelddetectiesysteem een lange acquisitietijd vereist, gaat de hoge ruimtelijke resolutie ten koste van tijdresolutie9. Daarom is een methode nodig om ervoor te zorgen dat live cell imaging wordt uitgebreid met een hoge ruimtelijke resolutie.

Hier ontwikkelden we een methode voor het observeren van levende cellen in intact weefsel met de optimale resolutie om subcellulaire structuren te ontcijferen met gedetailleerde ruimtelijke informatie. Deze methode is zo ontworpen dat monsters gedurende een lange periode (~ 10 uur) stabiel kunnen worden gemonteerd zonder te bewegen of te degenereren. De live celmedia die in deze techniek worden gebruikt, kunnen de cellulaire functie ondersteunen en fotobleaching tot 10 uur vermijden onder een microscoop met superresolutie. Ten slotte minimaliseert dit protocol de meeste spanningen veroorzaakt door de constante verlichting van lasers over langere perioden, zoals hypoxie, veranderingen in vochtigheid en temperatuur, evenals uitputting van voedingsstoffen.

Met behulp van dit protocol om Drosophila mannelijke kiembaanstamcellen (GSC's) in beeld te brengen, konden we observeren hoe de asymmetrische activiteit van microtubuli preferentiële interactie mogelijk maakt met epigenetisch verschillende zusterchromatiden10,11,12,13. Dit soort cellulaire gebeurtenissen zijn zeer dynamisch en zijn zeer moeilijk te visualiseren in levende cellen met behulp van andere beeldvormingsmethoden met superresolutie, zoals STORM, PALM of STED. We verwachten dat deze methode zeer nuttig zal worden voor celbiologen, omdat ze de dynamische subcellulaire structuren van levende cellen in weefsels willen begrijpen. Er zijn veel gebieden waarop deze methode kan worden toegepast, zoals het bestuderen van de dynamiek van eiwitten; inzicht in de beweging van cellen; en lineage tracing en cellulaire differentiatieprocessen, naast andere mogelijke toepassingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Voorbereiding van live cell imaging cocktail (live cell media)

  1. Vul Schneider's Drosophila medium aan met 15% foetale runderserum (FBS) en 0,6x penicilline/streptomycine. Stel de pH in op ongeveer 7,0.
  2. Voeg vlak voor het gebruik van het medium insuline toe aan een eindconcentratie van 200 μg/ml.
    OPMERKING: Dit medium is van cruciaal belang voor het handhaven van een normale celdeling en ontwikkeling van de Drosophila-testis tijdens time-lapse beeldvorming10,14.

2. Bereiding van glazen bodemcelkweekschaal

  1. Gebruik een poly L-lysine gecoate glasbodemcelkweekschaal met een diameter van 35 mm voor de Drosophila testis. De binnenput van de schotel heeft een glazen bodem met een diameter van 23 mm en een zijde met een hoogte van 1 mm (figuur 1A-a).
    OPMERKING: Kies een schotel met glazen bodem die een kortere werkafstand, een groter numeriek diafragma en een hogere vergrotingsdoelstelling mogelijk maakt; deze functies zijn cruciaal om een afbeelding met een superresolutie te verkrijgen.
  2. Gebruik een dialysemembraan (MWCO: 12–14kD) dat de gasvormige uitwisseling mogelijk maakt. Snijd het membraan in kleine stukjes.
    OPMERKING: De membraanstukken moeten kleiner zijn dan het glasoppervlak van de schaal, maar groot genoeg om het monster te bedekken.
  3. Week het membraan met 100 μL levende celmedia gedurende ~ 5 minuten. Gebruik geen droog membraan op het monster, omdat dit het kan beschadigen. Membraan helpt hypoxische stress te voorkomen.
  4. Bereid 2-3 lichtgewicht glazen of plastic stukken voor om op het membraan te leggen, zodat het weefsel niet zal drijven. Om dit te doen, neemt u eerst de buitenste ring van de 50 ml centrifugebuis en snijdt u deze in kleine stukjes. Steriliseer vervolgens de stukken voor gebruik met 70% ethanol.
    OPMERKING: Deze stap zorgt ervoor dat het monster tijdens de beeldvorming op het oppervlak blijft en niet drijft, wat cruciaal is voor het verkrijgen van optimale resultaten.
  5. Maak een ring met een diameter van ~ 25 mm en plaats deze aan de verhoogde kant van de schaal. Doe er een deklip op om twee kamers te genereren. De onderste kamer bevat het monster, terwijl de bovenste kamer zal dienen als een vochtigheidskamer om te voorkomen dat het monster droogt.
    1. Om deze ring te maken, snijdt u de buitenste ring af van een centrifugebuis van 50 ml, waardoor deze stevig aan de verhoogde kant van de 35 mm-schotel past. Een vergelijkbare ring kan op andere manieren worden gemaakt, bijvoorbeeld door een elastiekje of plastic twistband te gebruiken om op de verhoogde kant van de schaal te passen om de hoeslip goed vast te houden zonder het monster te verstoren.
      OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang, vooral voor monsters die gevoelig zijn voor spanningen zoals hypoxische omstandigheden en veranderingen in temperatuur en vochtigheid.

3. Dissectie van teelballen van mannelijke vliegen en montage

  1. Neem ~ 10 jonge mannelijke vliegen (2-3 dagen oud) en ontleed de teelballen in de levende celmedia om ~ 10 paar Drosophila volwassen teelballen te verkrijgen.
    1. Ontleed de vliegen onder een dissectiemicroscoop in een dissectieschaal met behulp van fijne tang.
      OPMERKING: De Drosophila melanogaster (fruitvlieg) stam draagt UAS-α-Tubulin-GFP transgene aangedreven door een vroege kiemcel driver nanos-Gal4.
    2. Genereer de volgende knock-in Drosophila melanogaster stammen met behulp van de CRISPR-Cas9 technologie: Lamin-mCherry (C-terminal tag) en CENP-A-Dendra2-CENP-A [tag op de interne site (tussen 118e - 119e codon)].
      OPMERKING: Hoewel er slechts één testis van uitstekende kwaliteit nodig is voor elk experiment, zal het monteren van voldoende weefsel (15-20) of cellen ervoor zorgen dat er ten minste één gezond monster zal zijn met uitstekende fluorescentiesignalen voor time-lapse beeldvorming.
  2. Was de teelballen tweemaal in levende celmedia in de dissectieschaal.
    1. Gebruik een pipet om media toe te voegen, gevolgd door het verwijderen van de live celmedia als wasstap.
    2. Verwijder overtollig weefsel met een tang. Elk extra weefsel zal de beeldvorming verstoren.
      OPMERKING: Gebruik geen fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor het wassen, omdat dit de dynamiek van bepaalde cellulaire componenten kan beïnvloeden.
  3. Voeg 100-150 μL levende celmedia toe aan de schaal (bereid in stap 2.1) en verdeel deze over het glasoppervlak met behulp van een pipetpunt. Door de media op het oppervlak te verspreiden, kan het weefsel goed aan de schaal blijven plakken.
  4. Breng de teelballen met een fijne tang over in de schaal en breng ze naar het midden van de schaal (afbeelding 1A-b).
    OPMERKING: Vermijd het overbrengen van vuil omdat het de beeldvorming verstoort en de kwaliteit van het beeld kan verminderen.
  5. Verwijder overtollige levende celmedia (laat ongeveer 10 μL media achter) zodat het weefsel kan afvlakken en goed aan de schaal kan blijven plakken. Voer deze stap snel uit om te voorkomen dat het monster wordt gedroogd.
  6. Plaats het voorwettelijke membraan (voorbereid in stap 2.2 en 2.3) bovenop de teelballen (figuur 1A-c).
  7. Leg 2-3 kleine plastic gewichten (bereid in stap 2.4) op het membraan, zodat het monster niet drijft en voeg snel 100-150 μL levende celmedia toe (figuur 1A-d).
    OPMERKING: Het snel en voorzichtig toevoegen van media zorgt ervoor dat het monster niet uitdroogt of wordt verplaatst.
  8. Plaats de plastic ring (bereid in stap 2.5) op de verhoogde zijde van de schaal (Afbeelding 1B-a).
  9. Plaats een afdeklip van 22 mm x 22 mm op de ring (afbeelding 1B-b). Dit genereert twee kamers.
  10. Neem een stuk tissuepapier, bevochtig het met water, wervel het en leg het op de coverslip, om een vochtige kamer te creëren (Figuur 1B-c). Sluit het deksel van de schaal (afbeelding 1B-d) en begin met live celbeeldvorming.
    OPMERKING: Als het monster lichtgevoelig is, voert u sectie 3 in het donker uit.

4. Live cel beeldvorming van Drosophila mannelijke kiembaan stamcellen (GSC) in situ

  1. Plaats de schotel onder de superresolutiemicroscoop en zet deze vast met de podiumklemmen.
    1. Open de beeldvormingssoftware, schakel het verzonden licht in en gebruik 63x objectief om met de scherpstelknop op het testisweefsel te focussen.
      OPMERKING: Als het moeilijk is om een monster met de 63x-doelstelling te lokaliseren, gebruik dan eerst de 40x- of 20x-doelstelling voordat u overschakelt naar de 63x.
    2. Schakel de lasers in, klik op Liveen zoek het SGR met de optimale positie en conditie. Vermijd teelballen met een laag fluorescentiesignaal of laat de naaf (nis) van het oppervlak verwijderd zijn.
      OPMERKING: In Drosophila-testes zijn de GSC's aan de hub bevestigd.
  2. Pas de scherpstelling voor de GSC's aan en identificeer de juiste instellingen voor het monster, waaronder laservermogen, elektronenvermenigvuldiging (EM) versterking, middeling en zoom voor de Airyscan-modus. Gebruik de volgende instellingen als voorbeeld voor Drosophila-teelballen die EGFP-gelabelde α-tubuline in kiemcellen in een vroeg stadium uitdrukken.
    1. Stel de framegrootte in tussen 512 x 512 pixels en 1024 x 1024 pixels door op Framegroottete klikken.
    2. Stel het framegemiddelde in op 1 of 2 door op Gemiddeld teklikken .
      OPMERKING: Het vergroten van de framegrootte (>1024 x 1024 pixels) en het uitvoeren van meer middeling (d.w.z. meer dan 2) kan leiden tot fotobleaching of fototoxiciteit.
    3. Stel het laservermogen in op 1%-2% door op Laserste klikken.
      OPMERKING: Het verhogen van de laserkracht kan ook leiden tot fotobleaching of fototoxiciteit.
    4. Stel de EM-versterking in onder het aanbevolen niveau (< 800) door op Master Gainte klikken.
      OPMERKING: Een hogere EM-versterking kan artefacten genereren.
    5. Zoom in op de regio of cel van belang om de tijd voor het verkrijgen van afbeeldingen te verkorten en fotobleaching te verminderen. Hierdoor kan het exemplaar ook langer overleven.
  3. Start de time-lapse-afbeeldingsopname met de Airyscan-modus door op Experiment startente klikken.
    1. Voordat u op Experiment startenklikt, moet u ervoor zorgen dat de acquisitie optimaal is geconfigureerd.
    2. Als er een waarschuwing wordt weergegeven met de melding "Airyscan-acquisitie is niet optimaal geconfigureerd", klikt u op Optimaal in de sectie framegrootte, klikt u op Optimaal in de z-stacksectie en klikt u op Optimaal voor de sectie Scangebied (minimaal 1,3 zoom is vereist voor beeldvorming met superresolutie).
  4. Optimaliseer het tijdsinterval, het aantal z-slices en de duur van de time-lapse-beeldvorming volgens het experimentele ontwerp en het type specimen, zodat de kwaliteit van het beeld niet in gevaar komt en de cellen niet worden gearresteerd in bepaalde stadia van de celcyclus.
    1. Als voorbeeld worden de parameters voor de time-lapse-beeldvorming van Drosophila-teelballen die EGFP-gelabelde α-tubuline in vroege kiembaan uitdrukken, in de volgende stappen weergegeven.
    2. Voor meer dan 5 uur time-lapse beeldvorming, beeld op een interval van 10 minuten met 1% laservermogen en neem tot 30 z-slices op elk tijdstip.
    3. Voor zeer dynamische cellulaire processen, zoals microtubulidynamiek, stelt u een interval van 2 minuten in tussen tijdpunten, voert u 1-2 uur time-lapse-beeldvorming uit met 1% laservermogen en neemt u maximaal 30 z-slices in op elk tijdspunt.
    4. Voor zeldzame cellulaire gebeurtenissen, zoals anafase tot vroege telophase chromatine dynamica (2-3 min gebeurtenissen), stel live cel beeldvorming in met een interval van 1 min tussen tijdspunten, voer 30 min time-lapse beeldvorming uit met 1% laservermogen en neem tot 30 z-slices op elk tijdstip.
      OPMERKING: Deze parameters kunnen variëren voor verschillende monsters, dus wijziging is nodig voor optimaal gebruik van het specifieke monster.
  5. Voer timelapse-beeldvorming of live snapshot-beeldvorming uit, afhankelijk van de gevoeligheid van het monster en het experimentele ontwerp.
    OPMERKING: Een korte film duurt 15-30 minuten en een lange film is meer dan 5 uur.
  6. Als het monster zeer gevoelig is en niet kan worden bestudeerd door time-lapse-beeldvorming met een superresolutiemicroscoop, zoals vaak het geval is bij drosophila mannelijke GSC's, voert u een live snapshot met superresolutie (SRLS) van het monster uit in verschillende celcyclusstadia (zoals weergegeven in figuur 2, figuur 3, figuur 4).
    1. Als een zeldzame celbiologische gebeurtenis wordt vastgelegd of het eiwit van belang een laag expressieniveau heeft, voer dan SRLS uit.
    2. Zoek voor SRLS een cel in de specifieke celcyclusfase waarin u geïnteresseerd bent. Als u zich bijvoorbeeld concentreert op microtubuli-kinetochorebinding, gebruik dan een cel bij prometafase of metafase.
      OPMERKING: Dit zal helpen ervoor te zorgen dat u op het juiste moment een hoogwaardig beeld krijgt van de cel die van belang is zonder het risico van fototoxiciteit voor het monster of het bleken van de fluoroforen, die kunnen optreden tijdens een langere film.
    3. Als u SRLS gebruikt, geeft u verschillende celcyclusfasen van belang weer voor meerdere cellen en rangschikt u deze afbeeldingen in chronologische volgorde.
      OPMERKING: Dit kan worden gebruikt om een temporele volgorde van gebeurtenissen te construeren terwijl de signaal- en weefselgezondheid wordt gemaximaliseerd, om een uitstekende temporele resolutie van de gebeurtenis te verkrijgen voor bijzonder gevoelige monsters of monsters met een laag signaal.

5. Airyscan verwerking van de live celbeelden

  1. Selecteer Na het verkrijgen van afbeeldingen met de imagingsoftware de optie Processing, klik op Batchen selecteer vervolgens Airyscan Processing.
    1. Selecteer de afbeeldingen die moeten worden verwerkt en klik vervolgens op Uitvoeren/verwerken om de afbeeldingen met een superresolutie te verkrijgen.
    2. Voer de verwerking uit met de standaardinstelling.
      OPMERKING: Airyscan-verwerking werkt alleen als de beeldvormingsinstellingen correct zijn ingesteld voor Airyscan-beeldvorming.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Live cell imaging voorbij de diffractielimiet in Drosophila weefsel, vooral voor GSC's, biedt de mogelijkheid om de dynamiek van subcellulaire gebeurtenissen in de context van celcyclusprogressie te onderzoeken. Onlangs heeft een studie die dit protocol gebruikt aangetoond dat microtubuli bij het moeder-centrosoom versus het dochter-centrosoom tijdelijk asymmetrisch zijn in GSC's10. Het moeder-centrosoom straalt ongeveer 4 uur voor de mitotische ingang microtubuli uit, terwijl het dochter...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Superresolutiemicroscopiemethoden bieden een ruimtelijke resolutie tot 10s nanometer4,5,6. De STORM- en PALM-microscopiemethoden maken een resolutie tot 20 tot 50 nm (XY-resolutie) mogelijk, terwijl STED-microscopie een resolutie van 20 tot 100 nm (XY-resolutie) biedt. De ruimtelijke resolutie van SIM-microscopie is beperkt tot 100 tot 130 nm15. Vanwege de hoge fotondichtheid en lange acquisitietijd is het echter uite...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen Integrated Imaging Core-faciliteit aan de Johns Hopkins University bedanken voor microscopen en software voor gegevensanalyse. We danken J. Snedeker en Q. E. Yu voor proeflezen en suggesties, en X.C. lableden voor nuttige discussies en suggesties. Ondersteund door NIGMS/NIH R35GM127075, het Howard Hughes Medical Institute, de David and Lucile Packard Foundation en Johns Hopkins University startup funds (X.C.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Adobe Illustrator CS6 (software voor het maken van figuren)AdobeN/A
DialysemembraanSpectra/Por 1-4 Standard RC-dialysemembraanCat No. 08-67121
FBSThermo Fisher ScientificCat. nr. 2614007915% (V/V)
Fiji (analysesoftware)NIHN/AKwantificering van de fluorescentie-intensiteit van afbeeldingen
Celcultuurschotels met glazen bodem (FluroDish)World Precision Instrument, Inc.FD35PDL-100
Imaris (beeldreconstructiesoftware)BitplaneN/A3D-beeldreconstructie
ImmersiollieZeissImmersol 518F/30 °C
InsulinSigmaCat. Nr. 15550200 µg/ml
Penicilline/streptomycineInvitrogenCat No. - 15140-1220,6x
Schneider Drosophila-mediaInvitrogenCat No. - 11720-034
Spinning disc confocale microscoopZeissN/Auitgerust met een evolve-camera (Photometrics), met behulp van een 63x Zeiss-objectief (1,4 NA).
WeefselpapierKimwipeN/ANat om een vochtige kamer te vormen
LSM 800 confocale microscoop met AiryScan superresolutiemoduleZeissN/Auitgerust met zeer gevoelige GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectoren met behulp van een 63x Zeiss-objectief (1,4 NA)
ZEN (beeldvormingssoftware)ZeissN/A

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Breedijk, R. M. P., et al. A live-cell super-resolution technique demonstrated by imaging germinosomes in wild-type bacterial spores. Scientific Reports. 10 (1), 5312(2020).
  2. Maddox, P. S., et al. Imaging the mitotic spindle. Methods in Enzymology. 505, 81-103 (2012).
  3. Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy - tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
  4. Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): A method for super resolution fluorescence imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (6), 075143(2013).
  5. Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nature Methods. 5 (5), 417-423 (2008).
  6. Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A. STED super-resolved microscopy. Nature Methods. 15 (3), 173-182 (2018).
  7. Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12 (12), (2015).
  8. Huff, J., et al. The new 2D superresolution mode for ZEISS Airyscan. Nature Methods. 14 (12), 1223(2017).
  9. Korobchevskaya, K., Lagerholm, B., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the potential of Airyscan microscopy for live cell imaging. Photonics. 4 (4), 41(2017).
  10. Ranjan, R., Snedeker, J., Chen, X. Asymmetric centromeres differentially coordinate with mitotic machinery to ensure biased sister chromatid segregation in germline stem cells. Cell Stem Cell. 25 (5), 666-681 (2019).
  11. Kahney, E. W., Ranjan, R., Gleason, R. J., Chen, X. Symmetry from asymmetry or asymmetry from symmetry. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 82, 305-318 (2017).
  12. Wooten, M., Ranjan, R., Chen, X. Asymmetric histone inheritance in asymmetrically dividing stem cells. Trends in Genetics. 36 (1), 30-43 (2020).
  13. Wooten, M., et al. Asymmetric histone inheritance via strand-specific incorporation and biased replication fork movement. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (8), 732-743 (2019).
  14. Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).
  15. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
  16. Sivaguru, M., et al. Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen. Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Drosophila testismicrotubulusdynamiekinteractie met de kernmembraancentromeerbindingkiemstamcellenAiryscan verwerkingspinning disc confocale microscopiebereiding van dialysemembraantime lapse fluorescentiebeeldvorming

Gerelateerde artikelen