Superresolutie live celbeeldvorming van subcellulaire structuren

Samenvatting

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor superresolutie live-cell imaging in intact weefsel. We hebben de voorwaarden gestandaardiseerd voor beeldvorming van een zeer gevoelige volwassen stamcelpopulatie in zijn inheemse weefselomgeving. Deze techniek omvat het balanceren van temporele en ruimtelijke resolutie om de directe observatie van biologische verschijnselen in levend weefsel mogelijk te maken.

Samenvatting

Er is al lang een cruciale afweging tussen ruimtelijke en temporele resolutie in beeldvorming. Beeldvorming buiten de diffractiegrens van licht is traditioneel beperkt tot alleen te gebruiken op vaste monsters of levende cellen buiten weefsel gelabeld met een sterk fluorescerend signaal. De huidige live celbeeldvormingstechnieken met superresolutie vereisen het gebruik van speciale fluorescentiesondes, hoge verlichting, meerdere beeldverwervingen met verwerking na acquisitie of vaak een combinatie van deze processen. Deze vereisten beperken de biologische monsters en contexten waarop deze techniek kan worden toegepast aanzienlijk.

Hier beschrijven we een methode om superresolutie (~ 140 nm XY-resolutie) time-lapse fluorescentie live celbeeldvorming in situ uit te voeren. Deze techniek is ook compatibel met een lage fluorescerende intensiteit, bijvoorbeeld EGFP of mCherry endogene tagged at lowly expressed genes. Als proof-of-principle hebben we deze methode gebruikt om meerdere subcellulaire structuren in de Drosophila testis te visualiseren. Tijdens weefselvoorbereiding worden zowel de cellulaire structuur als de weefselmorfologie gehandhaafd binnen de ontlede testis. Hier gebruiken we deze techniek om de dynamiek van microtubuli, de interacties tussen microtubuli en het kernmembraan, evenals de aanhechting van microtubuli aan centromeren in beeld te brengen.

Deze techniek vereist speciale procedures bij monstervoorbereiding, monstermontage en immobilisatie van monsters. Bovendien moeten de monsters na dissectie enkele uren worden bewaard zonder de cellulaire functie en activiteit in gevaar te brengen. Hoewel we de omstandigheden voor live superresolutiebeeldvorming specifiek in Drosophila mannelijke kiembaanstamcellen (GSC's) en voorloperkiemcellen in ontleed testisweefsel hebben geoptimaliseerd, is deze techniek breed toepasbaar op een verscheidenheid aan verschillende celtypen. Het vermogen om cellen onder hun fysiologische omstandigheden te observeren zonder in te boeten aan ruimtelijke of temporele resolutie zal dienen als een onschatbaar hulpmiddel voor onderzoekers die cruciale vragen in de celbiologie willen beantwoorden.

Inleiding

Het visualiseren van subcellulaire structuren en eiwitdynamiek in levende cellen met een resolutie voorbij de diffractiegrens van licht is meestal zeer uitdagend^1-3. Terwijl meerdere superresolutietechnieken zoals Stochastische-Optische-Reconstructie-Microscopie (STORM), Foto-Geactiveerde-Lokalisatie-Microscopie (PALM) en Gestimuleerde-Emissie-Uitputting (STED)^4,5,6 microscopie zijn ontwikkeld, beperken complicaties in de monstervoorbereiding evenals de noodzaak om levensvatbaarheid en activiteit ex vivo te behouden, het gebruik van conventi....

Protocol

1. Voorbereiding van live cell imaging cocktail (live cell media)

1. Vul Schneider's Drosophila medium aan met 15% foetale runderserum (FBS) en 0,6x penicilline/streptomycine. Stel de pH in op ongeveer 7,0.
2. Voeg vlak voor het gebruik van het medium insuline toe aan een eindconcentratie van 200 μg/ml.
   OPMERKING: Dit medium is van cruciaal belang voor het handhaven van een normale celdeling en ontwikkeling van de Drosophila-testis tijdens time-lapse beeldvorming^10,14.

2. Bereiding van glazen bodemcelkweekschaal

1. Gebruik een poly L-l....

Resultaten

Live cell imaging voorbij de diffractielimiet in Drosophila weefsel, vooral voor GSC's, biedt de mogelijkheid om de dynamiek van subcellulaire gebeurtenissen in de context van celcyclusprogressie te onderzoeken. Onlangs heeft een studie die dit protocol gebruikt aangetoond dat microtubuli bij het moeder-centrosoom versus het dochter-centrosoom tijdelijk asymmetrisch zijn in GSC's¹⁰. Het moeder-centrosoom straalt ongeveer 4 uur voor de mitotische ingang microtubuli uit, terwijl het dochter.......

Discussie

Superresolutiemicroscopiemethoden bieden een ruimtelijke resolutie tot 10s nanometer^4,5,6. De STORM- en PALM-microscopiemethoden maken een resolutie tot 20 tot 50 nm (XY-resolutie) mogelijk, terwijl STED-microscopie een resolutie van 20 tot 100 nm (XY-resolutie) biedt. De ruimtelijke resolutie van SIM-microscopie is beperkt tot 100 tot 130 nm¹⁵. Vanwege de hoge fotondichtheid en lange acquisitietijd is het echter uite.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Adobe Illustrator CS6 (software voor het maken van figuren)	Adobe	N/A
Dialysemembraan	Spectra/Por 1-4 Standard RC-dialysemembraan	Cat No. 08-67121
FBS	Thermo Fisher Scientific	Cat. nr. 26140079	15% (V/V)
Fiji (analysesoftware)	NIH	N/A	Kwantificering van de fluorescentie-intensiteit van afbeeldingen
Celcultuurschotels met glazen bodem (FluroDish)	World Precision Instrument, Inc.	FD35PDL-100
Imaris (beeldreconstructiesoftware)	Bitplane	N/A	3D-beeldreconstructie
Immersiollie	Zeiss	Immersol 518F/30 °C
Insulin	Sigma	Cat. Nr. 15550	200 µg/ml
Penicilline/streptomycine	Invitrogen	Cat No. - 15140-122	0,6x
Schneider Drosophila-media	Invitrogen	Cat No. - 11720-034
Spinning disc confocale microscoop	Zeiss	N/A	uitgerust met een evolve-camera (Photometrics), met behulp van een 63x Zeiss-objectief (1,4 NA).
Weefselpapier	Kimwipe	N/A	Nat om een vochtige kamer te vormen
LSM 800 confocale microscoop met AiryScan superresolutiemodule	Zeiss	N/A	uitgerust met zeer gevoelige GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectoren met behulp van een 63x Zeiss-objectief (1,4 NA)
ZEN (beeldvormingssoftware)	Zeiss	N/A