Hier wordt een protocol gepresenteerd om de coronaire microcirculatie in levend murinehartweefsel te bestuderen door ex vivo monitoring van de arteriële perfusiedruk en -stroom die de druk handhaaft, evenals vasculaire boomcomponenten, waaronder de capillaire bedden en pericyten, omdat de septale slagader wordt ingeblikt en onder druk staat.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Dynamische meting en beeldvorming van haarvaten, slagaders en pericyten in muishart
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Coronaire arteriële toon samen met het openen of sluiten van de haarvaten bepalen grotendeels de bloedtoevoer naar cardiomyocyten bij constante perfusiedruk. Het is echter moeilijk om de dynamische veranderingen van de kransslagaders en de haarvaten in het hele hart te volgen, voornamelijk vanwege de beweging en non-stop kloppen. Hier beschrijven we een methode die monitoring van arteriële perfusiesnelheid, druk en de diameterveranderingen van de slagaders en haarvaten in de rechterventrikel papillaire spieren van de muis mogelijk maakt. De muizentussenslagader wordt ingeblikt en doordrenkt met een constante stroom of druk met de andere dynamisch gemeten. Na perfusie met een fluorescerend gelabeld spreekgestoelte (bijv. Alexa Fluor-488 of -633 gelabeld Tarwe-Germ Agglutinine, WGA), konden de slagaders en haarvaten (en andere vaten) in de rechterventrikel papillaire spier en septum gemakkelijk worden gebeeldmerkt. De veranderingen in de diameter van het vat kunnen dan worden gemeten in de aan- of afwezigheid van hartcontracties. Wanneer genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten werden uitgedrukt, konden specifieke kenmerken worden gecontroleerd. Pericyten werden bijvoorbeeld gevisualiseerd in muisharten die NG2-DsRed uitdrukten. Deze methode heeft een nuttig platform geboden om de fysiologische functies van capillaire pericyten in het hart te bestuderen. Het is ook geschikt voor het bestuderen van het effect van reagentia op de bloedstroom in het hart door de vasculaire / capillaire diameter en de arteriële luminale druk tegelijkertijd te meten. Dit preparaat, gecombineerd met een state-of-the-art optisch beeldvormingssysteem, stelt men in staat om de bloedstroom en de controle ervan op cellulair en moleculair niveau in het hart te bestuderen onder bijna fysiologische omstandigheden.
Inleiding
Een passende coronaire drukstroomregulatie zorgt voor voldoende bloedtoevoer naar het hart om aan zijn metabolische eisen te voldoen1. Het is echter pas onlangs duidelijk geworden hoe coronaire drukstroom dynamisch wordt gereguleerd in het hart, ondanks uitgebreide studies die de afgelopen decennia in vivo en in vitro zijn uitgevoerd. Een van de redenen is de moeilijkheid om een fysiologisch werkmodel voor dergelijke studies vast te stellen vanwege het constante kloppen van het hart. Hoe dan ook, er zijn verschillende methoden vastgesteld voor de observatie van de coronaire microvaten in levende weefsels of dieren, maar geen van deze methoden w....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierverzorging was in overeenstemming met de richtlijnen van de Universiteit van Maryland Baltimore en de Institutional Animal Care and Use Committee keurde protocollen goed.
1. Voorbereiding van de oplossingen
OPMERKING: Bereid van tevoren oplossingen voor. In de experimenten worden twee soorten basisoplossingen gebruikt: (1) fysiologische zoutoplossing (PSS) voor badsuperfusaat en (2) Tyrode's oplossingen voor lumenperfusaat. Continu borrelen met CO2 is nodig om de pH van PSS te behouden. Hepes-gebufferde Tyrode's oplossing wordt gebruikt in het lumen in plaats van PSS om te voorkomen dat bubbels ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Wanneer een fluorescentie vasculaire marker is doordrenkt met vasculair lumen (hier WGA geconjugeerd met Alexa Fluor-488), is het mogelijk om hele vasculaire bomen te visualiseren zoals weergegeven in figuur 5 (linkerpaneel) met behulp van een snelle confocale microscoop. Verdere vergroting maakt de beeldvorming van capillair in detail mogelijk (figuur 5, rechterpaneel). Omdat het systeem onder druk een constante bewaking van de lichtdruk ondersteunt, kan dit pr.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In het huidige werk hebben we een opmerkelijk eenvoudige maar zeer praktische ex vivo-methode geïntroduceerd om de coronaire microcirculatie in het hart onder fysiologische omstandigheden te bestuderen. Deze methode werd gewijzigd uit mechanisch onderzoek met behulp van ratten2. De uitdagende toevoeging was de beeldvormingstechnologie met hoge snelheid en hoge optische resolutie. We konden daarom profiteren van de geavanceerde optische beeldvormingssystemen die nu commercieel beschikbaar zijn. Doo.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
Dit werk werd mede ondersteund door het Center for Biomedical Engineering and Technology (BioMET); NIH (1U01HL116321) en (1R01HL142290) en de American Heart Association 10SDG4030042 (GZ), 19POST34450156 (HCJ).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1 M CaCl2 oplossing | MilliporeSigma, USA | 21115 | |
| 1 M MgCl2 oplossing | MilliporeSigma, USA | M1028 | |
| AxoScope software | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Chiller/water incubator | FisherScientific, USA | Isotemp 3016S | |
| Confocal | Nikon Instruments, USA | A1R | |
| Custom glasbuis | Drummond Scientific Company | 9-000-3301 | |
| Digidata 1322A | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Dissectiemicroscoop | Olympus, Japan | SZX12 | |
| Endotheline-1 | MilliporeSigma, USA | E7764 | |
| Forceps | Fine Scientific Tools | 11295-51 | |
| Heparine natriumzout | Sigma-Aldrich, USA | H3393 | |
| Inline oplossingsverwarmer | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | SH-27B | |
| Isofluraan | VETone, Idaho, USA | 502017 | |
| Micropipet aanhaalapparaat | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 | |
| Micropipet/canulehouder | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | 64-0981 | |
| NG2DsRedBAC transgene muis | The Jackson Laboratory | #008241 | |
| Nylondraad voor het verbinden van bloedvaten | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | THR-G | |
| PDMS (polydimethylsiloxaan) | SYLGARD, Germantown, WI, USA | 184 SIL ELAST KIT | |
| Peristaltiekpomp | Gilson, Middleton, WI, USA | minipuls 3 | |
| Drukregelaar | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-S | |
| Schaar | Fine Scientific Tools, Foster City, CA, USA | 15000-10 | |
| Servo pomp | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-P | |
| Temperatuurregelaar | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | TC-324B | |
| Weizenkiem Agglutinine, Alexa Fluor 488 Conjugaat | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA | W11261 |
Referenties
- Zhao, G., Joca, H. C., Nelson, M. T., Lederer, W. J. ATP- and voltage-dependent electro-metabolic signaling regulates blood flow in heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 7461-7470 (2020).
- Schouten, V. J., Allaart, C. P., Westerhof, N.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
