Hier wordt een protocol gepresenteerd om de coronaire microcirculatie in levend murinehartweefsel te bestuderen door ex vivo monitoring van de arteriële perfusiedruk en -stroom die de druk handhaaft, evenals vasculaire boomcomponenten, waaronder de capillaire bedden en pericyten, omdat de septale slagader wordt ingeblikt en onder druk staat.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Dynamische meting en beeldvorming van haarvaten, slagaders en pericyten in muishart
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Coronaire arteriële toon samen met het openen of sluiten van de haarvaten bepalen grotendeels de bloedtoevoer naar cardiomyocyten bij constante perfusiedruk. Het is echter moeilijk om de dynamische veranderingen van de kransslagaders en de haarvaten in het hele hart te volgen, voornamelijk vanwege de beweging en non-stop kloppen. Hier beschrijven we een methode die monitoring van arteriële perfusiesnelheid, druk en de diameterveranderingen van de slagaders en haarvaten in de rechterventrikel papillaire spieren van de muis mogelijk maakt. De muizentussenslagader wordt ingeblikt en doordrenkt met een constante stroom of druk met de andere dynamisch gemeten. Na perfusie met een fluorescerend gelabeld spreekgestoelte (bijv. Alexa Fluor-488 of -633 gelabeld Tarwe-Germ Agglutinine, WGA), konden de slagaders en haarvaten (en andere vaten) in de rechterventrikel papillaire spier en septum gemakkelijk worden gebeeldmerkt. De veranderingen in de diameter van het vat kunnen dan worden gemeten in de aan- of afwezigheid van hartcontracties. Wanneer genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten werden uitgedrukt, konden specifieke kenmerken worden gecontroleerd. Pericyten werden bijvoorbeeld gevisualiseerd in muisharten die NG2-DsRed uitdrukten. Deze methode heeft een nuttig platform geboden om de fysiologische functies van capillaire pericyten in het hart te bestuderen. Het is ook geschikt voor het bestuderen van het effect van reagentia op de bloedstroom in het hart door de vasculaire / capillaire diameter en de arteriële luminale druk tegelijkertijd te meten. Dit preparaat, gecombineerd met een state-of-the-art optisch beeldvormingssysteem, stelt men in staat om de bloedstroom en de controle ervan op cellulair en moleculair niveau in het hart te bestuderen onder bijna fysiologische omstandigheden.
Inleiding
Een passende coronaire drukstroomregulatie zorgt voor voldoende bloedtoevoer naar het hart om aan zijn metabolische eisen te voldoen1. Het is echter pas onlangs duidelijk geworden hoe coronaire drukstroom dynamisch wordt gereguleerd in het hart, ondanks uitgebreide studies die de afgelopen decennia in vivo en in vitro zijn uitgevoerd. Een van de redenen is de moeilijkheid om een fysiologisch werkmodel voor dergelijke studies vast te stellen vanwege het constante kloppen van het hart. Hoe dan ook, er zijn verschillende methoden vastgesteld voor de observatie van de coronaire microvaten in levende weefsels of dieren, maar geen van deze methoden was in staat om tegelijkertijd een constante/stabiele focus en de metingen van de druk, stroming en microvasculaire diameter te bereiken2,3. De directe visualisatie van coronaire arteriële microvaten in kloppend hart werd decennia geleden geïntroduceerd4,3, maar de diametermetingen in kleine vaten waren uitdagend en de specifieke functies van de vele gespecialiseerde celtypen geassocieerd met de microcirculatie waren even vervelend. Zelfs de stroboscopische methode en het drijvende objectieve systeem konden bovenstaande informatie niet tegelijkertijd verstrekken5. Niettemin is een aanzienlijke hoeveelheid waardevolle informatie verkregen met behulp van de bovengenoemde technologieën, die ons hebben geholpen meer te begrijpen over de regulering van coronaire bloedstroom6. De methode die we in dit artikel beschrijven, zal iemand helpen om in detail te onderzoeken en te begrijpen hoe componenten van kransslagaders, de slagaders en de microvasculatuur anders reageren op stimulaties en metabole eisen.
Het werkmodel dat we hebben opgesteld om deze studies voort te zetten, is gebaseerd op het eerdere werk van Westerhof et al.2. Na cannulatie van de septale slagader van het muizenhart werd fysiologische zoutoplossing gebruikt om die slagader te doordrenken om de myocyten en andere componenten van het hartweefsel gevoed te houden. De arteriële perfusiedruk, de stroom en de vasculaire diameter werden onder andere fysiologische functies gecontroleerd met behulp van geschikte fluorescerende indicatoren. Deze methode stelt ons in staat om het coronaire microvasculaire bed onder fysiologische druk in levend weefsel te visualiseren en de cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan microcirculatieregulatie voor het eerst te bestuderen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierverzorging was in overeenstemming met de richtlijnen van de Universiteit van Maryland Baltimore en de Institutional Animal Care and Use Committee keurde protocollen goed.
1. Voorbereiding van de oplossingen
OPMERKING: Bereid van tevoren oplossingen voor. In de experimenten worden twee soorten basisoplossingen gebruikt: (1) fysiologische zoutoplossing (PSS) voor badsuperfusaat en (2) Tyrode's oplossingen voor lumenperfusaat. Continu borrelen met CO2 is nodig om de pH van PSS te behouden. Hepes-gebufferde Tyrode's oplossing wordt gebruikt in het lumen in plaats van PSS om te voorkomen dat bubbels in de vaten gaan, omdat bellen de endotheelcellen7 zouden beschadigen en de stroom zouden afsluiten.
- PSS-oplossing: Zie de formule en samenstelling van pss-oplossing in tabel 1. Maak 10 L Ca2+-vrije en glucosevrije PSS-voorraadoplossing en bewaar deze bij kamertemperatuur. 1 uur voor elke procedure, haal 1 L van de voorraadoplossing en bel met 5% CO2 (74% N2 en 21% O2)om de pH van de oplossing op ~ 7,4 te houden. Voeg 1,8 g glucose en 1,8 ml CaCl2 (1 M voorraad)toe 8.
OPMERKING: Voeg Ca2+ pas toe na borrelen wanneer de pH ~7,4 is, anders wordt Ca2+ neergeslagen. - De oplossing van Tyrode: Zie de formule en samenstelling van de oplossing van de Tyrode in tabel 1. Filter de oplossing (0,22 μm) en bewaar deze bij 4 °C voor toekomstig gebruik9.
- Tyrode's oplossing met BDM (2,3-Butanedione monoxime): Voeg BDM toe als omkeerbare myofilamentremmer om de samentrekking van de myocyten te voorkomen10. Weeg 600 mg BDM en voeg toe aan 200 ml van de oplossing van Tyrode. Roer de oplossing met BDM tot deze volledig is opgelost. Verdere filtratie is niet nodig.
- Bewaar de oplossing van de Tyrode met BDM op 4 °C voor toekomstig gebruik.
2. Kamervoorbereiding
- Bedek zowel de ontleedkamer als de experimentele kamer van tevoren met polydimethylsiloxaan (PDMS) volgens de instructies van de fabrikant.
- Vul de ontleedkamer met de oplossing van de Tyrode met BDM.
- Zet de koelmachine 1 uur voor de procedure aan. Stel de temperatuur in op 4 °C.
3. Canule voorbereiding
- Zet de micropipette trekker aan. Selecteer de instellingen volgens de instructies van de fabrikant.
- Neem een schone borosilicaatglasbuis (de buiten- en binnendiameter van de gebruikte glazen buizen was respectievelijk 1,2 mm en 0,69 mm).
- Steek een glazen buis in de gegroefde klemmen van een Sutter pipettrekker met een U-vormig platina verwarmingsfilament.
- Activeer de trekker om twee canules te produceren, elk met een lange dunne punt.
- Snijd de punt van elke canule met een fijne schaar onder een ontleedmicroscoop om de uiteindelijke diameter van de punt rond 100 tot 150 μm te maken.
- Vuur polijst de punt van de gesneden canule om de scherpe randen enigszins te omzeilen.
- Buig de canule langs de as met behulp van een platinadraad (verwarmd met fijne bediening) aan de zijkant van de as op ongeveer 2 mm van de punt. De hoek van de bocht in de canule moet ongeveer 45° zijn.
- Steek het open uiteinde van de canule in de houder van de druk myograafkamer en draai de fitting vast. Sluit een 5 ml spuit gevuld met Tyrode's oplossing aan op de andere kant van de fitting. Sluit de canule aan op een micromanipulator die op de kamer is gemonteerd (zie figuur 1 en figuur 2).
- Vul de canule met de oplossing van Tyrode met behulp van de spuit (5 ml), spoel deze door, de slang en de connector van luchtbellen.
- Meet voorafgaand aan de cannulatieprocedure de perfusiedruk in de canule over een bepaald debietbereik (50 tot 300 μL/min, figuur 3). Doe dit alleen wanneer een nieuwe canule wordt gebruikt.
OPMERKING: De perfusiedruk in de canule is evenredig met de stroom en is lineair gemonteerd (figuur 3).
4. Extractie van muishart
- Plaats een C57BL/6 muis (van beide geslachten, 8-16 weken oud) in de anesthesiebox die is aangesloten op de tanks van isofluraan en zuurstof.
- Schakel de zuurstoftank in en start de stroming van isofluraan. Wacht ~ 5 minuten totdat de muis volledig is verdoofd.
- Nadat de anesthesie is vastgesteld, haalt u de muis uit de anesthesiebox en injecteert u heparine-IP (in de buikholte, 360 eenheden, 0,5 ml/muis) om de vorming van bloedstolsels in de vasculatuur te voorkomen. Plaats vervolgens de muis terug in de anesthesiedoos.
- 10 minuten nadat de heparine is geïnjecteerd, verplaatst u de muis in een liggende positie naar het verwarmde bed en stabiliseert u de poten met behulp van etiketteringstape. Houd de muis onder volledige anesthesie met isofluraan met behulp van een neuskegel.
- Til de buikhuid van de muis met een tang boven het middenrif en gebruik een chirurgische schaar om het middenrif te snijden en bloot te leggen.
- Snijd het middenrif en het borstbeen. Open de borstkas.
- Ontleed het hart uit de borstholte en snijd zo dicht mogelijk bij de dorsale thoracale wand.
- Plaats het hart in de ijskoude Tyrode-oplossing met 30 mM BDM.
- Reinig het hart om de bindweefsels zoals de longen te verwijderen.
- Breng het hart over in de voorgekoelde ontleedkamer gevuld met Tyrode's oplossing met 30 mM BDM.
5. Voorbereiding en cannulatie van septale slagader
- Zet de servopomp aan. Zet de servopomp in de modus "flow". Laat het op hoge snelheid lopen totdat de slang is gevuld met de oplossing van de Tyrode die zal worden gebruikt om het vasculaire lumen te doordrenken. Zorg ervoor dat er geen bubbels in de slang zitten. Verlaag dan de snelheid.
- Speld het hart op het PDMS en voorkom schade aan het middelste deel van het hart.
- Verwijder zowel de rechter- als de linker atria. Snijd de rechter hartkamer open en verwijder de rechter ventriculaire vrije wand met behulp van een ontleedmicroscoop.
- Stel de septale slagader bloot en identificeer deze. Plaats een nylon draad (diameter 30 μm) onder de septale slagader en knoop een losse knoop voor toekomstig gebruik.
OPMERKING: De septale slagader kan gemakkelijk worden geïdentificeerd met behulp van een ontledende microscoop. De septale slagader is een belangrijke slagader op het septum afkomstig van de rechter kransslagader in de meeste gevallen. - Verwijder de linker ventriculaire vrije wand met een fijne schaar.
- Breng het papillaire spierpreparaat over in de experimentele kamer waarin de canule is geplaatst. De kamer is gevuld met De oplossing van Tyrode die BDM bevat. De onderkant van deze kamer is bedekt met een dunne (~2 mm) laag PDMS.
- Pas de positie van de canule aan (met behulp van de micromanipulator) om cannulatie van de septale slagader mogelijk te maken. Draai de knoop vast.
- Bevestig de papillaire spier met behulp van kleine pinnen op de kamervloer, zodat het microscoopdoel een duidelijk zicht heeft op de vasculatuur. Let op de hoek en de positie van de canule en zorg ervoor dat de punt van de canule parallel loopt aan de arteriële wand.
- Test de cannulatie door de oplossing geleidelijk uit de spuit door de canule te verdrijven. Als alle elementen goed functioneren, zal het resterende bloed in de papillaire spier het weefsel aan het begin van dit proces verlaten en zal alleen de oplossing van Tyrode later worden gezien.
6. Stabilisatie van het preparaat
- Schakel de peristaltische pomp in die de superfusieoplossing levert. Superfuseer vervolgens het preparaat in het bad constant met voorvergast PSS met een snelheid van 3-4 ml/min.
- Schakel de temperatuurregelaar voor de superfusieoplossing in. Pas de temperatuur van het badsuperfusaat aan op ~35-37 °C.
- Sluit de canule aan op de servopomp. Lees de druk die op de drukservoregelaar wordt weergegeven.
- Controleer de doorstroming en druk. De stroom (μL/min) en de arteriële perfusiedruk (mm Hg) worden gedigitaliseerd met behulp van digitizer en geregistreerd met behulp van een bijbehorende software (figuur 2).
- Pas de stroom aan om de druk ~10 mmHg in te stellen en laat deze ~10 min draaien.
- Verhoog de stroom van de luminale oplossing om de druk van de slagader ~ 60 mmHg te maken. Verkrijg de uiteindelijke perfusiedruk van de arteriole zelf door de drukval van de canule af te trekken (figuur 3).
OPMERKING: Als de modus "druk" op de drukservoregelaar is geselecteerd, wordt de lichtdruk voor deze experimenten ingesteld op ~60 mmHg. Controleer vervolgens de verandering van de stroom. - Laat het monster gedurende ~ 30-60 minuten stabiliseren door de stroom- en/of drukniveaus te bewaken. Een geleidelijke toename van de arteriële druk wordt normaal gesproken waargenomen aan het begin van de perfusie na cannulatie. Een nieuwe steady state zal zich in ongeveer 30 minuten vanzelf vestigen (figuur 4).
- Start een experiment nadat de perfusiedruk is gestabiliseerd (bij constante stroom).
7. Het laden van het preparaat met fluorescerend getagd tarwekiem agglutinine (WGA)
- Bereid de oplossing van Tyrode met Alexa-Fluor-488 geconjugeerde WGA voor door 100 μg geconjugeerde WGA toe te voegen aan 5 ml van de oplossing van Tyrode.
- Schakel het perfusaat voorzichtig over van de normale Tyrode-oplossing naar een oplossing met fluorescerend getagde WGA. Het is belangrijk om het perfusaat zorgvuldig te schakelen, zodat er geen bubbels worden geïntroduceerd.
- Na ~ 30 minuten WGA-perfusie of wanneer de WGA-oplossing op het punt staat op te raken, verandert u het perfusaat terug naar de normale Tyrode-oplossing.
8. Confocale beeldvorming van slagaders en haarvaten
- Schakel het Confocale microscoopsysteem van de Nipkow-schijf in.
- Gebruik de microscoop om de septale slagader te lokaliseren met behulp van een laag vermogen (4x) in de lichtmodus.
OPMERKING: Septale slagader kan worden gevonden door de positie van de canule te volgen. - Start confocale beeldvorming met de draaiende schijf confocal en kies 488 nm excitatielaser, 40x objectieve vergroting en pas de laserintensiteit en de bemonsteringsfrequentie (10 - 500 ms per beeld) aan.
- Stel boven- en onderbeeldposities in voor de confocale microscoop om het beeldbereik te definiëren en voer de parameters voor de z-stack beeldvorming in.
- Stel de stapgrootte in zoals aanbevolen voor het systeem dat wordt gebruikt of stel de stapgrootte naar wens in.
- Kies de instellingen voor de z-stackinstelling en/of tijdreeks.
- Selecteer of stel een nieuwe map in om de nieuwe afbeelding op te slaan.
- Klikop" Uitvoeren " om te beginnen met het opnemen van beeldvorming voor toekomstige analyse (figuur 5).
9. Voorbeeld vaatverwijderexperiment: pinacidil-geïnduceerde vasodilatatie (Video 1).
- Bereid pinacidil voorraadoplossing (100 mM in DMSO) en bewaard bij 4 °C.
- Bereid 10 ml van de oplossing van Tyrode. Voeg 10 μL pinacidil-stamoplossing toe om de uiteindelijke concentratie pinacidil 100 μM te maken.
- Beeld de papillaire spier in bij lage vergroting (4x objectief) om de septale slagader en de takslagaders op te nemen.
- Schakel de luminale oplossing om naar de pinacidil-bevattende oplossing.
10. Voorbeeld experimenten met bloedstroomcontrole: vasoconstrictor-geïnduceerde arteriële perfusiedrukverhoging bij constante stroom (Figuur 6)
- Bereid endotheline-1 (ET-1) voorraadoplossing (10 μM) en bewaard bij -20 °C.
- Bereid 10 ml van de oplossing van Tyrode. Voeg 10 μL ET-1-stamoplossing (10 μM) toe om de uiteindelijke concentratie et-1 10 nM te maken.
- Neem de lichtdruk op met constante stroming en beeld de papillaire spier.
- Schakel de luminale oplossing om naar de ET-1-oplossing.
11. Voorbeeldafbeeldingen van capillair met pericyten (figuur 7)
- Offer een NG2DsRedBAC transgene muis op zoals beschreven in sectie 4 van dit protocol.
- Haal het hart eruit, canuleer de septale slagader en laad het monster met Alexa-Fluor-488 geconjugeerde WGA volgens protocollen 5-7.
- Beeld de papillaire spier in bij 488 nm en 560 nm excitatie, en 510-525 nm, 575-625 nm emissie met behulp van confocale. De arteriole druk zal ongeveer 40 mmHg zijn.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Wanneer een fluorescentie vasculaire marker is doordrenkt met vasculair lumen (hier WGA geconjugeerd met Alexa Fluor-488), is het mogelijk om hele vasculaire bomen te visualiseren zoals weergegeven in figuur 5 (linkerpaneel) met behulp van een snelle confocale microscoop. Verdere vergroting maakt de beeldvorming van capillair in detail mogelijk (figuur 5, rechterpaneel). Omdat het systeem onder druk een constante bewaking van de lichtdruk ondersteunt, kan dit pr...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In het huidige werk hebben we een opmerkelijk eenvoudige maar zeer praktische ex vivo-methode geïntroduceerd om de coronaire microcirculatie in het hart onder fysiologische omstandigheden te bestuderen. Deze methode werd gewijzigd uit mechanisch onderzoek met behulp van ratten2. De uitdagende toevoeging was de beeldvormingstechnologie met hoge snelheid en hoge optische resolutie. We konden daarom profiteren van de geavanceerde optische beeldvormingssystemen die nu commercieel beschikbaar zijn. Doo...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
Dit werk werd mede ondersteund door het Center for Biomedical Engineering and Technology (BioMET); NIH (1U01HL116321) en (1R01HL142290) en de American Heart Association 10SDG4030042 (GZ), 19POST34450156 (HCJ).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1 M CaCl2 oplossing | MilliporeSigma, USA | 21115 | |
| 1 M MgCl2 oplossing | MilliporeSigma, USA | M1028 | |
| AxoScope software | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Chiller/water incubator | FisherScientific, USA | Isotemp 3016S | |
| Confocal | Nikon Instruments, USA | A1R | |
| Custom glasbuis | Drummond Scientific Company | 9-000-3301 | |
| Digidata 1322A | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Dissectiemicroscoop | Olympus, Japan | SZX12 | |
| Endotheline-1 | MilliporeSigma, USA | E7764 | |
| Forceps | Fine Scientific Tools | 11295-51 | |
| Heparine natriumzout | Sigma-Aldrich, USA | H3393 | |
| Inline oplossingsverwarmer | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | SH-27B | |
| Isofluraan | VETone, Idaho, USA | 502017 | |
| Micropipet aanhaalapparaat | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 | |
| Micropipet/canulehouder | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | 64-0981 | |
| NG2DsRedBAC transgene muis | The Jackson Laboratory | #008241 | |
| Nylondraad voor het verbinden van bloedvaten | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | THR-G | |
| PDMS (polydimethylsiloxaan) | SYLGARD, Germantown, WI, USA | 184 SIL ELAST KIT | |
| Peristaltiekpomp | Gilson, Middleton, WI, USA | minipuls 3 | |
| Drukregelaar | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-S | |
| Schaar | Fine Scientific Tools, Foster City, CA, USA | 15000-10 | |
| Servo pomp | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-P | |
| Temperatuurregelaar | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | TC-324B | |
| Weizenkiem Agglutinine, Alexa Fluor 488 Conjugaat | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA | W11261 |
Referenties
- Zhao, G., Joca, H. C., Nelson, M. T., Lederer, W. J. ATP- and voltage-dependent electro-metabolic signaling regulates blood flow in heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 7461-7470 (2020).
- Schouten, V. J., Allaart, C. P., Westerhof, N. Effect of perfusion pressure on force of contraction in thin papillary muscles and trabeculae from rat heart. Journal of Physiology. 451, 585-604 (1992).
- Tillmanns, H., et al. Microcirculation in the ventricle of the dog and turtle. Circulation Research. 34, 561-569 (1974).
- Martini, J., Honig, C. R. Direct measurement of intercapillary distance in beating rat heart in situ under various conditions of O2 supply. Microvascular Research. 1, 244-256 (1969).
- Nellis, S. H., Liedtke, A. J., Whitesell, L. Small coronary vessel pressure and diameter in an intact beating rabbit heart using fixed-position and free-motion techniques. Circulation Research. 49, 342-353 (1981).
- Marcus, M. L., et al. Understanding the coronary circulation through studies at the microvascular level. Circulation. 82, 1-7 (1990).
- Ralevic, V., Kristek, F., Hudlicka, O., Burnstock, G. A new protocol for removal of the endothelium from the perfused rat hind-limb preparation. Circulation Research. 64, 1190-1196 (1989).
- Zhao, G., Adebiyi, A., Blaskova, E., Xi, Q., Jaggar, J. H. Type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptors mediate UTP-induced cation currents, Ca2+ signals, and vasoconstriction in cerebral arteries. Amercian Journal of Physiology-Cell Physiology. 295, 1376-1384 (2008).
- Zhao, G., Li, T., Brochet, D. X., Rosenberg, P. B., Lederer, W. J. STIM1 enhances SR Ca2+ content through binding phospholamban in rat ventricular myocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4792-4801 (2015).
- Stowe, D. F., Boban, M., Graf, B. M., Kampine, J. P., Bosnjak, Z. J. Contraction uncoupling with butanedione monoxime versus low calcium or high potassium solutions on flow and contractile function of isolated hearts after prolonged hypothermic perfusion. Circulation. 89, 2412-2420 (1994).
- Lawton, P. F., et al. a Low-Cost and Open Source Pressure Myograph System for Vascular Physiology. Frontiers in Physiology. 10, 99(2019).
- Kim, K. J., Filosa, J. A. Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation. Journal of Physiology. 590, 1757-1770 (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
