Kwantificering van circulerend varkensspecifiek DNA in het bloed van een Xenotransplantatie Model

Samenvatting

In dit protocol werden varkensspecifieke primers ontworpen, werden plasmidenhoudende varkensspecifieke DNA-fragmenten geconstrueerd en werden standaardkrommen voor kwantificering vastgesteld. Met behulp van soortspecifieke primers werd cpsDNA door qPCR gekwantificeerd in varkens-tot-muisceltransplantatiemodellen en varkens-tot-aap slagaderpatch transplantatiemodellen.

Samenvatting

Xenotransplantatie is een haalbare methode om orgaanfalen te behandelen. Echter, hoe effectief te controleren van de immuunafstoting van xenotransplantatie is een probleem voor artsen en onderzoekers. Dit manuscript beschrijft een eenvoudige en effectieve methode om immuunafstoting te controleren in celtransplantatiemodellen van varkens tot muis en patchtransplantatiemodellen van varkens tot aap. Circulerend DNA is een potentieel niet-invasieve biomarker voor orgaanschade. In deze studie werd circulerend varkensspecifiek DNA (cpsDNA) gemonitord tijdens xenograft afwijzing door kwantitatieve real-time PCR (qPCR). In dit protocol werden varkensspecifieke primers ontworpen, werden plasmidenhoudende varkensspecifieke DNA-fragmenten geconstrueerd en werden standaardkrommen voor kwantificering vastgesteld. Soortenspecifieke primers werden vervolgens gebruikt om cpsDNA te kwantificeren door qPCR in varkens-tot-muis celtransplantatiemodellen en pig-to-monkey slagaderpatch transplantatiemodellen. De waarde van deze methode suggereert dat het kan worden gebruikt als een eenvoudige, handige, lage kosten, en minder invasieve methode om de immuunafstoting van xenotransplantatie te controleren.

Inleiding

Orgaanfalen is een van de belangrijkste doodsoorzaken¹. Transplantatie van cellen, weefsels en organen is een effectieve manier om orgaanfalen te behandelen². Niettemin beperkt het tekort aan donororganen de klinische toepassing van deze methode^3,4. Studies hebben aangetoond dat varkens kunnen worden gebruikt als een potentiële bron van menselijke organen voor klinische transplantatie^5,6. Echter, kruissoorten orgaantransplantatie gezichten gevaarlijke immuunafstoting. Daarom is het cruciaal om de immuunaf....

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en voorschriften van de Institutional Review Board van Shenzhen Second People's Hospital, First Affiliated Hospital van de Universiteit van Shenzhen.

1. Ontwerp varkensspecifieke primers

1. Uitvoeren van het hele genoom BLAST analyse om varkens specifieke genen die anders waren dan die van mensen, apen of muis te identificeren, met behulp van de software NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).
2. Ontwerp primers volgens 19 varkensspecifieke genen (Tabel 1) met behulp van de software van Primer 5.

2. Isolere....

Resultaten

In dit protocol werden varkensspecifieke primers ontworpen, werden plasmidenhoudende varkensspecifieke DNA-fragmenten geconstrueerd en werden standaardkrommen voor kwantificering vastgesteld (figuur 4). De specifieke kenmerken van de soorten van de 19 primers werden bevestigd door PCR. Soortenspecifieke primers (primer #4 en primer #11) werden vervolgens gebruikt om cpsDNA te kwantificeren door qPCR in varkens-tot-muis celtransplantatiemodellen en pig-to-monkey slagader patch transplantatie .......

Discussie

Het kwantificeren van varkens dat circulerend DNA circuleert, is een haalbare aanpak om de immuunafstoting van xenotransplantatie te monitoren. Gadi et al.²⁴ vonden dat het circulatie-DNA(ddcfDNA) van donoren in het bloed van patiënten met acute afstoting aanzienlijk hoger was dan dat van patiënten zonder afstoting. Deze studies suggereren dat ddcfDNA kan een gemeenschappelijke biomarker voor het toezicht op orgaantransplantatie schade. In de afgelopen jaren is qPCR steeds meer toegepast op de ana.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Agarose	Biowest, Barcelona, Spanje	111860
BamHI-HF	New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA	R3136S
1.5 mL microcentrifuge tube	Axygen Biosciences, Union City, CA, USA	MCT-150-C
0.2 mL PCR tube	Axygen Biosciences, Union City, CA, USA	PCR-02-C
C57BL/6 Muizen	Medical Animal Center of Guangdong Province,  China		8~10 weken
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific, Walt- ham, MA, USA	Micro 21R
2-Log DNA Ladder	New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA	N3200S	0.1–10.0 kb
Marker I	Tiangen, Beijing, China	MD101-02	0.1–0.6 kb
DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns)	Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA	DNACOL-01
DNA loading buffer	Solarbio, Beijing, China	D1010
E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I en E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II	Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA	D6942
D6943
EcoR I	Takara Bio, Shiga, Japan	1040S
Vrouwelijke Bama minivarkens	BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China		2~4 maanden
Genomic DNA Extraction Kit?	Tiangen, Beijing, China	DP304-02
SYBR Green Realtime PCR Master Mix	Toyobo, Osaka, Japan	QPK-201
Gel Doc XR	Bio-Rad, Hercules, USA
Mannelijke cynomolgus-aapjes	Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China		8 jaar
Nucleïnezuur kleurstof(Gelred)	Biotium, Fremont, USA	42003
polymerase(Premix Taq)	Takara Bio, Shiga, Japan	RR901A
pMD19-T plasmid	Takara Bio, Shiga, Japan	D102A
qPCR machine	Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA
Serum/Circulating DNA Extraction Kit	Tiangen, Beijing, China	DP339
TAE	sangon Biotech, Shanghai, China	B548101