Drosophila Embryo Preparatuur en microinjectie voor live celmicroscopie uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde high content analyzer

Samenvatting

Hier gepresenteerd is een protocol om micro-injectie en tegelijkertijd beeld meerdere Drosophila embryo's tijdens de embryonale ontwikkeling met behulp van een plaat-gebaseerde, hoog gehalte imager.

Samenvatting

Moderne benaderingen in kwantitatieve live celbeeldvorming zijn een essentieel instrument geworden voor het verkennen van celbiologie, door het gebruik van statistieken en computationele modellering mogelijk te maken om biologische processen te classificeren en te vergelijken. Hoewel celcultuurmodelsystemen zeer geschikt zijn voor beeldvorming met een hoog gehalte, suggereren hoge doorvoerstudies van celmorfologie dat ex vivo culturen beperkt zijn in het samenvatten van de morfologische complexiteit in cellen in levende organismen. Als zodanig is er behoefte aan een schaalbaar hoog doorvoermodel systeem om levende cellen in een intact organisme te beeld. Hier beschreven is een protocol voor het gebruik van een hoge inhoud image analyzer om tegelijkertijd meerdere time-lapse video's van embryonale Drosophila melanogaster ontwikkeling tijdens de syncytial blastoderm stadium te verwerven. De syncytial blastoderm heeft traditioneel gediend als een groot in vivo model voor beeldvorming biologische gebeurtenissen; het verkrijgen van een aanzienlijk aantal experimentele replica's voor kwantitatieve en hoge doorvoerbenaderingen was echter arbeidsintensief en beperkt door de beeldvorming van één embryo per experimentele herhaling. Hier gepresenteerd is een methode om beeldvorming en micro-injectie benaderingen aan te passen aan een hoog gehalte imaging systeem, of een omgekeerde microscoop in staat van geautomatiseerde multipoint acquisitie. Deze aanpak maakt het mogelijk om 6-12 embryo's gelijktijdig te verwerven, afhankelijk van de gewenste acquisitiefactoren, binnen één beeldsessie.

Inleiding

In de afgelopen 30 jaar hebben de vooruitgang in beeldvormingstechnologieën en moleculaire sondes voor live celbeeldvorming ons begrip van de complexiteit en innerlijke werking van de cel bevorderd. Bij deze vooruitgang in de technologie is een grotere afhankelijkheid van het gebruik van ex vivo cel cultuur modellen voor de verwerving van hoge doorvoer imaging gegevens. Celkweekmodellen bieden verschillende voordelen, waaronder de controle van de micro-omgeving via microfluïde systemen, en de mogelijkheid om meerdere cellen tegelijkertijd te beelden, waardoor het gebruik van kwantitatieve benaderingen die nodig zijn voor screening met een hoge doorvoer^1,2. Er zijn echter ook aanzienlijke nadelen verbonden aan celkweekmodellen in de context van morfologische studies, zoals tweedimensionale glas- of kunststofoppervlakken die verstorende effecten hebben op de celmorfologie en de voorregulering^{ervan 3,4,5}. Deze effecten kunnen valse of misleidende gegevens opleveren met betrekking tot de studie van biologische processen die cellulaire morfologie reguleren.

Hoewel het alternatief is geweest om cellulaire morfologie te bestuderen in de context van een intact organisme^6,vergemakkelijken weinig geschikte intacte organismen een hoge doorvoer kwantitatieve live celbeeldvorming als gevolg van moeilijkheden bij het in leven houden van hele organismen door middel van beeldvorming, en uitdagingen in verband met beeldvorming in een groot meercellig organisme. Als gevolg hiervan hebben celbiologische studies in intacte organismen zich over het algemeen gericht op het observeren van een enkel organisme in de loop van de tijd, wat de steekproefgrootte sterk beperkt. Bovendien maakt deze beperking van één dier-op-een-tijd live beeldvorming moeilijk en kostbaar om in de vorm van een scherm te gebruiken en beperkt het de mogelijkheid om kwantitatieve analytische instrumenten toe te passen, omdat het aantal monsters over het algemeen te klein is. Zo ontstaat de behoefte aan een meercellig modelorganisme dat kan worden gebruikt voor kwantitatieve benaderingen met een hoog gehalte.

Dit protocol past het Drosophila embryo aan voor plaatgebaseerde hoge gehalte beeldvorming om experimentele monstergroottes te genereren die groot genoeg zijn voor kwantitatieve analyse. Drosophila melanogaster is algemeen bekend als het eerste model organisme. Onderzoek met drosophila heeft geleid tot doorbraken in de cel- en moleculaire biologie, waaronder de overdracht van genetische informatie, de identificatie van celsignaleringstrajecten en genetische vereisten van embryonale ontwikkeling^7,8,9. Daarnaast is het Drosophila embryo gebruikt om de in vivo microtubbuledynamiek te onderzoeken tijdens cellulaire divisie^10,11,12. Het gebruik van microinjectie om kleine moleculen en moleculaire sondes te leveren biedt temporele controle die drosophila embryonale ontwikkeling bijzonder krachtig maakt voor indringende cellulaire processen in vivo^13,14. Het genereren van een aanzienlijk aantal experimentele herhalingen met een traditionele beeldvormingsbenadering is echter zeer arbeidsintensief en heeft beperkt gebruik in beeldschermen met hoge doorvoer en kwantitatieve analyse. Onze aanpak maakt gebruik van een high content analyzer die doorgaans is gereserveerd voor eencellige analyse en past in vivo beeldvormingsanalyse aan in het syncytium van de vroege Drosophila embryo.

Dit protocol werd gebruikt om Drosophila embryo's te verzamelen, te ën en micro-injecteren om de mechanismen te onderzoeken die morfologische veranderingen in het Endoplasmatische Reticulum (ER) stimuleren tijdens mitose^15. Hoewel veel studies de dynamische aard van de ER hebben geschetst tijdens de celcyclus^16,17,18,19, is het moeilijk geweest om de effecten van meerdere verstoringen in de tijd op ER-morfologie te vergelijken. Om de componenten te identificeren die veranderingen in ER-morfologie over celdeling stimuleren, werden de in dit protocol genoemde methoden gebruikt om de rol van microtubuli en andere cytoskeletale factoren op mitotische ER-reorganisatie te onderzoeken met behulp van de corticale syncytialeling in het vroege Embryo drosophila. Samen, de beschikbaarheid van genetische verstoring binnen de Drosophila gemeenschap, de mogelijkheid om drugs micro-inject en moleculaire sondes op precieze momenten tijdens de ontwikkeling, en de goedkope kosten van het werken met Drosophila maakt deze aanpak zeer vatbaar voor high-throughput image-based screening. De hier beschreven methoden zijn van toepassing voor het bestuderen van een breed scala aan cellulaire en ontwikkelingsprocessen in vivo met behulp van het Drosophila embryo^20. Specifiek, dit protocol is goed aangepast aan biologische gebeurtenissen die zich voordoen over een langere periode en binnen 100 micron van de Drosophila embryo cortex te bestuderen.

Protocol

LET OP: Raadpleeg tabel 1 voor recepten van media en oplossing.

1. Opzetten en onderhouden van een embryokooi voor live analyse²¹

1. Bevolk een verse embryocollectiekooi met verse vliegen.
   OPMERKING: Hoewel commercieel verkrijgde inzamelkooien worden aanbevolen, kunnen inzamelkooien eenvoudig worden opgebouwd uit lege vliegflessen²¹.
   1. Gooi of breng volwassen vliegen uit flessen wanneer veel poppen beginnen donkerder in stadium p14; bij 20 °C gebeurt dit ongeveer 14 dagen nadat de eieren zijn gelegd²².
   2. Laat poppen uitkomen en bevolken de flessen voor 12-24 uur.
   3. Breng verse vliegen in een kleine collectie kooi met behulp van een kleine trechter over de collectie kooi opening om te voorkomen dat vliegen ontsnappen. Combineer maximaal 3 flessen om een dichtbevolkte kooi met 200 tot 500 vliegen te produceren.
   4. Transfer vliegt in de collectie kooi door te tikken op een vlieg fles tegen een harde ondergrond herhaaldelijk (om de vliegen verdoven). Open en omker de vliegfles over de trechter van de inzamelkooi. Tik een paar keer op de open fles op de opvangkooi om vliegen in de opvangkooi te laten vallen.
   5. Sluit de open vliegfles door deze snel op de stekker te zetten. Tijdens het overbrengen van de open vliegfles van de trechter naar de stekker, zorg ervoor dat de fles opening punten naar beneden als vliegen hebben de neiging om omhoog te kruipen uit de buurt van de bron van het tikken.
   6. Druk de trechter tegen de vluchtkooi opening en tik de kooi herhaaldelijk op een harde ondergrond om de vliegen naar binnen te verdoven. Verwijder onmiddellijk de trechter en zet een verse druivenplaat vast aan de opening van de vliegkooi. Gebruik etiketterende tape om de druivenplaat te beveiligen. Herhaal dit proces om maximaal 3 flessen te combineren om een dichtbevolkte inzamelkooi te produceren.
      OPMERKING: Als alternatief kunnen vliegen worden verdoofd met behulp van CO₂ of andere vliegende slaapmiddelen; Dit zal echter de acclimatisatieperiode in stap 1.2 verhogen.
2. Acclimatiseren de nieuwe collectie kooi voor 24-48 uur. Als CO₂ of andere slaapmiddelen worden gebruikt, acclimatiseren de opvangkooi voor ten minste 48 uur.
   1. Vervang de druivenplaat in de inzamelkooi twee keer per dag door een verse met gistpasta, 8-10 uur uit elkaar.
3. Stel elke 5 dagen een verse inzamelkooi in.

2. Verzamelen en voorbereiden van embryo's voor beeldvorming

1. Embryo's verkrijgen met gesynchroniseerde ontwikkeling
   1. Wissel de druivenplaat op de inzamelkooi in met een verse met een schar gistpasta in het midden. Laat vliegen om embryo's te leggen voor 1 uur. De oude druivenplaat wegsten.
      LET OP: Vliegen kunnen embryo's bevruchten voordat ze worden gelegd. De eerste verzamelplaat zal veel van deze voorontwikkelde embryo's bevatten. Het eerst toestaan van vliegen om oude embryo's te dumpen zal de ontwikkelingssynchronisatie tussen embryo's verbeteren.
   2. Ruil de druivenplaat voor een verse met een schar van gistpasta in het midden en laat vliegen embryo's leggen gedurende 10 minuten. De oude druivenplaat wegsten.
      OPMERKING: Om te voorkomen dat de embryonale ontwikkeling op koude platen wordt vertraagd, verwarmt u de druivenplaat en de gistpasta tot kamertemperatuur voorafgaand aan gebruik.
   3. Ruil de druivenplaat met een verse (zonder gistpasta) en bewaar de oude druivenplaat, het heeft de embryo's voor beeldvorming. Indien nodig blijven verzamelen van embryo's uit deze kooi door stap 2.1.2 en 2.1.3 te herhalen.
2. Leeftijd verzamelen embryo's voor 30-45 min naar beeld syncytial divisies²³.
   OPMERKING: Om het syncytiale blastoderm stadium in de embryonale ontwikkeling in beeld te brengen, moeten de embryo's binnen 90 minuten van de collectie worden gemonteerd en op de microscoop worden gemonteerd. Bij het proberen van dit protocol voor de eerste keer, leeftijd embryo's 10-20 min in stap 2.2 om extra tijd op te zetten tussen de stappen.
3. Dechorionate embryo's met 50% bleekmiddel in DI water.
   1. Breng oude embryo's van stap 2.2 over in een zeef van 140 nm door de druivenplaat met DI-water te vullen, de embryo's voorzichtig los te maken met een penseel en het water met embryo's in de 140 nm-zeef te gieten(figuur 1A).
      LET OP: Dit kan worden gedaan over een gootsteen of 1.000 mL bekerglas.
   2. Spoel embryo's krachtig af met een DI-water met een spuitfles. Droge embryo's door de zeef op een droge papieren handdoek te vloeien. Dep de zeef tot hij stopt met het achterlaten van watersporen op de papieren handdoek(figuur 1B).
      OPMERKING: Verwijder alle gistpasta uit embryo's omdat het bleekwaterbehandeling in de volgende stap ineffectief kan maken.
   3. Vul een lege plaat van 10 cm met vers bereid 50% bleekmiddel verdund met DI-water (1:1 bleekwater: DI-water). Dompel de zeef in 50% bleekmiddel voor 2 min 45 s. Start een stopwatch zodra de zeef raakt de 50% bleekmiddel. Dep de zeef in en uit de 50% bleekmiddel 3-4x in de eerste 15 s te breken embryo klonters (Figuur 1C).
   4. Spoel embryo's krachtig af met DI-water met een spuitfles. Droog de embryo's door de zeef op een droge papieren handdoek te zeven. Herhaal krachtig spoel- en deslotdroogproces voor 5x(figuur 1D).
      LET OP: Dit is de belangrijkste stap voor het verwijderen van overgebleven chorion. Gebruik een volledige DI spuitfles en gebruik de helft van de fles in deze stap.
   5. Breng de desp met behulp van een penseel²¹ ( Figuur1E) de depgedroogde embryo's van de zeef naar een druivenplaat van 10 cm
      LET OP: Handmatige dichlorination kan worden gebruikt als alternatief voor bleekmiddel decorination²⁴.

Figuur 1: Embryodechorionatie. A) Embryo's werden verzameld met behulp van een DI H20 spuitfles, penseel en 140 nm zeef. (B) Embryo's werden krachtig gespoeld met behulp van een DI H20 spuitfles en dep droog over een papieren handdoek. (C) Dechorionatie van embryo's werd uitgevoerd in 50% bleekmiddel gedurende 2 min en 45 s. (D) Embryo's werden krachtig gespoeld met behulp van een DI H20 spuitfles en dep droog over een papieren handdoek. Dit werd 4 keer herhaald om overtollige chorion te verwijderen. (E) Embryo's werden vervolgens met een kwast overgebracht naar 10 cm druivenplaat. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

3. Montage van embryo's tot coverslips

1. Onder een stereomicroscoop uitgerust met overhead gans nek verlichting, organiseren twee rijen van 15-20 embryo's op een schone sectie van druivenplaat met behulp van een ei picker tool. Lijn de embryo's aan hun ventrale kant in dezelfde oriëntatie met betrekking tot voorste en achterste uiteinden. Om eiplukkers fijne tip roestvrijstalen pincet te laten buigen tot een hoek van 45°. Voor het herzien van D / V embryo's oriëntatie zie Campos-Ortega et al.²⁰.
   OPMERKING: Het is belangrijk dat het ventrale oppervlak op de druivenplaat zit, omdat de embryo's in stap 3.5 op een afdeksel worden gedrukt, waardoor het rugoppervlak wordt blootgetrokken voor beeldvorming. Aangezien het rugoppervlak veel vlakker is dan het ventrale oppervlak, verhoogt de beeldvorming van het rugzijdeoppervlak het aantal kernen dat aanwezig is in een enkel Z-vlak.
2. Bereid 75 mm x 25 mm siliconen spacer coverslip.
   LET OP: Dit kan van tevoren worden voorbereid. Bereid verschillende coverslips en bewaar ze in een diavak om ze schoon te houden.
   1. Traceer de omtrek van een 75 mm x 25 mm coverslip op een 1,6 mm dikke siliconen afstandsplaat en knip de siliconen afstand met een schaar (Figuur 2A).
   2. Knip met een scheermesje een inzet van 40 mm x 15 mm uit de afstand (figuur 2A).
   3. Sluit de afstandsaar aan op de coverslip en streep 10 μL heptanelijm langs de blootgestelde coverslip glas inzet(figuur 2A).
      OPMERKING: Putting down en even streak zorgt ervoor dat embryo's op hetzelfde z-vlak worden weergegeven.
3. Terwijl de heptanelijm van stap 3.2.3 droogt, knipt een rechthoekig gedeelte van de druivenplaat met de embryo's uit stap 3.1.
   1. Gebruik een scheermesje om een rechthoek (kleiner dan 40 mm x 15 mm) rond de twee rijen embryo's te snijden. Verwijder de rechthoek nog niet.
   2. Knip een tweede rechthoek naast de eerste. Verwijder de tweede rechthoek met behulp van de rechte randzijde van een roestvrijstalen spatel.
   3. Schuif voorzichtig de rechte rand van een roestvrijstalen spatel onder de eerste rechthoek en verwijder deze(figuur 2B).
4. Plaats de druivenplaat uitsnijding met embryo's aan de buitenzijde van een schaal van 3,5 cm(figuur 2C).
5. Onder een stereomicroscoop, lager een voorbereide coverslip over de embryo's en druk voorzichtig de twee rijen embryo's op de lijm (Figuur 2D).
6. Als microinjecterende embryo's, overslaan naar stap 4.1. Als microinjecting niet verder stap 3.7.
7. Bedek embryo's door het vullen van de siliconen spacer (halverwege de top) met 1:1 - halocarbon olie 700: halocarbon olie 27.
8. Lijn de onderste randen van een 4-slide plaat adapter met dubbelzijdige tape om te voorkomen dat de cover slip bewegen, maar zorg ervoor dat de tape niet in het pad van de objectieve lens. Deze tape is kritiek. Als de coverslip alleen op de adapter zit, zal deze tijdens de overname bewegen. Monteer de afdekslip op de 4 schuifplaatadapter.

Figuur 2: Coverlip voorbereiding en montage. (A) Een omtrek van 75 mm x 25 mm coverslip werd getraceerd op een 1,6 mm dikke siliconen plaat. Gebruik een schaar om de omtrek uit te snijden. 40 mm x 15 mm inzet werden uitgesneden uit de siliconen spacer en vervolgens gemonteerd op de coverslip. Gestreept 15 μL in het midden van de inzet. (B) Twee rijen van 15-20 embryo's werden georganiseerd op een druivenplaat in een gebied kleiner dan 40 mm x 15 mm, waarna dat gebied werd uitgesneden met behulp van een scheermes en roestvrijstalen spatel. (C) Druivenplaat uitgesneden werden geplaatst op de top van een lege 3,5 cm schotel. (D) Onder een stereomicroscoop werd de coverslip van (A) verlaagd en werden de embryo's op de lijmstreep geplakt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

4. Uitdrove embryo's en micro-injecties

1. Plaats de coverslip met embryo's over een glijbaan om te voorkomen dat de onderkant van de coverslip vuil wordt tijdens uitdroging en micro-injectie.
   LET OP: De afslag slip zal worden afgebeeld zonder een dia aan verbonden. Daarom is een omgekeerde microscoop nodig voor beeldvorming.
2. Verwijder embryo's gedurende 5-10 minuten, afhankelijk van de temperatuur van de kamer. De embryo's die in de representatieve resultaten voor beeldvorming werden gebruikt, werden gedurende 7 minuten bij 20 °C uitgedroogd in een kamer met een 1:1 laag silicagelkralen over een droogmiddel (figuur 3A).
3. Bedek onmiddellijk na uitdroging embryo's met 1:1 - halocarbon olie 700: halocarbon olie 27. Vul de siliconen spacer halverwege de top.
   LET OP: Het is belangrijk om een hoge viscositeit halocarbon olie mengen met een lage viscositeit halocarbon olie. Pure halocarbon olie 700 (hoge viscositeit) vertraagt celcycli progressie 30 min post toepassing. Een 1:1 mengsel van halocarbon olie 700 en halocarbon olie 27 vast dit artefact.
4. Laad microinjectienaalden met injectant, monteer er vervolgens een aan de microinjector en snijd deze onder druk open.
   OPMERKING: Oefen stap 4.4 een paar keer voordat u de volledige test uitvoert met waardevolle reagentia. Dit is de moeilijkste stap in het microinjectieproces.
   1. Laad microinjectienaalden met 2 μL injectant met behulp van een verlengde laadpunt. Slechts een micro-injectie naald is vereist, maar het is goed om reserve geladen naalden in de buurt hebben dus bereid 2 of 3 naalden.
      LET OP: Raadpleeg de tabel met materialen voor specificaties over uitgebreide laadtips. Microinjectienaalden kunnen niet worden geladen zonder uitgebreide laadtips vanwege de unieke aard van onze microinjectietechniek, die afhankelijk is van het opbouwen van luchtdruk in een verzegelde en geladen naald voordat de punt wordt geopend.
   2. Monteer een naald op de microinjector en druk de zuiger halverwege de punt. Het doel is om de luchtdruk in de glazen capillaire(figuur 4A)te verhogen.
      OPMERKING: Gebruik een zuiger op basis van minerale olie gebaseerde microinjector zonder minerale olie. In plaats van de bouw druk met minerale olie, gebruik maken van de zuiger om luchtdruk op te bouwen.
   3. Laat de glazen naald op een glazen schuif en snijd de punt van de naald open met behulp van een nieuwe #9 scheermes. Snijd de naald onder een hoek van 45° om een scherpe open punt te produceren. De injectant moet naar beneden stromen naar de onderkant van de punt zonder uit de naald te stromen. Voeg voorzichtig 20 μL halocarbonolie toe over de punt van de naald en snijd deze opnieuw open bij 45°. De injectant moet snel beginnen te stromen.
   4. Onmiddellijk lagere luchtdruk door het intrekken van de zuiger, maar zorgen voor een continue stroomsnelheid om te voorkomen dat de naald verstopt met embryomembraan tussen injecties. (Figuur 4B).
      OPMERKING: Als de injectant duidelijk is, bekijk dan de injectant stroomsnelheid door de microinjectienaald in en uit halocarbon olie te tillen en de mate van vorming voor injectantdruppels onder een stereomicroscoop waar te nemen. Pas de luchtdruk door de plunger een paar klikken per keer te deprimeren en dip vervolgens de microinjectiepunt in en uit halocarbonolie om de mate van vorming voor nieuwe druppels na aanpassing te bekijken.
   5. Gebruik de micromanipulator om de naald in het midden van het gezichtsveld te plaatsen, til de naald op met behulp van de micromanipulator en verwijder de glazen schuif van onder het. De naald is nu gekalibreerd voor injectie.

Figuur 3: Uitdrogingskamerdiagram. (A) Dit is een diagram van een uitdrogingskamer. De kamer bestaat uit een 1:1 laag silica gel kralen over een laag droogrite. Om uitdroging uit te voeren, werden embryo's geplaatst op de top van een enkele put plaat deksel. De uitdroging kamer werd gesloten 7 min. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

5. Microinject embryo's
   1. Plaats de embryo's op het stereomicroscoopstadium onder microinjectienaald, maar laat de naald niet zakken.
   2. Focus op embryo's bij 50x vergroting.
   3. Laat de naald zakken totdat deze in hetzelfde focusvlak komt als de embryo's. Het verplaatsen van de glijbaan met de ene hand en het bedienen van de microinjector met de andere, injecteren een rij embryo's.
   4. Hef de naald op en draai de glijbaan 180° om de tweede rij embryo's bloot te stellen aan de microinjectienaald. Laat de naald zakken en injecteer de tweede rij embryo's.
      LET OP: Probeer dit te doen in minder dan 10 minuten. Laat een aantal niet-geïnjecteerde embryo's worden gebruikt als controles.

Figuur 4: Preparaat van de microinjectienaald. (A) In dezeillustratie is de intensiteit van magenta in naald representatief voor de luchtdruk. Een geladen naald werd gemonteerd op de microinjector en de zuiger werd uitgebreid 50% om de luchtdruk binnenkant van de naald te verhogen. Zorg ervoor dat de zuiger maximaal wordt ingetrokken voorafgaand aan de montage. (B)De naaldpunt werd onder druk doorgesneden en de zuiger werd ingetrokken om de luchtdruk en de doorstroming te verlagen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

5. Beeldvorming op een high content analyzer

1. Maak voordat u deze test uitvoert een plaatkaart voor een diaadapter. Gebruik de plaathoudereditor in het menu Plate Map Manager om de dimensie voor een aangepaste plaatadapter in te voeren.
   LET OP: Er is een aangepaste plaatkaart gemaakt voor de commercieel beschikbare plaatadapter (zie Tabel met materialen). De plaatkaart bevat de volgende instellingen; Schuifdikte: 1000 μm, Bodemhoogte: 1.607 mm, bodemhoogtevariabiliteit: 100 μm, substraatmateriaal: glas, coverslipdikte: 150 μm, coverslippositie: onder – rijen: 1 – afstand: 56.987 mm, kolommen: 4 – afstand 28.391, grootte en vorm: rechthoek, breedte 23.00 mm, hoogte: 73.00 mm, verschuiving tot A1 21.29 mm – 42.74 mm)
2. Laad de schuifadapter op de microscoop en gebruik de functie Voorbeeld om een brightfield 10x-afbeelding van de coverslip te betegelen.
3. Selecteer een embryo boven of onder in een rij, selecteer vervolgens Objectief en schakel over naar 60x (NA 0,95). Bepaal een geschikte blootstelling voor het gewenste fluorescentiekanaal.
   OPMERKING: Houd de laserintensiteit onder 25% voor live celbeeldvorming.
4. Gebruik op het hoofddashboard de functie Voorbeeld om een fluorescerende 60x-afbeelding met beide rijen embryo's te betegelen.
5. Selecteer op het hoofddashboard het vervolgkeuzemenu Binning en stel de binning in op 1 x 1 voor een optimale resolutie.
6. Gebruik het tabblad z Stack setup om parameters voor z-stacks te definiëren.
   1. Gebruik op het tabblad z Stack Setup de pijlen Omhoog en Omlaag om vervolgens de boven- en onderkant z-stacklimieten te definiëren. Zodra de boven- en onderkant zijn gedefinieerd, selecteert u het groene potloodpictogram om de z-stackpositie op te slaan. Let op de z stack positie als het zal worden gebruikt in stap 5.6.5.
   2. Gebruik op het tabblad z Stack setup het invoervak z Stap definiëren om de afstand tussen z-segmenten te definiëren.
      OPMERKING: Het totale aantal segmenten wordt bepaald door stap 5.6.1 en 5.6.2 te moduleren.
   3. Klik op het hoofddashboard met de rechtermuisknop op het fluorescerende kanaal en gebruik het vervolgkeuzemenu Afbeeldingsmodus om de beeldmodus in te stellen op 3D.
   4. Selecteer op het hoofddashboard de laserautofocusvak om autofocus uit te schakelen.
   5. Definieer op het hoofddashboard de initiële focus met de z-stackpositie vanaf stap 5.6.1 en selecteer vervolgens de functie Eerste focusvak om de functie' Opnieuw scherpstellen bij elk tijdspunt' uit te schakelen.
7. Gebruik op het tabblad Velden het vervolgkeuzemenu Veldplaatsing om aangepaste puntenin te schakelen en gebruik de pijlen om punten voor beeldvorming te selecteren.
   OPMERKING: Het tijdsinterval tussen acquisities (stap 5.8) bepaalt hoeveel aangepaste punten tegelijkertijd kunnen worden weergegeven.
8. Selecteer op het tabblad Tijdreeks het vak Tijdreeksen ver aanschaffen om de functie tijdreeksen in te schakelen en definieer vervolgens het totale aantal tijdstippen.
   OPMERKING: 6 aangepaste punten x 5 z segmenten x 80 stapels = 2.400 afbeeldingen, 2.400 afbeeldingen x 8,2 MB per afbeelding = schijfruimte van 19,68 GB.
9. Gebruik op het hoofddashboard het vak Naaminvoer om de acquisitie-instellingen een naam te geven en selecteer vervolgens Bestand en Opslaan om de acquisitie-instellingen op te slaan.
10. Selecteer op het hoofddashboard de knop Scannen om de acquisitie uit te voeren.

6. Na beeldverwerking

1. Sleep en drop het xdce-bestand in Fiji om de afbeeldingsreeks te openen als een multidimensionale hyperstack.
2. Sla de hyperstack op als een tif-bestand.
3. Maak maximale intensiteitsprojecties en sla ze op als tif-bestanden.
4. Stel een bibliotheek samen met maximale intensiteitsprojecties en bouw een pijplijn voor gegevensextractie en -analyse.

Resultaten

De in dit protocol gepresenteerde aanpak werd gebruikt om de rol van microtubuli in Endoplasmic Reticulum (ER) reorganisatie tijdens mitose in het Drosophila embryo¹⁵te onderzoeken. Tijdens mitose, de structuur van de ER toont een dramatische reorganisatie, echter, de krachten die rijden deze veranderingen zijn slecht begrepen. Onlangs werd aangetoond dat een familie van ER-vormgeving eiwitten de vorming van ER-tubule^25,26,27,28bevordert , die bekend staan om hun nabijheid met microtubuli²⁸. Om de rol microtubuli op ER-morfologie te bestuderen, werden de methoden in het protocol gebruikt om gegevens te genereren om de effecten van verschillende microinjected drugbehandelingen op ER-reorganisatie tijdens mitose kwantitatief te vergelijken. Colchicine, dat nieuwe microtubulial polymerisatie voorkomt, bleek de reorganisatie van de SEH tijdens mitose drastisch te verminderen, zoals aangegeven in figuur 5 en figuur 6. Bovendien maakte de hier beschreven aanpak de productie van time laps-beeldgegevens voor 32 embryo's mogelijk. Gemiddelde en maximale intensiteit metingen werden geproduceerd uit 12.800 regio's van belang met behulp van een aangepaste MATLAB script, die ook gegenereerd beschrijvende en inferential statistieken van vitaal belang voor het maken van vergelijkingen tussen medicamenteuze behandelingen. Door de beschikbaarheid van moleculaire sondes en het gemak van microinjecties, zijn de hier beschreven methoden gemakkelijk aan te passen om een verscheidenheid aan biologische processen te bestuderen via fluorescentieintensiteit kwantificering.

Figuur 5: Representatieve afbeeldingen van Rtnl1-GFP en ReepB-GFP verrijking bij de aspolen tijdens mitose. (A) 60x gezichtsveld van ReepB-GFP tijdens mitose in celcyclus 10. Het blauwe vierkant vertegenwoordigt het gezichtsveld dat wordt gebruikt voor panelen B-E. Paneel A wordt verwerkt met een drempelwaarde binair filter. Dit filter is niet toegepast op Panels B-E omdat gegevens van pixels onder de ingestelde drempelwaarde worden uitgesloten. (B,D) ReepB-GFP in controle, en in colchicine. C,E) Rtnl1-GFP in control, en in colchicine. Dit cijfer is gewijzigd van Diaz et al.¹⁵. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 6: Kwantificering van Rtnl1-GFP en ReepB-GFP verrijking bij de aspolen tijdens mitose. 20 spindels en 20 cytoplasma ROI's in 10 frames werden geanalyseerd voor 32 embryo's onder de volgende omstandigheden. (A) 10% DMSO-controle-injecties voor Rtnl1-GFP. Controleembryo's vertoonden een 0,1-voudige toename van de verrijking (p<0,001 voor alle monsters op T210) in vergelijking met niet-geïnjecteerde monsters (p < 0,001 voor alle monsters op T210). (B) ReepB-GFP embryo's geïnjecteerd met 10% DMSO om als controle te dienen. Controle embryo's toonde een 0,1-voudige toename van de verrijking (p<0,001 voor alle monsters op T210) in vergelijking met niet-geïnjecteerde monsters (Figuur 1E; p < 0,001 voor alle monsters op T210). (C) Rtnl1-GFP embryo's geïnjecteerd met 5 μM Colchicine. Hier hebben we een vermindering van de Rtnl1-GFP verrijking gemeten tot spindels (p < 0,001 voor alle monsters op T210) in vergelijking met controles (A) (p < 0,001 voor alle monsters op T210). (D) ReepB-GFP embryo's geïnjecteerd met 5 μM Colchicine. We hebben een vermindering van reepB-GFP-verrijking gemeten tot spindels (p<0,001 voor alle monsters op T210) in vergelijking met controles (B) (p<0,001 voor alle monsters op T210). Dit cijfer is gewijzigd van Diaz et al.¹⁵. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

1. Gistpasta21	2. Druivenplaten21	3. Heptane Lijm24
1.1 Voeg 7 gram actieve droge gist toe aan een conische 50 ml. Voeg 9 milliliter DI water toe en meng tot zelfs standvastigheid met een metalen spatel.	2.1 Maak oplossing a: Voeg 6 gram agar toe aan 140 ml DI-water in een kolf van 250 ml en autoclave het.	3.1 Vul een glazen scintillatie flacon met 50 centimeter dubbelzijdige tape.
1.1 Voeg 7 gram actieve droge gist toe aan een conische 50 ml. Voeg 9 milliliter DI water toe en meng tot zelfs standvastigheid met een metalen spatel.	2.2 Maak oplossing b: Meng 0,1 gram methylacparbenen in 2 ml ethanol en voeg deze oplossing toe aan 60 ml druivensapconcentraat.	3.2 Voeg 20 ml heptaan toe en verzegel glazen scintillatief met parafilm. Draai 's nachts bij kamertemperatuur.
	2.3 Onmiddellijk na autoclaving oplossing a, meng in oplossing b en giet mengsel in 10 x 35mm perti gerechten. (maakt 35 druivenplaten)	3.3 Verwijder plastic tapepuin door lijm in 2 15 ml conische buizen over te brengen en gedurende 15 minuten bij 3000 rpm te centen.
	2.4 Laat druivenplaten 's nachts op kamertemperatuur zetten met plaatdeksels eraf. Dek platen af met deksels en bewaar in 4C° nadat ze zijn ingesteld.	3.4 Lijm supernatant overbrengen in microcentrifugebuizen van 1,5 ml voor opslag.

Tabel 1: Recepten van media en oplossingen.

Discussie

Het hier beschreven protocol is zeer veelzijdig en gemakkelijk aanpasbaar voor het bestuderen van biologische gebeurtenissen in verschillende stadia in de embryonale ontwikkeling van Drosophila. Dit protocol is zeer geschikt voor het bestuderen van biologische processen die gedurende lange perioden voorkomen. Bijvoorbeeld, studies van^{cellulaireisatie 29,30} of de vorming van heterochromatine domeinen in Drosophila^31,32 kunnen profiteren van het gebruik van de methoden beschreven in dit protocol, omdat deze processen optreden over een langere periode van tijd. Bovendien kan de steekproefgrootte worden vergroot door de vergroting te verminderen om vragen te bestuderen die minder optische resolutie vereisen, zoals de timing tussen syncytiale divisies³³ of de duur van gastrulation³⁴.  Ook een 20x doelstelling maakt het mogelijk om twee embryo's in één beeldvormingsvlak te beelden. De methoden in dit protocol bieden een dynamisch platform om biologische vragen te stellen met behulp van embryonale ontwikkeling als modelsysteem voor kwantitatieve analyse.

Er zijn 3 kritieke stappen in dit protocol. Na dedechorionatie in 50% bleekmiddel is het noodzakelijk dat embryo's 5 keer krachtig worden gespoeld en gedroogd (2.3.4). Deze stap verwijdert eventuele overgebleven kleine stukjes chorion. Overgebleven chorion zal het gezichtsveld belemmeren bij het beeldvorming van het embryo. Bij het monteren van de embryo's op de glazen coverslip (3.5), is het belangrijk om de embryo's met uniforme druk op de lijm te drukken. Dit zal de embryo's op hetzelfde z-vlak plaatsen. Bij het opensnijden van de microinjectienaald is het belangrijk om de zuiger onmiddellijk in te trekken om de stroomsnelheid van de naald aan te passen of u verliest al uw injectant.

Onze studie werd beperkt door twee factoren. De eerste factor was niet met een geautomatiseerd segmentatieproces. We ontwierpen echter een handmatig segmentatiescript met MATLAB; met een genetisch gecodeerde spindelmarker kan dit proces worden geautomatiseerd. In de toekomst willen we CNN-RFP²¹, Rtln1-GFP en CNN-RFP produceren; ReepB-GFP transgene lijnen om geautomatiseerde spindelsegmentatie mogelijk te maken. Voor meer informatie over onze MATLAB script en analyse pijplijn, verwijzen naar aanvullende materialen van Diaz et al.¹⁵. Ten tweede werden we ook beperkt door ons aankoopinterval van 35 s, waardoor we slechts 6 embryo's tegelijk konden beeld geven. Een langere acquisitie-interval zou ons in staat stellen om meer embryo's tegelijkertijd in beeld te brengen. Hoewel de doorvoer van de toedinatie van geneesmiddelen kan worden verhoogd door micro-injectie te vervangen door een permeatiestap, vonden we dit onnodig omdat onze steekproefgrootte al werd beperkt door acquisitie-interval.

Hoewel dit protocol werd gebruikt om de embryonale ontwikkeling van Drosophila in beeld te brengen, is de algemene aanpak aanpasbaar voor het bestuderen van embryonale ontwikkeling in andere meercellige modelsystemen, zoals C. elegans,Zee-egels en Xenopus. Embryo's zijn zeer nuttig voor kwantitatieve analyse, omdat ze gemakkelijk kunnen worden gesynchroniseerd via verzameling of bevruchting. Bovendien bewegen of zwemmen embryo's niet uit een gezichtsveld, waardoor het gebruik van een eenvoudige multipoint-acquisitiesoftware meerdere timelapse-video's voor kwantitatieve analyse kan produceren. Hoewel we een high content analyzer gebruikten in onze studie, kan elk omgekeerd microscoopsysteem dat in staat is multipoint acquisitie te combineren met de methoden waarnaar hierin wordt verwezen.

Vergelijkbare resultaten kunnen worden verkregen met behulp van een multipoint overname staat omgekeerde confocale microscoop; echter, de voordelen van een hoge inhoud analyzer ontstaan als men verhoogt steekproef grootte om vragen die minder resolutie in de tijd vereisen studie. Een duidelijk voordeel van het gebruik van een high content analyzer is de mogelijkheid om 4 afzonderlijke dia's tegelijkertijd te beelden in vergelijking met 1 dia op traditionele systemen. Met een volledige set van 4 dia's en 40 embryo's op elke dia kunnen 160 embryo's gedurende enkele uren worden afgebeeld, zolang het aanschafinterval minstens 15 minuten tussen de frames bedraagt. Een ander belangrijk voordeel van het gebruik van een high content analyzer is dat de monsters volledig zijn afgesloten van externe lichtbronnen, wat nodig is voor metingen op basis van fluorescentieintensiteit. Ten slotte heeft de high content analyzer die in onze studie wordt gebruikt een 5,5-megapixel CMOS-camera die een royale 221,87 μm gezichtsveld biedt bij 60x vergroting. Dit grotere gezichtsveld stelde ons in staat om een half embryo per acquisitiepunt in beeld te brengen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10 x 35mm Micro Dish	VWR	Cat #: 10799-192	N/A
100% druivensap concentraat	Welch's, 100% Concentrate Grape Juice	N/A	Koop in supermarkt
250ml Erlenmeyer kolven, smalle mond	VWR	Cat #: 10536-914	N/A
3" Non-Metallic Zeef Nr. 140	Gilson Company	SV-165 #140	N/A
4 Slide Imaging Tray	Grace Biolabs	SKU: 400104	N/A
ACROS Organics, n-Heptane, 99+%, voor spectroscopie	Fisher Scientific	Cat #: AC411255000	N/A
Acros Organics, Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absoluut, 200 proof	Fisher Scientific	Cat# : AC615095000	N/A
Acros Organics, Methyl 4-hydroxybenzoaat, 99%. (methyl paraben )	Fisher Scientific	Cat#: AC126961000	N/A
Dekglas, Rechthoekig, 25 x 75mm, #1 Float Glass	Fisher Scientific	Cat #: 50-143-782	N/A
Cultuurputjes Siliconenblad Materiaal - 1.6mm dik	Grace Biolabs	SKU: 664273	N/A
DWK Life Sciences Wheaton 20mL PET Liquid Scintillation Flessjes	Fisher Scientific	Cat #: 03-341-71A	N/A
Embryo Collectiekooi-Mini	Genesee Scientific	Cat #: 59-105	N/A
Eppendorf Microloader Pipettips	Fisher Scientific	Productcode: 10289651	N/A
Falcon 15mL Kegelcentrifuge	Fisher Scientific	Cat #: 05-527-90	N/A
Falcon 50mL Kegelcentrifugebuizen	Fisher Scientific	Cat #: 14-432-22	N/A
Fleischmann's, Actieve Droge Gist	Fleischmann's	N/A	Koop in supermarkt
Druivenplaten	REFFER NAAR RECEPTBEREIDING	N/A	N/A
Halocarbon 27 Olie	Genesee Scientific	Cat #: 59-133	N/A
Halocarbon 700 Olie	Genesee Scientific	Cat #: 59-131	N/A
Heptaanlijm	REFFER NAAR RECEPTBEREIDING	N/A	N/A
Industriële Scheermesjes (Chirurgisch Koolstofstaal) Enkelzijdig Nr. 9	VWR	Cat #: 55411-050	N/A
Parafilm M Laboratorium Afdichtingsfolie, 4 inch x 250 voet Rol	Fisher Scientific	Cat #: 50-998-944	N/A
Scotch Dubbelzijdig Plakband met Dispenser, Smalle Breedte, Ontworpen voor Verlijming, 1/2" x 7 yds., 3/Pack Caddy	Fisher Scientific	Cat #: NC0879005	N/A
Silica gel kralen, droogmiddel ~ 2 - 5 mm	Millipore Sigma	SKU: 1077351000	N/A
Roestvrijstalen Lepel/Spatel	VWR	Cat #: 470149-044	N/A
W.A. Hammond Drierite Indicaterende Absorptiemiddelen	Fisher Scientific	Cat #: 23-116582	N/A
Gistpasta	REFFER NAAR RECEPTBEREIDING	N/A	N/A
APPARATUUR
Allegra X-12 Tafelcentrifuge	Beckman Coulter	N/A	Je zult toegang nodig hebben tot 15 ml kegelcentrifuge-inzetstukken.
Autoclaaf	N/A	N/A	Elke autoclaaf is prima.
Drummond Nanoject II Microinjector.	Drummond Scientific	N/A	Dit is een op minerale olie gebaseerd injectiesysteem.
GE Healthcare IN Cell Analyzer 6000.	GE healthcare	N/A	Een snelle confocale microscoop die geschikt is voor multipoint-acquisitie kan worden vervangen.
Koelkast (4C°)	N/A	N/A	Vlieg media en gistpasta moeten worden bewaard bij (4C°).
Zies Stemi 508 Stereo Microscoop met Transilluminatie basis 300 en overhead gooseneck verlichting.	Zeiss Microscopy	N/A	De transilluminatiebasis en gooseneckverlichting zijn noodzakelijk.