Method Article

Diffusional Dynamics of Gold Nanorods visualiseren op celmembraan met behulp van Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

DOI:

10.3791/61603

⸱

March 5th, 2021

 ,  , 
1Department of Chemistry, Key Laboratory of Bioorganic Phosphorus Chemistry & Chemical Biology (Ministry of Education), Tsinghua University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier tonen we het gebruik van traditionele donkerveldmicroscopie om de dynamiek van gouden nanorods (AuNRs) op celmembraan te monitoren. De locatie en oriëntatie van enkele AuNR's worden gedetecteerd met behulp van ImageJ en MATLAB, en de diffusieve toestanden van AuNR's worden gekenmerkt door analyse van het volgen van afzonderlijke deeltjes.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het analyseren van de diffusionele dynamiek van nanodeeltjes op het celmembraan speelt een belangrijke rol bij een beter begrip van het cellulaire opnameproces en biedt een theoretische basis voor het rationele ontwerp van de levering van nanogeneeskunde. Single particle tracking (SPT) analyse kan de positie en oriëntatie van individuele nanodeeltjes op celmembraan onderzoeken en hun translationele en rotatietoestanden onthullen. Hier laten we zien hoe we traditionele donkerveldmicroscopie kunnen gebruiken om de dynamiek van gouden nanorods (AuNRs) op levend celmembraan te monitoren. We laten ook zien hoe u de locatie en oriëntatie van AuNRs extraheren met Behulp van ImageJ en MATLAB, en hoe u de diffusieve statussen van AuNRs karakteriseren. Statistische analyse van honderden deeltjes toont aan dat enkele AuNRs Browniaanse beweging uitvoeren op het oppervlak van U87 MG celmembraan. Individuele longtrajectanalyses tonen echter aan dat AuNR's twee duidelijk verschillende soorten bewegingstoestanden op het membraan hebben, namelijk langeafstandstransport en opsluiting met een beperkt oppervlak. Onze SPT-methoden kunnen mogelijk worden gebruikt om de oppervlakte- of intracellulaire deeltjesdiffusie in verschillende biologische cellen te bestuderen en kunnen een krachtig hulpmiddel worden voor onderzoek naar complexe cellulaire mechanismen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De dynamiek van nanodeeltjes (NPs) op het membraan is nauw verbonden met het cellulaire opnameproces, wat essentieel is voor het begrip van celfuncties, virale of bacteriële infecties en de ontwikkeling van kunstmatige nanomedische toedieningssystemen1,2. Single particle tracking (SPT) techniek is een robuust hulpmiddel voor het karakteriseren van het heterogene gedrag van NPs3,4. Over het algemeen is celmembraan vloeibaar, wat betekent dat de componenten zoals eiwitten en lipiden zijdelings kunnen bewegen in het plasmamembraanvlak5,6,7. De spatiotemporale complexiteit van membraanorganisatie en -structuur kan leiden tot spatiotemporale heterogeniteit van de interactie tussen NPs en membraan. Daarom vereist directe visualisatie van de beweging van NPs op het membraan zowel een hoge ruimtelijke als temporele resolutie.

Single particle tracking microscopie die de lokalisatie van individuele deeltjes in levende cellen monitort met een ruimtelijke resolutie van tientallen nanometers en een tijdsresolutie van milliseconden is goed ontwikkeld om de NPs of membraanmoleculendynamica8,9te bestuderen . Fluorescentie-gebaseerde microscopische beeldvormingstechnieken zijn waardevolle instrumenten geworden voor het observeren van NPs/moleculen in de leefomgeving9,10,11,12. Bijvoorbeeld, totale interne reflectie fluorescentie microscopie, die dunne lagen (~ 100 nm) van het monster op de substraat / oplossingsinterface met een hoge spatiotemporale resolutie in beeldbrengen,is veel gebruikt in studies naar membraanmoleculendynamiek13,14. De inherente nadelen van enkele fluorforen, zoals lage intensiteit en snelle onomkeerbare fotobleaching, verminderen echter de nauwkeurigheid en duur van tracking13. Daarom hebben niet-fluorescerende plasmonische NPs, die de fluorescerende sondes vervangen, steeds meer aandacht getrokken in langetermijnbeeldvormingsstudies vanwege hun unieke optische kenmerken15. Op basis van de verstrooiingssignalen van plasmonische NP-sondes zijn verschillende soorten optische microscopische beeldvormingstechnologieën gebruikt om het mechanisme van biologische processen te bestuderen, zoals donkerveldmicroscopie (DFM)16,interferometrische verstrooiing (iSCAT) microscopie17 en differentiële interferentiecontrastmicroscopie (DICM)18. Bovendien kan de bewegings - en rotatiedynamiek van AuNRs worden verkregen met behulp van DFM en DICM18,19,20,21,22. Meestal wordt in een SPT-experiment de beweging van het object geregistreerd door de optische microscoop en vervolgens geanalyseerd door SPT-analysemethoden3. De tijdgeopgeleerde trajecten en oriëntatiehoeken die door individuele NPs worden gegenereerd, zijn normaal stochastisch en heterogeen, dus het is noodzakelijk om overvloedige dynamische informatie te presenteren met verschillende analysemethoden.

Hier bieden we een geïntegreerd protocol dat de dynamiek van AuNR's op celmembraan bewaakt met behulp van DFM, de locatie en oriëntatie van AuNR's extraheert met ImageJ en MATLAB en de verspreiding van AuNR's karakteriseert met SPT-analysemethoden. Als demonstratie laten we hier zien hoe we het SPT-protocol kunnen gebruiken om de dynamiek van ongewijzigde AuNR's (CTAB-AuNRs, gesynthetiseerd door cetyltrimethylammonium ammoniumbromidemolecuul als beschermend middel) op U87 MG-celmembraan te visualiseren. Er is aangetoond dat CTAB-AuNRs eiwitten in biologische omgeving kunnen adsorberen, op celmembraan kunnen bewegen en vervolgens cellen2,20,22kunnen binnendringen . U87 MG-cel is de meest voorkomende en meest kwaadaardige tumor van het centrale zenuwstelsel en de membraanreceptoren worden abnormaal uitgedrukt. De membraanreceptoren kunnen interageren met eiwitten op AuNR's, die de dynamiek van AuNR's beïnvloeden. Ons protocol is algemeen toepasbaar op andere SPT experimenten op het gebied van biologie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Celcultuur

  1. Bereid het volledige medium voor U87 MG-cellen voor door foetaal runderserum toe te voegen (eindconcentratie 10%) en penicilline-streptomycine (eindconcentratie 1%) tot het minimum essentiële medium (MEM). Gebruik plastic cel kweek schotel voor cellen subcultuur.
  2. Passagecellen 2 tot 3 keer per week.
    1. Verwijder het kweekmedium en spoel de cellaag af met dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (D-PBS) 2 ~3 keer bij samenvloeiing (80%~90%).
    2. Voeg 1,0 tot 2,0 ml Trypsine-EDTA-oplossing toe aan de celkweekschaal en observeer cellen onder een omgekeerde microscoop totdat cellen rond worden (3 ~ 5 min).
    3. Voeg 3,0 ml voorbereid compleet medium toe en verspreid de cellen door voorzichtig te pipetten.
    4. Voeg celsuspensie (1 ml) toe aan een nieuwe kweekschaal met vers celmedium (3 ml) en resuspendeer de cellen.
  3. Houd de cellen op 37 °C en 5% CO2 in een vochtige atmosfeer.

2. Microscoop dia voorbereiding

OPMERKING: U87 MG-cellen van de derde tot tiende generatie met hoge activiteit worden gebruikt in NBP-experimenten.

  1. Steriliseer 22 mm × 22 mm coverslips die al zijn gereinigd met Piranha-oplossing door onder te dompelen in ethanol (99,9%).
  2. Gebruik een tang om de afdekslip uit de ethanoloplossing (stap 2.1) te halen en steriliseren door ethanol op de vlam te verbranden. Zodra alle ethanol is verbrand, plaatst u coverslips in een plastic celkweekschaal (35 x 10 mm) gevuld met 2 ml celmedium (geen fenolrood).
  3. Voeg 50 μL van de celsuspensie van stap 1.2.3 toe aan de deklip en duw de schaal voorzichtig heen en weer en links en rechts om de cellen gelijkmatig te verdelen. Plaats het in een vochtige atmosfeer.
  4. Wanneer U87 MG-cellen op de coverslip 20%-40% confluency (~12 h) bereiken, voeg dan 20 μL CTAB-AuNRs (138 pM) toe aan de schaal en verspreid. Incubeer gedurende 5 minuten in de vochtige atmosfeer.
  5. Voeg in stap 2.4 100 μL van het kweekmedium (geen fenolrood) van de schaal toe aan de groef van de gegroefde glazen glijbaan(figuur 1),die is voorgecleaned met Piranha-oplossing.
  6. Haal de coverslip uit de schaal en omgekeerd aan de bovenkant van de groef van de glazen dia van de microscoop (figuur 1). Sluit af met nagellak, laat het drogen en plaats het op het podium om SPT-experimenten uit te voeren.

3. Het uitvoeren van experimenten voor het volgen van enkelvoudige deeltjes met darkfieldmicroscopie (figuur 1).

  1. Plaats een druppel olie op de met olie ondergedompelde darkfieldcondensor (NA 1.43-1.20) en draai aan de knop om de condensor in contact te laten komen met de glazen schuif.
  2. Leg een druppel olie op de bovenkant van het afdekglas en draai aan de scherpstelknop om de 60x olie-onderdompelingsdoelstelling (NA 0,7–1,25) de olie te laten raken.
  3. Schakel de lichtbron in en draai lichtjes aan de scherpstelknop om het beeldvlak scherp te stellen.
    OPMERKING: In het gezichtsveld is de achtergrond zwart, de cellen helder en de CTAB-AuNRs (beeldverhouding ~ 2:1, figuur 2)zijn kleine gekleurde (rode, gele of groene) verstrooiingsvlekken.
  4. Leg voorbeeldverstrooiingslicht vast met een CMOS-kleurencamera. Klik op "Camerapictogram" in de software om TIFF-indeling op te nemen en te exporteren om afbeeldingen op te slaan.

4. Gegevensverwerving

  1. Eén langetermijntraject extraheren
    1. Werk zoals beschreven in figuur 3 om de donkere veldafbeeldingen uit de tijdreeks om te zetten van de modus "RGB-kleur" naar de modus "8 bits". Klik in afbeelding J op Afbeelding | Type | 8 bit. Als u het contrast wilt aanpassen, klikt u op Afbeelding | | aanpassen Helderheid | Contrast , contrast.
    2. Selecteer een doeldeeltje en snijd de achtergronden van de tijdreeks af door te boksen en de achtergrond te verwijderen met "Ctrl +X".
    3. Open het venster deeltjesdetectie en deeltjeskoppeling door op de "Plug-ins | Particle Tracker Klassieke | Deeltjestracker".
    4. Stel Radius in op 6, Cutoff op 0 en Percentiel op 0,01%.
      OPMERKING: Om het deeltje te detecteren, past u boven drie parameters aan met behulp van Preview. Zorg ervoor dat de straal iets groter is dan het beoogde deeltje en kleiner is dan de kleinste interdeeltjesscheiding. Percentiel is de ondergrens van intensiteitsverdeling die kandidaatdeeltjes zijn.
    5. Stel het koppelingsbereik in op 5 en Verplaatsing op 10.
      OPMERKING: Als u het deeltje wilt koppelen aan opeenvolgende aangrenzende frames, past u de bovenstaande twee parameters aan. Verplaatsing is de maximale pixels die een deeltje kan verplaatsen tussen twee volgende frames, en Link Range is het aantal opeenvolgende frames waarmee rekening moet worden gehouden bij het bepalen van de beste overeenkomende overeenkomst.
    6. Klik op "OK" om het venster ParticleTracker-resultaten te openen om de resultaten te zien.
    7. Klik op "Visualiseer alle trajecten" om de gegenereerde trajecten te inspecteren.
    8. Klik bovenaan op het menu "Deeltjes opnieuw koppelen" om de gedetecteerde deeltjes opnieuw te koppelen aan verschillende linkbereik- en percentielparameters, als het door software gegenereerde traject niet overeenkomt met het bewegende traject van de AuNR.
    9. Klikop" Volledig rapport opslaan " om resultaten op te slaan als het door software gegenereerde traject en het bewegende traject van de AuNR overeenkomen.
      OPMERKING: Een voorbeeld van het extraheren van één langetermijntraject met afbeelding J wordt weergegeven in figuur 4.
  2. Multi-trajecten extraheren
    OPMERKING: Een voorbeeld van het extraheren van meerdere trajecten met Fiji is weergegeven in figuur 5. Er zijn verschillende fasen en elke fase vormt een stap in het trackingproces. Het resultaat van elke stap wordt onmiddellijk weergegeven, waardoor de gebruiker terug kan gaan naar het aanpassen van instellingen wanneer de uitvoer onbevredigend is.
    1. Werk zoals beschreven in figuur 3 om de donkere veldafbeeldingen uit de tijdreeks om te zetten van de modus "RGB-kleur" naar de modus "8 bits". Klik in het image J-pad op "Afbeelding | Type | 8 bit". Klik op " Afbeelding | om hun contrast aan te passen | aanpassen Helderheid | Contrast".
    2. Open het startpaneel door te klikken op "Plug-ins | | volgen TrackMate". Klik op "Volgende".
    3. Kies de "LoG detector" in het vervolgkeuzemenu en klik op "Volgende".
    4. Parameters van het configuratiepaneel van de detector aanpassen. Stel de geschatte BLOB-diameter in op 10, stel Drempel in op 0 en selecteer "Subpixellokalisatiedoen ".
    5. Klikop" Volgende " om het eerste steunfilterpaneel te openen.
      OPMERKING: Verschillende parameters kunnen worden aangepast om de doelpunten verder te optimaliseren. In dit voorbeeld zijn geen andere parameters aangepast.
    6. Klik op "Volgende" en selecteer "HyperStack displayer" in het vervolgkeuzemenu.
    7. Klikop" Volgende " om het filterpaneel Van de steun te openen. Stel de kwaliteit in boven 1,88, X boven 38,86, Y boven 56,54.
    8. Klik op "Volgende" en selecteer "Simple LAP tracker" in het vervolgkeuzemenu. Configureer de eenvoudige LAP-tracker door drie parameters aan te passen, dat wil zijn de Linking max distance = 15, Gap-closing max distance = 15 en Gap-closing max frame gap = 5.
      OPMERKING: Linking-max afstand is de maximale verplaatsing van een punt tussen twee frames. Gap-closing max distance is de maximale verplaatsing van twee segmenten. Gap-closing max frame gap is het grootste frame tussen twee te overbruggen punten.
    9. Klikop" Volgende " om bij te houden. Als u klaar bent, klikt u verder op "Volgende".
    10. Stel filters in op tracks, zoals het instellen van het aantal plekken in het spoor boven de 300.
    11. Blijf op "Volgende" klikken totdat het laatste opslagpaneel is geopend. Selecteer "Tracks exporteren naar XML-bestand" in het vervolgkeuzemenu en klik vervolgens op "Uitvoeren" om op te slaan in csv-indeling.
  3. R/G-waarden
    OPMERKING: Verstrooiingsintensiteiten van gerichte AuNR's in de R- en G-kanalen worden verkregen uit kleuren darkfield-afbeeldingen met behulp van een code die is geschreven in MATLAB (https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020/tree/master/RGandPolarangle), en het extractieprincipe wordt weergegeven in figuur 6.
    1. Gebruik de functie van xycördinatie.m om de middelste pixelcoördinaat van de AuNR in elk frame te vinden volgens de x-y-coördinaat (geëxtraheerd door ImageJ/Fiji).
    2. Gebruik de functie van RGextractie.m om een matrix van 3 x 3 pixels af te bakeden, de 9 scattering-intensiteitswaarden van R- of G-kanalen te extraheren en een gemiddelde waarde (μ, gedefinieerd als R of G) te berekenen.
      OPMERKING: De matrix van 3 x 3 pixels is gecentreerd op de pixelcoördinaten die zijn verkregen uit stap 4.3.1.
  4. Polaire hoek
    OPMERKING: De polaire hoek is de hoek tussen de lengtegraad van de AuNR en de optische as (zoals weergegeven in figuur 1),die de ruimtelijke (Z-as) rotatiedynamiek van de AuNR kan weerspiegelen.
    1. Gebruik de functie van polarangle.m om de polaire hoeken (θ) te berekenen met de dual-channel differentiële methode22, figure-protocol-1 .

5. Data-analyse

OPMERKING: Een systematisch en robuust kader voor gegevensanalyse is essentieel voor de prestaties en efficiëntie van SPT-analysemethoden. De aangepaste software geschreven in MATLAB wordt gebruikt (https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020/tree/master/Analysis_parameters). Voor het tekenen van de percelen wordt een grafiek- en analysesoftware (zie Tabel met materialen)gebruikt.

  1. Analyseparameters
    1. Gebruik scripts van csv_data_extract_dis_vel_ss.m en csv_data_MSD.m om dynamische parameters te berekenen volgens formules in tabel 1.
      OPMERKING: Deze parameters worden gebruikt om de dynamiek van AuNR's te analyseren en bestaan uit drie delen. (1) Trajectgerelateerde parameters: verplaatsing, stapgrootte, snelheid, gyratiestraal (Rg)en draaihoek (Ta); (2) MSD-parameters: diffusiecoëfficiënt (Dt) en abnormale diffusie-exponent (α); en (3) Rotatiegerelateerde parameters: polaire hoek en rotatie-lability (σ).
MaatregelenDefinitieFysieke betekenis
Verplaatsingfigure-protocol-2Wijzigingen in de positie van objecten
Stapgroottefigure-protocol-3Afstand tussen twee aangrenzende punten
Snelheidfigure-protocol-4Snelheid van objecten beweging
Rg figure-protocol-5Bereik van objecten verplaatsen in een specifiek tijdsinterval
Ta figure-protocol-6Bewegingsrichting van objecten tussen twee aangrenzende punten
Msdfigure-protocol-7Gemiddelde bewegende afstand van objecten in een bepaald tijdsinterval
Dt figure-protocol-8Diffusievermogen van objecten
Αfigure-protocol-9Normale diffusie (α~1)
Polaire hoekfigure-protocol-103D-oriëntatie-informatie van objecten
Σfigure-protocol-11Mate van dispersie van de polaire hoekgegevensset

Tabel 1: Drie soorten parameters die voor analyse worden gebruikt. Deze omvatten trajectgerelateerde parameters (verplaatsing, stapgrootte, snelheid, Rg en Ta),MSD-parameters (MSD, Dt en α) en rotatiegerelateerde parameters (polaire hoek en rotatie-lability).

  1. Visuele analyse van traject
    OPMERKING: Trajectvisualisatie kan intuïtief de spatiotemporale heterogeniteit van deeltjesbeweging en de trajectverdeling (coördinaten) van dynamische parameters presenteren, zoals tijdmappingstraject, Rg- en Dt-mapping traject, en polaire hoek mapping traject. Kaarttrajecten werden getekend met behulp van de grafiek- en analysesoftware.
    1. Stel x coördinaat in als X, y coördinaat als Y en tijd (Rg,Dt, polaire hoek) als Z.
    2. Klik op "Plot | Plotverstrooiing | Kleurtoewijzingsplot".
    3. Voeg de kleurbalk toe.
  2. MSD-analyse
    OPMERKING: Bewegingsactiviteit en bewegingsmodus van de deeltjes kunnen worden verkregen door MSD-analyse23. Hoe groter de Dt,hoe actiever de diffusiebeweging van de deeltjes. wanneer α ~ 1, deeltjes doen normale diffusiebeweging, anders voeren ze abnormale diffusiebeweging uit.
    1. MSD-τ cijfers
      1. Stel tijdsinterval (τ) in als X, MSD-gegevens als Y.
      2. Klik op "Plot | Spreidingsplot"
      3. Gegevens aanpassen door op " | analyseren te klikken Montage | Niet-lineaire curve fitting (Functie: Allometricl)".
    2. MSD-τ dubbel-logaritmisch cijfer
      OPMERKING: MSD-τ dubbele logaritmische figuur, waarvan de helling is α en onderscheppen is Dt,kan intuïtief deeltjesbeweging presenteren.
      1. Stel logaritmisch tijdsinterval in als X en logaritmische MSD als Y.
      2. Klik op "Plot | Verstrooi plot".
      3. Gegevens aanpassen door op " | analyseren te klikken Montage | Lineaire curve fitting".
    3. D-τ-cijfer (MSD/4t)
      OPMERKING: D=MSD/4τ, is een functie van tijd τ en anomaliefactor α, en de D-τ-figuur toont direct de verandering van diffusiecoëfficiënt met de tijd. Wanneer D met de tijd toeneemt, is α groter dan 1 en doen deeltjes superdiffusiebeweging.
      1. Stel logaritmisch tijdsinterval (τ) in als X en logaritmisch D als Y.
      2. Klik op "Plot | Verstrooi plot".
      3. Gegevens aanpassen door op " | analyseren te klikken Montage | Niet-lineaire curvefitting (Functie: "Allometricl")".
        OPMERKING: Hoe korter de trajecten, hoe hoger de onnauwkeurigheid van de diffusieschattingen. Over het algemeen werden Dt en α door middel van MSD-τ-analyse van de lange intervaltijd (> 30 t) verkregen. Een eenvoudige en ruwe montage zal echter de bewegingsdetails gladstrijken. Daarom moet msd-τ-analyse van korte intervaltijd (< 10 τ) worden uitgevoerd om het bewegingsgedrag van deeltjes in korte tijd te analyseren.
  3. Statistische analyse
    1. Statistische analyse van meerdere deeltjes
      OPMERKING: Statistische analyse van meerdere deeltjes kan de bewegingstoestand van deeltjes in een ruimtelijk gebied weerspiegelen, wat indirect wijst op de ruimtelijke heterogeniteitsomgeving. Als het histogram van Dt bijvoorbeeld een grootschalige verdeling of multipiekenverdeling vertoont, betekent dit dat de bewegingsactiviteiten van deeltjes heterogeen zijn.
      1. Stel dynamische parameters (zoals Dt,Rg,max displacement) in als Y.
      2. Klik op "Plot | Histogram".
      3. Dubbelklik op het histogram en stel de grootte van de divisie of het aantal divisies in. Klikop" Toepassen ".
    2. Statistische analyse met één deeltje
      OPMERKING: De statistische analyse van enkele deeltjes kan het bewegingsgedrag van individuele deeltjes laten zien, wat ook indirect de spatiotemporale heterogeniteit van de omgeving weerspiegelt.
      1. Meerdere frames
        1. Bereken dynamische parameters (zoals Ta,stapgrootte, polaire hoek) van alle frames van één lange baan en kopieer naar de Origin-tabel en stel in als Y.
        2. Klik op "Plot | Histogram".
        3. Dubbelklik op het histogram en stel de grootte van de divisie of het aantal divisies in. Klikop" Toepassen ".
          OPMERKING: Als zowel Ta als stapgrootte een kleine waardeverdeling vertonen, doen de deeltjes een superdiffusiebeweging in kleine stappen.
      2. Vensters verplaatsen
        1. Bereken dynamische parameters (zoals Rg,Dt) van alle frames met één lange baan via de methode bewegende vensters (11 frames) en kopieer naar de origin-tabel en stel in als Y.
        2. Klik op "Plot | Histogram".
        3. Dubbelklik op het histogram en stel de grootte van de divisie of het aantal divisies in. Klikop" Toepassen ".
  4. Tijdreeksanalyse
    OPMERKING: Statistische analyse kan de bewegingsstatus van NPs onthullen en tijdreeksanalyse kan het bewegingsgedrag als een aanvulling presenteren. Door verschillende tijdreeksparameters te combineren, kan het het bewegingsgedrag van NPs op temporeel en ruimtelijk niveau discrimineren.
    1. Stel de tijd in als X, tijdreeksparameters als Y (zoals verplaatsing, polaire hoek en Rg).
    2. Klik op "Plot | Diagram met meerdere deelvensters | Gestapelde plot | Lijn + Symbool".

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In het protocol werden de ongewijzigde 40 x 85 nm CTAB-AuNRs gebruikt. Zoals weergegeven in figuur 2B, is het longitudinale plasmonische maximum op ~650 nm (rood gebied) en transversale resonantie op 520 nm (groen gebied). Eerdere literatuur heeft aangetoond dat de optische eigenschappen (zoals LSPR-intensiteit) van plasmonische AuNRs aanzienlijk zullen veranderen met hun diameter20,22. In figuur 2Ctoond...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gepresenteerde protocol wordt gebruikt om de dynamiek van AuNR's op celmembraan te bestuderen. Het protocol bestaat uit vier delen, waaronder microscopische beeldvorming, gegevensextractie, dynamische parametersberekening en data-analysemethoden, en elk onderdeel is flexibel en universeel. Daarom zijn er veel mogelijke toekomstige toepassingen, bijvoorbeeld het bestuderen van de beweging van NP-gekoppelde membraanmoleculen op membraan, endocytosedynamiek van NP-gelabelde receptoren, dynamische analyse van intracellul...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China met subsidienummers van 21425519, 91853105 en 21621003.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CTAB gecoate gouden nanostaven(CTAB-AuNRs)NanoseedzNR-40-65085 nm * 40 nm
Color CMOS cameraOlympusDP74Japan
DekglasjesCitoglasz10212222C22*22 mm
Donkerveld microscopieNikon80irechtopstaande microscoop
Foetaal bovien serum (FBS)Gibco10099141
FijiNational Institutes of Health2.0.0-rc-69/1.52 peen distributie van ImageJ
Gegroefde glazen schuifSail merk7103Enkel concaaf
Image JNational Institutes of Health1.52 j
MATLABMathWorksR2019b
MATLAB Codehttps://github.com/fenggeqd/JOVE-2020
Minimum essentieel medium (MEM)Gibco10-010-CVRmet fenol rood
Minimum essentieel medium (MEM)Gibco51200038geen fenol rood
OriginOriginLabOrigin Pro 2018C
Penicilline-streptomycineGibco15140122
Kunststof celkweekschalenFalcon353002
Kunststof celkweekschalenFalcon35300135*10 mm
U87 MG celAmerican Type Culture CollectionATCC HTB-14een humane primaire glioblastoomcellijn

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rees, P., Wills, J. W., Brown, M. R., Barnes, C. M., Summers, H. D. The origin of heterogeneous nanoparticle uptake by cells. Nature Communication. 10 (1), 2341(2019).
  2. Behzadi, S., et al. Cellular uptake of nanoparticles: journey inside the cell. Chemical Society Reviews. 46 (14), 4218-4244 (2017).
  3. Shen, H., et al. Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications. Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).
  4. Saxton, M. J. Single-particle tracking: connecting the dots. Nature Methods. 5 (8), 671-672 (2008).
  5. Kusumi, A., et al. Dynamic organizing principles of the plasma membrane that regulate signal transduction: commemorating the fortieth anniversary of Singer and Nicolson's fluid-mosaic model. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 215-250 (2012).
  6. Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. The Lateral Organization and Mobility of Plasma Membrane Components. Cell. 177 (4), 806-819 (2019).
  7. Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).
  8. von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking. Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).
  9. Rosenberg, J., Huang, J. Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (155), e59914(2020).
  10. Kusumi, A., Tsunoyama, T. A., Hirosawa, K. M., Kasai, R. S., Fujiwara, T. K. Tracking single molecules at work in living cells. Nature Chemical Biology. 10 (7), 524-532 (2014).
  11. Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. Journal of Visualized Experiments. (151), e59387(2019).
  12. Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Visualizing protein-DNA interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking. Journal of Visualized Experiments. (85), e511177(2014).
  13. Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. Probing cellular events, one quantum dot at a time. Nature Methods. 7 (4), 275-285 (2010).
  14. Mehidi, A., et al. Transient Activations of Rac1 at the Lamellipodium Tip Trigger Membrane Protrusion. Current Biology. 29 (17), 2852-2866 (2019).
  15. Ye, Z., Wang, X., Xiao, L. Single-Particle Tracking with Scattering-Based Optical Microscopy. Analytical Chemistry. 91 (24), 15327-15334 (2019).
  16. Pan, Q., Zhao, H., Lin, X., He, Y. Spatiotemporal Heterogeneity of Reactions in Solution Observed with High-Speed Single-Nanorod Rotational Sensing. Angewandte Chemie. International Ed. in English. 58 (25), 8389-8393 (2019).
  17. Taylor, R. W., et al. Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane. Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).
  18. Chen, K., et al. Characteristic rotational behaviors of rod-shaped cargo revealed by automated five-dimensional single particle tracking. Nature Communication. 8 (1), 887(2017).
  19. Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Y. Direct observation of the orientation dynamics of single protein-coated nanoparticles at liquid/solid interfaces. Angewandte Chemie. International Ed. in English. 53 (27), 6951-6955 (2014).
  20. Lehui, X., Yan, H., Edward, S. Y. Three Dimensional Orientational Imaging of Nanoparticles with Darkfield Microscopy. Analytical Chemistry. 82, 5268-5274 (2010).
  21. Ge, F., Xue, J., Wang, Z., Xiong, B., He, Y. Real-time observation of dynamic heterogeneity of gold nanorods on plasma membrane with darkfield microscopy. Science China Chemistry. 62, 1072-1081 (2019).
  22. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  23. Janczura, J., Weron, A. Ergodicity testing for anomalous diffusion: small sample statistics. The Journal of Chemical Physics. 142 (14), 144103(2015).
  24. Kim, D. H., et al. Single particle tracking-based reaction progress kinetic analysis reveals a series of molecular mechanisms of cetuximab-induced EGFR processes in a single living cell. Chemical Science. 8 (7), 4823-4832 (2017).
  25. Kurzthaler, C., et al. Probing the Spatiotemporal Dynamics of Catalytic Janus Particles with Single-Particle Tracking and Differential Dynamic Microscopy. Physical Review Letters. 121 (7), 078001(2018).
  26. Lin, X., Pan, Q., He, Y. In situ detection of protein corona on single particle by rotational diffusivity. Nanoscale. 11 (39), 18367-18374 (2019).
  27. Wei, L., et al. Sub-diffraction-limit localization imaging of a plasmonic nanoparticle pair with wavelength-resolved dark-field microscopy. Nanoscale. 9 (25), 8747-8755 (2017).
  28. Cheng, X., Dai, D., Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Subdiffraction-limited plasmonic imaging with anisotropic metal nanoparticles. Analytical Chemistry. 86 (5), 2303-2307 (2014).
  29. Belyy, V., et al. PhotoGate microscopy to track single molecules in crowded environments. Nature Communication. 8, 13978(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Gold NanorodsCell MembraneSingle Particle TrackingDarkfield MicroscopyImageJ AnalysisMATLAB AnalysisMean Square DisplacementBrownian MotionLong Range TransportConfined Diffusion

Related Articles