Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een neonatale beeldvorming model van gram-negatieve bacteriële sepsis

5.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61609

⸱

12 augustus 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, & Cell Biology, West Virginia University School of Medicine, 2Vaccine Development Center at West Virginia University Health Sciences Center

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Infectie van neonatale muizen met bioluminescente E. coli O1:K1:H7 resulteert in een septische infectie met significante longontsteking en longpathologie. Hier beschrijven we procedures om neonatale sepsis te modelleren en verder te bestuderen met behulp van longitudinale intravitale beeldvorming parallel met de opsomsoming van systemische bacteriële lasten, ontstekingsprofilering en longsentopathologie.

Samenvatting

Neonaten hebben een verhoogd risico op bacteriële sepsis als gevolg van het unieke immuunsysteem profiel dat ze vertonen in de eerste maanden van het leven. We hebben een protocol opgesteld voor het bestuderen van de pathogenese van E. coli O1:K1:H7, een serotype dat verantwoordelijk is voor hoge sterftecijfers bij pasgeborenen. Onze methode maakt gebruik van intravital beeldvorming van neonatale pups op verschillende tijdstippen tijdens de progressie van infectie. Deze beeldvorming, parallel met het meten van bacteriën in het bloed, ontstekingsprofilering en weefsel histopathologie, betekent een rigoureuze benadering van het begrijpen van infectiedynamica tijdens sepsis. In het huidige rapport modelleren we twee infectieuze entculums voor de vergelijking van bacteriële lasten en de ernst van de ziekte. We vinden dat subscapulaire infectie leidt tot verspreide infectie door 10 uur na infectie. Tegen 24 uur, infectie van luminescente E. coli was overvloedig in het bloed, longen, en andere perifere weefsels. Expressie van inflammatoire cytokinen in de longen is significant bij 24 uur, en dit wordt gevolgd door cellulaire infiltratie en bewijs van weefselschade die toeneemt met infectieuze dosis. Intravital imaging heeft wel een aantal beperkingen. Dit omvat een lichtgevende signaaldrempel en enkele complicaties die kunnen ontstaan bij neonaten tijdens anesthesie. Ondanks enkele beperkingen, vinden we dat onze infectie model biedt een inzicht voor het begrijpen van longitudinale infectie dynamiek tijdens neonatale murine sepsis, die niet grondig is onderzocht tot op heden. We verwachten dat dit model ook kan worden aangepast aan andere kritische bacteriële infecties te bestuderen tijdens het vroege leven.

Inleiding

Bacteriële sepsis is een belangrijke zorg voor neonaten die een uniek immuunprofiel vertonen in de eerste dagen van het leven dat geen adequate bescherming biedt tegen infectie1. Neonatale sepsis blijft een belangrijke Amerikaanse gezondheidszorg probleem goed voor meer dan 75.000 gevallen per jaar in de VS alleenal 2. Om deze infecties grondig te bestuderen, zijn nieuwe diermodellen nodig die aspecten van de menselijke ziekte samenvatten. We hebben een neonatale muis infectie model met behulp van Escherichia coli, O1:K1:H73. E. coli is de tweede belangrijkste oorzaak van neonatale sepsis in de VS, maar verantwoordelijk voor de meerderheid van de sepsis-geassocieerde mortaliteit4,5. Echter, het is de belangrijkste oorzaak wanneer pre-term en zeer laag geboortegewicht (VLBW) baby's worden beschouwd als onafhankelijk5. Het K1-serotype wordt het vaakst geassocieerd met invasieve bloedbaaninfecties en meningitis bij neonaten6,7. Momenteel zijn er geen andere behandelingsopties dan antibiotica en ondersteunende zorg. Ondertussen blijven de tarieven van antibioticaresistentie stijgen voor veel pathogene bacteriën, met sommige stammen van E. coli resistent tegen een veelheid van antibiotica vaak gebruikt in behandeling8. Het is dus absoluut noodzakelijk dat we methoden blijven genereren om de mechanismen van sepsis en de gastheerrespons in neonaten te bestuderen. Deze resultaten kunnen helpen om te verbeteren op de huidige behandelingen en infectie resultaten.

De immuuntoestand van neonaten wordt gekenmerkt door zowel fenotypische als functionele verschillen in vergelijking met volwassenen. Zo is aangetoond dat verhoogde niveaus van ontstekingsremmende en regulerende cytokinen, zoals interleukine (IL)-10 en IL-27, worden geproduceerd door door navelstrengbloed afgeleide macrofagen en zijn zij op grotere niveaus aanwezig in het serum van murine neonaten9,10,11. Dit komt overeen met lagere niveaus van IFN-α, IFN-ɣ, IL-12 en TNF-α die vaak worden gerapporteerd vanuit neonatale cellen in vergelijking met volwassen tegenhangers10. Bovendien is het neonatale immuunsysteem scheef in de richting van een Th2 en regelgevende T-celrespons in vergelijking met volwassenen12. Verhoogde aantallen neutrofielen, T-cellen, B-cellen, NK-cellen en monocyten zijn ook aanwezig in neonaten, maar met aanzienlijke functionele beperkingen. Dit omvat defecten in expressie van celoppervlakmarkeringen en antigeenpresentatie die onrijpheid13,14,15suggereren . Bovendien, neonatale neutrofielen zijn aanzienlijk tekort in hun vermogen om te migreren naar chemotactische factoren16. Myeloïde-afgeleide suppressor cellen (MDSCs) zijn ook gevonden op verhoogde niveaus in neonaten en onlangs aangetoond dat een bron van IL-2711. MDC's zijn zeer onderdrukkend in de richting van T-cellen17. Gezamenlijk tonen deze gegevens beperkingen aan in neonatale immuniteit die de gevoeligheid voor infectie verhogen.

Om de progressie van de bacteriële last te bestuderen en beschermende gastheer immuunreacties te ontleden tijdens neonatale sepsis, hebben we een nieuw infectiemodel ontwikkeld. Neonatale muizen op dagen 3-4 van het leven zijn moeilijk te injecteren in de intraperitoneale ruimte of staartader. In ons model worden dag 3 of 4 pups het bacteriële entmateriaal of PBS onderhuids toegediend in het scapulaire gebied. Een systemische infectie ontwikkelt zich en met behulp van luminescente E. coli O1:K1:H7, kunnen we langswaarts beeld individuele neonatale muizen om de verspreide bacteriële last in perifere weefsels te volgen. Dit is het eerste gerapporteerde model dat intravital beeldvorming gebruikt om de kinetiek van verspreiding van bacteriën tijdens sepsis bij murine neonaten te begrijpen3.

Hier beschrijven we een protocol om septische E. coli-infecties bij neonatale muizen3te induceren. We beschrijven hoe het bacteriële entmateriaal voor injectie moet worden voorbereid en hoe weefsel kan worden geoogst voor de beoordeling van pathologie, het meten van ontstekingsmarkers door genexpressieanalyse en opsomring van de bacteriële last. Daarnaast wordt ook het gebruik van luminescente E. coli voor intravitale beeldvorming van geïnfecteerde neonaten en kwantificering van bacteriële doden door neonatale immuuncellen beschreven. Deze protocollen kunnen ook worden aangepast om andere belangrijke bacteriële infecties in neonaten te bestuderen. De hier gepresenteerde gegevens vertegenwoordigen een algemene nieuwe benadering van het begrijpen van infectiedynamiek in een vertaalbaar neonatale sepsismodel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures werden goedgekeurd door de West Virginia Institutional Animal Care and Use Committees en uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen van de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals door de National Research Council18.

1. Bereiding van bacteriële inoculum

  1. Streep een tryptische soja agar (TSA) plaat met een inenting lus voor isolatie van een enkele kolonie uit een vriezer voorraad van E. coli O1:K1:H7-lux die stabiel uitdrukt luciferase en draagt kanamycine weerstand3. Incubeer 's nachts bij 37 °C.
  2. De volgende dag kan Luria bouillon (LB) op kamertemperatuur (25 °C) komen in een bioveiligheidskast.
  3. Identificeer onder een kap van een bioveiligheidskabinet een enkele kolonie van de gestreepte plaat en inent het in 3 mL LB aangevuld met kanamycine (30 μg/mL). Incubeer 's nachts bij 37 °C met schudden (220 rpm). Dit is de starterscultuur.
  4. Verdun de startercultuur 1:100 tot een verse 3 mL LB onder een bioveiligheidskauch en breng deze terug naar de couveuse voor 2-3 uur bij 37 °C met schudden (220 rpm). Dit is de aandelencultuur.
  5. Lees de optische dichtheid (OD) van zowel de blanco- als de voorraadcultuur op 600 nm met behulp van een spectrofotometer. Voeg 100 μL LB (zonder bacteriën) toe in een put van een 96 goed platte bodemtestplaat; Dit is de blanco. Voeg vervolgens 100 μL van de voorraadcultuur toe aan een aparte put. Herhaal dit voor twee extra replicaties. De absorptie wordt gelezen met behulp van een plaatlezer.
  6. Trek de blanco absorptie van de absorberende waarde van de voorraadcultuur (de OD-waarde) af en vergelijk deze met een eerder gegenereerde en gevalideerde groeicurve om een benadering van de bacteriële dichtheid in de voorraadcultuur voor de bereiding van infectieuze dosis te bepalen.
  7. Het genereren van doelentarmen, afhankelijk van de onderzoeksvraag. Voor deze studie werden doelenoculum van 2 x10 6 (laag) en 7 x10 6 (hoge) kolonievormende eenheden (CFUs) per muis (/muis) gebruikt.
    1. Verdeel de doeldosis per muis (dosisT)door de geschatte concentratie van bacteriën in de voorraadcultuur (Stock) om het benodigde volume bacteriën uit de stockbuis (VS)te krijgen.
    2. Vermenigvuldig V S met het aantal muizen (NM)die moeten worden besmet, samen met genoeg voor 5-10extra's voor de totale hoeveelheid bacteriën die nodig zijn voor de infectie plus 5-10 extra doses. Haal dit volume uit de voorraadbuis en voeg het toe aan een nieuwe centrifugebuis.
    3. Gebruik de onderstaande vergelijking:
      DosisT/Stock = VS x NM = totaal volume (VT)van bacteriën die uit de voorraadbuis moeten worden verwijderd.
  1. Centrifugeren de bacteriën op 2.000 x g gedurende 5 min bij 4 °C en resuspend de bacteriële pellet in 50 μL PBS (pH 7.2-7.6) per te besmette muis (bijv. voor 10 doses van 2 x 106 bacteriën per dosis zou de pellet van 2 x 107 bacteriën opnieuw worden opgetrokken in 500 μL PBS). Nogmaals, het wordt aanbevolen om meer entmateriaal voor te bereiden dan nodig is. Bereid een gelijk volume pbs alleen voor de controle inentingen. Behoud de infectieuze entmateriaal en PBS controle op ijs tot infectie.
  2. Voer zeven tienvoudige seriële verdunningen uit in PBS in een 96 goed plastic bodemverdunningsplaat en plaat 25 μL van de verdunningen in tweevoud op kwadrant TSA-platen aangevuld met kanamycine (30 μg/mL) om de werkelijke hoeveelheid toegediende bacteriën op te sommen. Incubeer bij 37 °C 's nachts voor kolonievorming voorafgaand aan de opsomring.

2. Identificatie van dieren

  1. Schik een voldoende aantal broedparen zodanig dat nesten kunnen worden gesynchroniseerd voor leeftijdsgegelijke pups. Leeftijdsvariabiliteit van ± 1 dag is aanvaardbaar.
  2. Identificeer een zwangere C57BL/6 vrouwelijke muis en controleer voor de geboorte van het nest voorafgaand aan het geplande experiment om de leeftijd nauwkeurig te bepalen.
  3. Om onderscheid te maken tussen controle en geïnfecteerde 3- of 4-daagse oude pups, gebruik dan een paar kleine, fijngepuntige irisschaar om de uiteinden van de staarten van de controlepups alleen te knippen. De besmette pups krijgen geen staartsnips. Ontsmet de huid voor het snijden van de staart met een katoenen bal die voor 70% ethanol wordt overgoten. Druk uitoefenen op het einde van de staart met een katoenen bal of gaas als dat nodig is.
    LET OP: Deze procedure wordt uitgevoerd onder een bioveiligheidskabinetkap. Een staartsnip van ongeveer 1/8 van een inch is voldoende.
  4. Om pups binnen de controle- en geïnfecteerde groepen te identificeren, gebruikt u een 1 mL insulinespuit met een permanente naald van 28 G x 1/2 om de staarten van de pups te tatoeëren. Ontsmet de huid voor het tatoeëren met een katoenen bal die voor 70% ethanol wordt overgoten. Deze procedure wordt uitgevoerd onder een bioveiligheidskabinetkap.
  5. Om de staart te tatoeëren, breng dier tattoo inkt op het puntje van de naald. Vervolgens, zorgvuldig beperken de pup met een hand, met hun staart volledig blootgesteld. Steek de naald voorzichtig onder de huid, met behoud van een oppervlakkig niveau van diepte, en beweeg de naald parallel met de huid een paar millimeter tot een kleine markering, of stip, is gemaakt. Wacht een paar seconden voordat langzaam verwijderen van de naald onder de huid, om te voorkomen dat overtollige inkt vrijkomen van onder de huid.
  6. Druk uitoefenen op de wond met een katoenen bal of gaas als dat nodig is. Verwijder overtollige tatoeage inkt op het oppervlak van de huid met 70% ethanol.
  7. Herhaal dit proces met latere muizen in de geïnfecteerde en controlegroepen, terwijl het toevoegen van een extra stip met elke opeenvolgende pup getatoeëerd (bijvoorbeeld, pup 1 zal hebben 1 punt op hun staart, pup 2 zal twee stippen op hun staart, enz.).
    OPMERKING: Voor een extra laag van identificatie, is het raadzaam om aparte kleuren van dierlijke tattoo inkt te gebruiken voor de controle en geïnfecteerde groepen.

3. Subscapulaire inenting

OPMERKING: Voor deze studie werden 2 experimenten uitgevoerd met een lage dosis en een groep met hoge dosis die voor elk experiment is aangewezen. In het eerste experiment kregen 7 pups het lage dosis-entmateriaal (4 pups werden gebruikt als controle), en 5 pups uit een apart nest kregen de hoge dosis (3 pups werden gebruikt als controles). De pups van experiment 1 leverden gegevens voor alleen het 24 uur tijdpunt. In het tweede experiment kregen 8 pups het lage dosis-entmateriaal (2 pups werden gebruikt als controles), en 6 pups kregen het hoge dosis-entmateriaal (2 pups werden gebruikt als controles). Pups uit experiment 2 leverden gegevens voor de 0, 10 en 24 uur tijdpunten.

  1. Leeftijd match pups ≤ 1 dag. Wijs elk nest toe als een lage dosis of een strooisel met een hoge dosis. Binnen een nest willekeurig pups toewijzen als een controle of geïnfecteerde pup.
  2. Op dag 3 of 4 postnatale, record gewichten van alle pups voorafgaand aan inenting met E. coli-lux of de PBS controle. Scheid de dam van de pups gedurende deze tijd om ervoor te zorgen dat ze niet worden verplaatst tijdens de infectie.
  3. Binnen een bioveiligheidskast met behulp van een insulinenaald, aspirate ofwel PBS of de E. coli-lux entmateriaal. Voor dit werk werden inoculums van 2 x 106 en 7 x 106 CFUs per muis gebruikt. Houd zowel infectieuze enentmateriaal als PBS op ijs tot toediening via subscapulaire injectie.
  4. Plaats het neonaat op een schoon oppervlak in de bioveiligheidskauch en verhoog de huid bij de nek als of de pup te sjofelen.
  5. In de ruimte die nu tussen de huid en de spier van het dier wordt gecreëerd, steek de naald in, schuin, net onder de huid en injecteer 50 μL PBS of E. coli-lux. Laat tegelijkertijd het beknelde gedeelte van de huid los om terugstroom van injectie te voorkomen.
  6. Verwijder de naald langzaam en met zorg. Plaats pups terug met dammen na injecties zijn afgewerkt.
    OPMERKING: Vanwege hun anatomische fase in ontwikkeling is het technisch een uitdaging om een staartader of intraperitoneale injectie toe te dienen aan neonatale pups op dag 3-4. Zo werd de subscapulaire infectie route gekozen voor deze studie vanwege het gemak van uitvoering.

4. Evaluatie van ziekte- en eindpuntcriteria

  1. Controleer de pups twee keer per dag gedurende de duur van de infectie. Let op eventuele afwijkingen in het uiterlijk.
  2. Leg gewichten vast als een objectieve meting van morbiditeit.
  3. Test naast gewichtsveranderingen het vermogen van de pups om zichzelf recht te zetten door het neonaat aan de rugzijde te plaatsen. Zieke dieren zullen niet in staat zijn om te draaien naar de ventrale kant en op de voeten of zal deze actie te voltooien met moeite.
  4. Controleer of de dieren dicht bij de eindpuntencriteria liggen: minder dan 85% van het normale lichaamsgewicht; verminderde beweging en onvermogen om zichzelf recht te zetten; verkleuring van de huid en een meer grijze of transparante uitstraling in tegenstelling tot roze; gevoel koel aan de aanraking, indicatief voor verminderde lichaamstemperatuur en hemorragische blauwe plekken langs de zijkanten, ook indicatief voor vooraf ziekte.
    OPMERKING: Als de neonaten er niet in geslaagd zijn om gewicht te winnen gedurende twee dagen en passen in een van de beschrijvingen in stap 4.4, hebben ze voldaan aan eindpuntcriteria. Pups die de hoge dosis krijgen, voldoen vaak 24 uur per 24 uur aan eindpuntcriteria. Controlepups binnen de lage en hoge dosis nesten zullen tegelijkertijd worden geëuthanaseerd om een vergelijkende analyse tussen de controle en experimentele groepen mogelijk te maken. Ga verder met de euthanasie sectie hieronder.

5. In vivo beeldvorming van bacteriële lasten

  1. Gebruik een microCT imager en software voor beeldvorming en latere analyse.
    OPMERKING: De huidskleur van de pup heeft geen invloed op de beeldkwaliteit.
  2. Plaats de kooi met E. coli-lux-geïnfecteerde neonatale muizen en dam in een BSL-2 niveau laminaire flow hood. Verwijder muizen om te worden afgebeeld, en plaats in een transparante isoflurane kamer in de kap. Het wordt aanbevolen om te beginnen met niet-geïnfecteerde controles om de hoeveelheid isoflurane te meten die nodig is.
  3. Open de software op de computer die aan de microCT is gekoppeld. Initialiseer het systeem en wacht tot de CCD-temperatuur op -90 °C is vergrendeld.
  4. Zet de isoflurane vaporizer aan en stel de wijzerplaat in op 5% isoflurane flow. Houd muizen in de kamer met dit isoflurane mengsel voor 20-30 s totdat ze stoppen met bewegen; langere of kortere anesthesie blootstelling tijden nodig kunnen zijn voor sommige muizen. Zodra muizen stoppen met bewegen, zijn ze voldoende verdoofd en kunnen ze worden afgebeeld.
  5. Verplaats muizen in de microCT imaging kamer en plaats ze op de imaging box in de gevoelige positie, met neuzen geconfronteerd loodrecht op neuskegels. Gebruik tandwas om voorzichtig beperken van de voeten op de imaging box om elke beweging te beperken. Er kunnen maximaal 4 neonatale muizen tegelijk worden afgebeeld.
  6. Zet de isoflurane vaporizer tot 2-4% stroom om muizen verdoofd te houden tijdens beeldvorming. Sluit de deur van de microCT-beeldkamer. Controleer de muizen een paar seconden later. Als ze beginnen te bewegen, douse een katoenen bal in isoflurane en houd het aan de neus van het dier bewegen voor 5 seconden te verdoven. Houd de katoenen bal in de buurt van de dieren tijdens de beeldvorming. Wees voorzichtig niet te verdoven en eindigen de muizen.
  7. Kies met behulp van de software de luminescent-optie voor beeldvorming. Gebruik een excitatiefilter ingesteld op Blokkeren en het emissiefilter ingesteld op Openen, 500 nm, 520 nm, 560 nm, 580 nm, 600 nm en 620 nm. Er zullen zeven totale emissiefilters zijn ingesteld voor luminescentie.
  8. Beeld de muizen op elk moment punt (0, 10 en 24 uur na infectie [hpi]) en sla alle afbeeldingen op een map voor elk keer punt. Breng de pups terug naar de kooi met de dam en controleer of alle pups zijn hersteld van anesthesie.
  9. Als u 2D-afbeeldingen wilt analyseren, opent u afbeeldingen in de software. Wissel eenheden naar Radiance (fotonen); dit zal veranderen in de Total Flux (fotonen/seconde).
  10. Analyseer slechts één afbeeldingsset met meerdere emissiefilters tegelijk. Neem bij elke afbeeldingsset nota van de minimale en maximale stralingswaarden die zich in de rechterbenedenhoek van elke afbeelding bevinden (bijvoorbeeld als er 7 emissiefilters zijn, zullen er 7 afbeeldingen en 7 minimum- en maximumwaarden zijn). Herhaal dit voor elke afbeeldingsset die moet worden vergeleken.
  11. Als u een schaal wilt bepalen die de waarden en luminescentie voor alle afbeeldingen omvat, zoekt u de laagste minimumwaarde en de hoogste maximumwaarde voor elke afbeeldingsset. Voor deze studie werden de open filterafbeeldingen gebruikt als representatief.
    1. Markeer en open de afbeelding van keuze om de schaal te wijzigen. Klik op het gereedschapspaletop het tabblad Afbeelding aanpassen en wijzig de kleurschaal in de laagste minimum- en hoogste maximumwaarden die eerder zijn geïdentificeerd. Sla elke afbeeldingsset op als een TIFF. Analyseer elk keer afzonderlijk op deze manier om ervoor te zorgen dat de juiste schaal wordt weergegeven.
  12. Open een afbeelding zoals eerder beschreven in stap 5.9-5.10 om de totale flux (hoeveelheid lichtsignaal per muis) te kwantificeren. Open het tabblad HULPMIDDELEN voor ROI op het gereedschappalet en selecteer het gereedschap Cirkel. Kies 1 cirkel als u één gebied van luminescentie analyseert.
  13. Verplaats ROI naar Overlay op het gebied van luminescentie. Pas indien nodig de grootte van de ROI aan.
    OPMERKING: Als aanpassing nodig is, past u DE ROI's in andere afbeeldingen vergelijkbaar aan om de consistentie te behouden. Kies ROI's meten. Het venster ROI-metingen wordt geopend met Totale Flux (p/s), Gemiddelde uitstraling (p/s/cm2/sr), standaarddeviatie van uitstraling, minimale uitstraling en maximale uitstraling.
  14. Record totale flux metingen voor elke afbeelding set. Dit getal is de gekwantificeerde hoeveelheid luminescentie in de muis in 2D-beelden.
  15. Als u 3D gereconstrueerde microCT-afbeeldingen wilt maken, opent u het deelvenster DLIT 3D-reconstructie op het gereedschapspalet en controleert u alle golflengten die moeten worden opgenomen onder het tabblad Analyseren. Selecteer Reconstrueren.

6. Euthanasie

  1. Bereid en etiketteert buizen voor weefsels/organen van belang voor obductie en passende downstream toepassingen.
  2. Scheid de neonaten van de dam in een bioveiligheidskast.
  3. Week een katoenen bal in veterinaire kwaliteit isoflurane en plaats binnenkant van een transparante insluiting kamer.
  4. Als u bloed verzamelt, bereidt u een P200-micropipet met een punt en heeft u een buis van 1,5 mL met 10 μL van 5 mM EDTA als antistollingsmiddel. Er wordt een volume van 50-200 μL bloed verwacht.
  5. Plaats een neonaat in de kamer en controleer de pup totdat deze bewegingloos wordt.
  6. Verwijder snel neonaat en onthoofd met een schaar. Indien toegestaan om frisse lucht in te ademen voor een langere periode, kan de pup weer bij bewustzijn. Neonaten hebben een verminderde longcapaciteit ten opzichte van volwassen muizen, en ademen daarom niet diep genoeg voor euthanasie door isoflurane alleen.
  7. Verzamel bloed uit de stam aan de basis van het hoofd met behulp van een P200 micropipet. Om de hoeveelheid bloed te maximaliseren die wordt verzameld, voert u deze stap zo snel mogelijk uit na onthoofding. Sommen bacteriën in het bloed door seriële verdunning en standaard plaat tellen zoals beschreven in stap 1.9.
  8. Steriliseren het gehele neonaat met 70% ethanol voorafgaand aan excisie van weefselmonsters.

7. Weefseloogst

  1. In een bioveiligheidskast doven we het neonaat met 70% ethanol om besmetting te voorkomen. Leg het dier aan de rechterkant.
  2. Met behulp van tangen, pak de huid op een punt tussen de buik en het achterste linkerbeen en maak een incisie met fijngetipte chirurgische schaar. Blijf de huid wegsnijden en naar boven naar de achterkant. Vooruitgang totdat de hele milt is blootgesteld.
  3. Gebruik de tangen om de milt te grijpen en te verwijderen uit de buik, met behulp van een schaar om het bindweefsel los te koppelen. Plaats de milt in de oplossing die geschikt is voor de downstream-toepassing.
  4. Om de longen te verkrijgen, schil de huid van de borst volledig terug.
  5. Het invoeren aan de basis van het borstbeen met een schaar verticaal gehouden, naar boven gesneden totdat de ribbenkast is gesplitst.
  6. Gebruik tangen om de rechter- en linkerlongen individueel te grijpen en ze uit de borstholte te verwijderen. Verwijder het hart uit het longweefsel door te snijden met een schaar.
  7. Plaats de long in de oplossing die geschikt is voor de downstream-toepassing. Gebruik voor RNA-isolatie 500 μL guanidine thiocyanaat/fenol (GTCP). Gebruik voor histopathologie 5 mL van 10% neutraal gebufferd formaline.

8. RNA isolatie van longweefsel voor genexpressie

  1. Koel de microcentrifuge voor tot 4 °C.
  2. Hak het longweefsel in GTCP met een schaar. Vervolgens homogeniseren het weefsel met een batterij-aangedreven homogenisator. Ga door tot de oplossing zo uniform mogelijk is. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3-5 min.
  3. Voeg met gefilterde pipettips 100 μL chloroform toe. Keer de buis voor 15 s en incubeer 3-5 min bij kamertemperatuur.
  4. Centrifuge gedurende 15 minuten op 12.000 x g.
  5. Bereid tijdens de spin 1,5 mL buizen met 500 μL ethanol. Monteer en label de kolommen en verzamelbuizen uit de RNA isolatiekit.
  6. Verwijder voorzichtig de bovenste, waterige laag zonder de interfaselaag te verstoren die tijdens centrifugatie is gevormd. Plaats de waterige laag in de buizen met 70% ethanol.
  7. Verplaats de ethanol en lysaat mengsel naar de kolom in de opvangbuis.
  8. Vanaf dit punt, volg de RNA isolatie kit commerciële product protocol tot de uiteindelijke elutie van RNA.
  9. Analyseer het RNA op zuiverheid en kwantiteit. Gebruik onmiddellijk of bewaar op -80 °C tot verder gebruik.

9. cDNA-synthese

  1. Label PCR buizen en zet apart.
  2. Voeg voor elk monster 1 μg RNA toe aan het cDNA-reactiemengsel.
  3. Voeg de reagentia en sjabloon toe aan de PCR-buis zoals beschreven in het cDNA-protocol. Voeg het enzym als laatste toe aan het mengsel.
  4. Plaats PCR-buizen in een thermocycler met de volgende run-instellingen: 5 min bij 25 °C, 40 min bij 42 °C, 15 min bij 85 °C en 4 °C laatste wachtruimte.
  5. Verwijder PCR-buizen uit de thermocycler en gebruik onmiddellijk of bewaar bij -20 °C tot verder gebruik.

10. Real-time kwantitatieve PCR (qPCR) cyclus

  1. Bereid een reactiemixcocktail voor elk van de te analyseren genen. Elke 15 μL PCR-reactie vereist 7,5 μL 2x reagensmix, 0,75 μL 20x 5'-FAM-gelabeld gen-specifieke primer/sonde, en 3,75 μL nuclease-vrij water. Amplicons variëren meestal van 60-120 bp.
  2. Voeg 3 μL cDNA-sjabloon voor elke experimentele groep toe aan de juiste putten.
  3. Voeg 12 μL van de genspecifieke reactiemixcocktail toe aan de juiste putten.
  4. Bedek de plaat met optische kleeffolie en centrifuge gedurende 1 min op 1.000 x g om eventuele bellen die zich in de putten hebben gevormd te verwijderen.
  5. Plaats de PCR-plaat in een real-time PCR-thermocycler.
  6. Stel de runmethode als volgt in: 3 min op 95 °C, 40 cycli van 95 °C voor 15 s gevolgd door 60 °C gedurende 1 min.
  7. Analyseer gegevens door het gen van belang te normaliseren naar een interne controle en uit te drukken gegevens van geïnfecteerde monsters met betrekking tot niet-geïnfecteerde controle monsters met behulp van de 2-ΔΔCt formule en een log2 transformatie van de nummers.

11. Long histopathologie

  1. Verwijder de longen van de neonatale pup zoals hierboven beschreven.
  2. Plaats het weefsel in een volume van 10% neutraal gebufferde formaline, zodat de verhouding van de oplossing tot weefsel is ongeveer 20:1 voor 3-7 dagen.
  3. Coördineer met een geschikte histologiedienst voor paraffineinbedding, sectioning en hematoxylin en eosine (H&E) kleuring. Voor dit werk werd de West Virginia University Histopathology Core gebruikt. U ook eerder beschreven protocollen19volgen.

12. In vitro bacteriële doden test

  1. Verwijder de milt van de niet-geïnfecteerde neonatale pup zoals hierboven beschreven en plaats deze in een nylon mand van 40 μm in een steriele petrischaal van 60 mm. Herhaal dit en zwembad milt in een buis te worden geoogst en gehomogeniseerd samen.
  2. Voeg 5 mL PBS toe aangevuld met 10% FBS.
  3. Desagggregateren van het weefsel met behulp van een steriele 3 mL spuit zuiger totdat een enkele cel suspensie is gemaakt.
  4. Verzamel de eencellige suspensie buiten de nylon mand, breng over op een 15 mL centrifugebuis en pelletcellen op 350 x g gedurende 5 minuten.
  5. Hang de cellen op in de rode bloedcelbuffer (2 mL voor maximaal 7-8 milt) en laat deze 5 minuten staan bij kamertemperatuur om erytrocyten te elimineren.
  6. Was splenocyten met PBS en pellet zoals hierboven.
  7. Schort de splenocyten op in 0,25 mL PBS aangevuld met 0,5% BSA en 2 mM EDTA volgens de verwachte celopbrengst.
  8. Tel de splenocyten met behulp van een hemocytometer of een andere geschikte toepassing.
  9. Isoleer Ly6B.2+ (myeloïde populatie granulocyten/inflammatoire monocyten) cellen met immunomagnetische kralen volgens het fabrikantprotocol.
  10. Seed Ly6B.2+ cellen bij een dichtheid van 1 x 105 cellen per put in een zwarte of witte 96-put plaat in een volume van 0,1 mL DMEM dat 10% FBS, 2 mM glutamine en 25 mM HEPES (compleet medium) bevat.
  11. Sommen bioluminescente E. coli op zoals beschreven in sectie 1 en bereid het bacteriële entmateriaal voor op de gewenste veelheid van infectie (MOI) in een eindvolume van 0,1 mL. Dit kan het beste worden gedaan door het maken van wat nodig is voor alle putten op een gemeenschappelijke MOI in batch.
  12. Voeg 0,1 mL bacteriële entmateriaal of compleet medium alleen als een controle. Broed de meerputplaat uit op 37 °C en 5% CO2 gedurende 1 uur.
  13. Vervang de media door 0,2 mL verse complete media die gentamicine (100 μg/mL) bevat door de media voorzichtig te verwijderen door een pipet en verse media toe te voegen met een nieuwe pipettip. Breng de cultuur terug naar incubatie voor nog eens 2 uur.
  14. Meet bij 3 uur na infectie de luminescentie in elke put van de dekselcultuurplaat van de bodem met behulp van een plaatlezer en breng de cultuur vervolgens terug naar incubatie.
  15. Herhaal metingen van luminescentie op andere gewenste tijdstippen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dit protocol veroorzaakte bacteriële sepsis bij neonatale muizen, en we gebruikten longitudinale intravitale beeldvorming, opsoming van bacteriën in het bloed, histologische beoordelingen van pathologie en inflammatoire cytokine-expressieprofielen om het verloop van de ziekte te bestuderen. Tekenen van morbiditeit werden waargenomen bij neonatale pups besmet met zowel lage (~ 2 x 106 CFUs) en hoge (~ 7 x 106 CFUs) inoculums van E.coli na verloop van tijd. Pups die het grotere entmateriaal k...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Ons subscapulaire infectiemodel voor het induceren van bacteriële sepsis bij neonatale muizen is een nieuwe methode om de longitudinale verspreiding van bacteriële pathogenen in realtime te bestuderen. Intravital imaging biedt de mogelijkheid om bacteriële verspreiding in real time te verkennen in neonaten. Dit is van cruciaal belang om de kinetiek van bacteriële verspreiding te begrijpen en de respons en schade van de gastheer in de juiste fase van de ziekte verder te bestuderen. Muispups krijgen een onderhuidse, subcap...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door institutionele fondsen aan C.M.R.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 mL Insulin SyringeCoviden1188128012Inoculum of PBS-injectie
10% Neutral Buffered FormalinVWR89370-094Histopathologie
ACK Lysis BufferGibcoLSA1049201Bacterieclearance assay
Animal Tattoo Ink PasteKetchumKI1482039Dieridentificatie
Animal Tattoo Ink Green PasteKetchumKI1471039Dieridentificatie
Anti-Ly-6B.2 MicrobeadsMiltenyi Biotec130-100-781Celisolatie
Escherichia coli O1:K1:H7ATCC11775
Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expresses luciferase)N/AN/AGeconstrueerd in-house bij WVU
E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA KitOmega Bio-tekR6812RNA extractie
DPBS, 1XCorning21-031-CV
Difco Tryptic Soy AgarBecton, Dickinson and Company236950Bacteriegroei
IL-1 beta Primer/Probe (Mm00434228)Thermo Fisher Scientific4331182Cytokine expressie qPCR
IL-6 Primer/Probe (Mm00446190)Thermo Fisher Scientific4331182Cytokine expressie qPCR
iQ SupermixBio-Rad1708860Real-time kwantitatieve PCR
iScript cDNA Synthesis KitBio-Rad1708891cDNA synthese
Isolation BufferMiltenyi BiotecN/ABacterieclearance assay
IVIS Spectrum CT and Living Image 4.5 SoftwarePerkin ElmerN/AIntravitale beeldvorming
LB Broth, LennoxFisher BioReagentsBP1427-500Bacteriegroei
EASYstrainer (Nylon Basket)Greiner Bio-one542 040Celstrainer
SpectraMax iD3Molecular DevicesN/APlatelezer
Pellet Pestle MotorGrainger6HAZ6Weefselhomogenisatie
Polypropylene Pellet PestlesGrainger6HAY5Weefselhomogenisatie
Prime Thermal CyclerTechne3PRIMEBASE/02cDNA synthese
TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258)Thermo Fisher Scientific4331182Cytokine expressie qPCR
TriReagent (GTCP)Molecular Research CenterTR 118RNA extractie

Referenties

  1. Qazi, S. A., Stoll, B. J. Neonatal sepsis: a major global public health challenge. Pediatr Infect Dis J. 28, 1-2 (2009).
  2. Simonsen, K. A., Anderson-Berry, A. L., Delair, S. F., Davies, H. D. Early-onset neonatal sepsis. Clinical Microbiology Reviews. 27 (1), 21-47 (2014).
  3. Seman, B. G., et al. Elevated levels of interleukin-27 in early life compromise protective immunity in a mouse model of Gram-negative neonatal sepsis. Infections and Immunity. , (2019).
  4. Schrag, S. J., et al. Epidemiology of Invasive Early-Onset Neonatal Sepsis, 2005 to 2014. Pediatrics. 138 (6), 20162013(2016).
  5. Stoll, B. J., et al. Early onset neonatal sepsis: the burden of group B Streptococcal and E. coli disease continues. Pediatrics. 127 (5), 817-826 (2011).
  6. Weston, E. J., et al. The burden of invasive early-onset neonatal sepsis in the United States, 2005-2008. Pediatrics and Infectious Disease Journal. 30 (11), 937-941 (2011).
  7. Hornik, C. P., et al. Early and late onset sepsis in very-low-birth-weight infants from a large group of neonatal intensive care units. Early Human Development. , Suppl 2 69(2012).
  8. Vergnano, S., Sharland, M., Kazembe, P., Mwansambo, C., Heath, P. T. Neonatal sepsis: an international perspective. Archives of Disease in Childhood: Fetal and Neonatal Edition. 90 (3), 220-224 (2005).
  9. Kraft, J. D., et al. Neonatal macrophages express elevated levels of interleukin-27 that oppose immune responses. Immunology. 139 (4), 484-493 (2013).
  10. Basha, S., Surendran, N., Pichichero, M. Immune responses in neonates. Expert Reviews of Clinical Immunology. 10 (9), 1171-1184 (2014).
  11. Gleave Parson, M., et al. Murine myeloid-derived suppressor cells are a source of elevated levels of interleukin-27 in early life and compromise control of bacterial infection. Immunology and Cell Biology. 97 (5), 445-446 (2018).
  12. Adkins, B., Leclerc, C., Marshall-Clarke, S. Neonatal adaptive immunity comes of age. Nature Reviews Immunology. 4 (7), 553-564 (2004).
  13. Kim, S. K., Keeney, S. E., Alpard, S. K., Schmalstieg, F. C. Comparison of L-selectin and CD11b on neutrophils of adults and neonates during the first month of life. Pediatrics Research. 53 (1), 132-136 (2003).
  14. Velilla, P. A., Rugeles, M. T., Chougnet, C. A. Defective antigen-presenting cell function in human neonates. Clinical Immunology. 121 (3), 251-259 (2006).
  15. Le Garff-Tavernier, M., et al. Human NK cells display major phenotypic and functional changes over the life span. Aging Cell. 9 (4), 527-535 (2010).
  16. Weinberger, B., et al. Mechanisms underlying reduced responsiveness of neonatal neutrophils to distinct chemoattractants. Journal of Leukocyte Biology. 70 (6), 969-976 (2001).
  17. Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nature Reviewss Immunology. 9 (3), 162-174 (2009).
  18. National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed. , National Academies Press. Washington, DC. (2011).
  19. Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. Journal of Visualized Experiments. (125), e55796(2017).
  20. Bayarmagnai, B., Perrin, L., Esmaeili Pourfarhangi, K., Gligorijevic, B. Intravital Imaging of Tumor Cell Motility in the Tumor Microenvironment Context. Methods in Molecular Biology. 1749, 175-193 (2018).
  21. Beerling, E., Ritsma, L., Vrisekoop, N., Derksen, P. W., van Rheenen, J. Intravital microscopy: new insights into metastasis of tumors. Journal of Cell Science. 124, Pt 3 299-310 (2011).
  22. Witcomb, L. A., Collins, J. W., McCarthy, A. J., Frankel, G., Taylor, P. W. Bioluminescent Imaging Reveals Novel Patterns of Colonization and Invasion in Systemic Escherichia coli K1 Experimental Infection in the Neonatal Rat. Infection and Immunity. 83 (12), 4528(2015).
  23. Singh, K., et al. Inter-alpha inhibitor protein administration improves survival from neonatal sepsis in mice. Pediatric Research. 68 (3), 242-247 (2010).
  24. Pluschke, G., Pelkonen, S. Host factors in the resistance of newborn mice to K1 Escherichia coli infection. Microb. Patho. , 93-102 (1988).
  25. Mancuso, G., et al. Role of interleukin 12 in experimental neonatal sepsis caused by group B streptococci. Infections and Immunity. 65 (9), 3731-3735 (1997).
  26. Thammavongsa, V., Rauch, S., Kim, H. K., Missiakas, D. M., Schneewind, O. Protein A-neutralizing monoclonal antibody protects neonatal mice against Staphylococcus aureus. Vaccine. 33 (4), 523-526 (2015).
  27. Andrade, E. B., et al. TLR2-induced IL-10 production impairs neutrophil recruitment to infected tissues during neonatal bacterial sepsis. Journal of Immunology. 191 (9), 4759-4768 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Model voor neonatale sepsisintravitale beeldvormingbacteriële verspreidingE. coli O1:K1:H7tracking van luminescente bacteriënmicro-CT-beeldvormingexpressie van inflammatoire cytokinenhistopathologische analyse van weefselsmeting van de bacteriële lastimmuunrespons van de gastheer
Een neonatale beeldvorming model van gram-negatieve bacteriële sepsis
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.