Transposon Insertion Libraries genereren in gram-negatieve bacteriën voor high-throughput sequencing

Samenvatting

We beschrijven een methode om verzadigende transposon mutantbibliotheken te genereren in gramnegatieve bacteriën en de daaropvolgende voorbereiding van DNA-ampliconbibliotheken voor hoge doorvoersequenties. Als voorbeeld richten we ons op de ESKAPE-ziekteverwekker, Acinetobacter baumannii,maar dit protocol is vatbaar voor een breed scala aan gramnegatieve organismen.

Samenvatting

Transposon sequencing (Tn-seq) is een krachtige methode die transposon mutagenesis en massieve parallelle sequencing combineert om genen en paden te identificeren die bijdragen aan bacteriële fitness onder een breed scala van omgevingsomstandigheden. Tn-seq toepassingen zijn uitgebreid en hebben niet alleen het onderzoek van genotype-fenotype relaties op organisme niveau, maar ook op de bevolking, gemeenschap en systemen niveaus. Gram-negatieve bacteriën zijn sterk geassocieerd met antimicrobiële resistentie fenotypes, die incidenten van antibiotica behandeling falen heeft verhoogd. Antimicrobiële resistentie wordt gedefinieerd als bacteriële groei in de aanwezigheid van anders dodelijke antibiotica. De "last-line" antimicrobiële colistin wordt gebruikt voor de behandeling van gram-negatieve bacteriële infecties. Echter, verschillende Gram-negatieve ziekteverwekkers, waaronder Acinetobacter baumannii kan ontwikkelen colistine resistentie door middel van een reeks van moleculaire mechanismen, waarvan sommige werden gekenmerkt met behulp van Tn-seq. Bovendien, signaal transductie trajecten die colistin resistentie reguleren variëren binnen Gram-negatieve bacteriën. Hier stellen we een efficiënte methode voor om mutagenesis in A. baumannii te transtreren die de generatie van een verzadigende transposon insertiebibliotheek en amplicon bibliotheekbouw stroomlijnt door de noodzaak van beperkingsenzymen, adapterligatie en gelzuivering te elimineren. De hierin beschreven methoden maken een diepgaande analyse mogelijk van moleculaire determinanten die bijdragen aan A. baumannii-geschiktheid wanneer ze worden uitgedaagd met colistine. Het protocol is ook van toepassing op andere Gram-negatieve ESKAPE-pathogenen, die. voornamelijk geassocieerd worden met resistente ziekenhuisinfecties.

Inleiding

De ontdekking van antibiotica is ongetwijfeld een van de meest impactvolle gezondheidsgerelateerde gebeurtenissen van de^20e eeuw. Niet alleen antibiotica snel oplossen ernstige bacteriële infecties, ze spelen ook een centrale rol in de moderne geneeskunde. Grote operaties, transplantaties en vooruitgang in de neonatale geneeskunde en chemotherapie verlaten patiënten die vatbaar zijn voor levensbedreigende infecties en deze therapieën zouden niet mogelijk zijn zonder antibiotica^1,2. De snelle ontwikkeling en verspreiding van antibioticaresistentie onder menselijke pathogenen heeft echter de werkzaamh....

Protocol

1. Preparaat van bacteriële stammen

1. Streep de "donor" stam (E. coli MFD DAP^-/pJNW684, Tabel van materialen) voor geïsoleerde kolonies op Luria-Bertani agar aangevuld met 600 μM diaminopimimlic zuur (DAP), 100 mg/L van ampicilline en 25 mg/L kanamycine. Incubeer 's nachts bij 37 °C. Met behulp van een enkele geïsoleerde kolonie, inentuleren 50 mL luria bouillon (LB) aangevuld met 600 μM DAP, 100 mg/L van ampicilline en 25 mg/L kanamycine in een 250 mL Erlenmeyer kolf en label het als "donor".
2. Streep de "ontvanger" stam (A. baumannii stam ATCC 17978, Tabel van materialen) voor geïsoleerd....

Resultaten

De geschetste methoden beschrijven de generatie van een high-density transposon bibliotheek in A. baumannii stam ATCC 17978 door middel van bacteriële vervoeging met behulp van E. coli MFD DAP^-, die de plasmid pJNW684(figuur 4B) repliceert . Het gedetailleerde protocol maakt gebruik van bi-ouderlijke bacteriële vervoeging voor de overdracht van pJNW684 van de E. coli λpir+ donorstam naar de A. baumannii-ontvangerstam. Dit is een effic.......

Discussie

A. baumannii is een opkomende bedreiging voor de wereldwijde volksgezondheid als gevolg van de snelle verwerving van AMR tegen "last-line" therapeutica, zoals colistin^{10,11,12,23,24,30,31}. In de afgelopen decennia heeft Tn-seq een cruciale rol gespeeld bij het ophelderen van genotyp.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10 mM ddCTP, 2’,3’-Dideoxycytidine-5’-Triphosphate	Affymetrix	77112
100 mM dCTP 2’-Deoxycytidine-5’-Triphosphate	Invitrogen	10217-016
100bp DNA Ladder Molecular Weight Marker	Promega	PR-G2101
100mm x 15mm Petri Dishes	Corning	351029
150mm x 15mm Petri Dishes	Corning	351058
1X B&W	N/A	N/A	Dilute 2X B&W by half to get 1X B&W.
2,6-Diaminopimelic acid	Alfa Aesar	B2239103	used at 600 µM
2X B&W	N/A	N/A	Add 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-271
9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP	N/A	N/A	9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml water. Store at -20°C.
AccuPrimeTM Pfx DNA Polymerase	Invitrogen	12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978	ATCC	N/A	AmpS, KanS
Ampicillin (100 mg/L)	Fisher Scientific	BP1760	used at 100 mg/L
AMPure XP PCR purification system	BECKMAN COULTER	A63881
BioAnalyzer	Agilent	G2939B
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis	Agilent	5067-4626
Deoxynucleotide Solution Mix (dNTP)	New England Biolabs (NEB)	N0447L
DynaMag-2 Magnetic rack	Invitrogen	12321D
E.coli MFD Dap-	N/A	N/A	DAP Auxotroph, requires 600 mM exogenously added DAP to grow. Contains RP4 machinery for plasmid transfer. Carrier for JNW68 (36).
Ethanol	Fisher Scientific	A4094
Externally Threaded Cryogenic Vials	Corning	09-761-71
Glass beads	Corning	72684
Glycerol	Fisher Scientific	G33
Inoculating loops	Fisher Scientific	22-363-602	Scraping tool
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906	used at 25 mg/L
LB agar, Miller	Fisher Scientific	BP1425
LB broth, Miller	Fisher Scientific	BP1426
LoTE	N/A	N/A	Add 3 mM Tris-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
Lysis buffer	N/A	N/A	9.34 mL TE buffer; 600 ml of 10% SDS; 60 ml of proteinase K (20 mg/mL)
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1 Mixture, pH 6.7/8.0, Liq.)	Fisher Scientific	BP1752I
Phosphate Buffered Saline, 10X Solution	Fisher Scientific	BP39920	Diluted to 1X
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher	Q33238
Qubit Assay Tubes	Thermo Fisher	Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher	Q32851
Sonicator with refridgerated waterbath	Qsonica Sonicators	Q2000FCE
Streptavidin Magnetic Beads	New England Biolabs (NEB)	S1420S
TE buffer	N/A	N/A	10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0)
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt)	Promega	PR-M1875