Op fotodiode gebaseerde optische beeldvorming voor het opnemen van netwerkdynamica met single-neuronresolutie in niet-transgene ongewervelde dieren

Samenvatting

Dit protocol presenteert een methode voor het weergeven van neuronale populatieactiviteit met eencellige resolutie bij niet-transgene ongewervelde soorten met behulp van absorptiespanningsgevoelige kleurstoffen en een fotodiode array. Deze aanpak maakt een snelle workflow mogelijk, waarbij beeldvorming en analyse in één dag kunnen worden nagestreefd.

Samenvatting

De ontwikkeling van transgene ongewervelde preparaten waarin de activiteit van specifieke verzamelingen neuronen kan worden geregistreerd en gemanipuleerd met licht vertegenwoordigt een revolutionaire vooruitgang voor studies van de neurale basis van gedrag. Een nadeel van deze ontwikkeling is echter de neiging om onderzoekers te concentreren op een zeer klein aantal "designer" organismen (bijv. C. elegans en Drosophila),wat mogelijk een negatieve invloed heeft op het nastreven van vergelijkende studies bij veel soorten, wat nodig is voor het identificeren van algemene principes van netwerkfunctie. Dit artikel illustreert hoe optische opname met spanningsgevoelige kleurstoffen in de hersenen van niet-transgene gastropode soorten kan worden gebruikt om snel (d.w.z. binnen het tijdsbestek van enkele experimenten) kenmerken van de functionele organisatie van hun neurale netwerken met eencellige resolutie te onthullen. We schetsen in detail de dissectie-, kleurings- en opnamemethoden die door ons laboratorium worden gebruikt om actiepotentiaalsporen te verkrijgen van tientallen tot ~ 150 neuronen tijdens gedragsrelevante motorische programma's in het CZS van meerdere gastropode soorten, waaronder een nieuw in de neurowetenschappen - de nudibranch Berghia stephanieae. Beeldvorming wordt uitgevoerd met absorptiespanningsgevoelige kleurstoffen en een 464-elementen fotodiode array die monsters neemt met 1.600 frames / seconde, snel genoeg om alle actiepotentiaal te vangen die door de opgenomen neuronen wordt gegenereerd. Meerdere opnames van enkele minuten kunnen per preparaat worden verkregen met weinig tot geen signaalbleking of fototoxiciteit. De ruwe optische gegevens die via de beschreven methoden worden verzameld, kunnen vervolgens worden geanalyseerd met verschillende geïllustreerde methoden. Onze optische opnamebenadering kan gemakkelijk worden gebruikt om netwerkactiviteit in een verscheidenheid aan niet-transgene soorten te onderzoeken, waardoor het zeer geschikt is voor vergelijkende studies naar hoe hersenen gedrag genereren.

Inleiding

De ontwikkeling van transgene lijnen van ongewervelde dieren zoals Drosophila en C. elegans heeft krachtige systemen opgeleverd waarin de neurale gedragsbasissen optisch kunnen worden ondervraagd en gemanipuleerd. Deze speciale preparaten kunnen echter de keerzijde hebben van het verminderen van het enthousiasme voor neurale circuitstudies van niet-transgene soorten, met name met betrekking tot de introductie van nieuwe soorten in neurowetenschappelijk onderzoek. Uitsluitend focussen op een of twee modelsystemen is nadelig voor het zoeken naar algemene beginselen van netwerkfunctie , omdat vergelijkende studies een essentiële route vormen waarmee dergelijke principes worden ontdekt^1,2,3,4. Ons doel hier is om een grootschalige beeldvormingsbenadering te demonstreren voor het verkrijgen van snel inzicht in de functionele structuur van gastropode neurale netwerken, in een poging om vergelijkende studies van neurale netwerkfunctie te vergemakkelijken.

Gastropode weekdieren zoals Aplysia, Lymnaea, Tritonia, Pleurobranchaea en anderen worden al lang gebruikt om principes van neurale netwerkfunctie te onderzoeken, grotendeels omdat hun gedrag wordt gemedieerd door grote, vaak individueel identificeerbare neuronen op het oppervlak van ganglia, waardoor ze gemakkelijk toegankelijk zijn voor opnametechnieken⁵.  In de jaren 1970 werden spanningsgevoelige kleurstoffen (VSD's) ontwikkeld die in het plasmamembraan kunnen worden geïntegreerd, waardoor al snel de eerste elektrodevrije opnames van de actiepotentiaal die door meerdere neuronen worden^{gegenereerd, mogelijk werden.} Hier demonstreren we ons gebruik van VSD's om netwerkactiviteit in verschillende soorten gastropoden te onderzoeken, waaronder een nieuw in de neurowetenschappen, Berghia stephanieae. Het beeldvormingsapparaat is een in de handel verkrijgde 464-element fotodiode array (PDA) die monsters neemt met 1.600 frames/seconde(figuur 1),die, bij gebruik met vsd's met snelle absorptie, de actiepotentiaal van alle geregistreerde neuronen onthult⁷. De signalen die door alle diodes worden geregistreerd, worden onmiddellijk na de verwerving weergegeven en op een afbeelding van het ganglion in de PDA-acquisitiesoftware gesuperimpeerd, waardoor het mogelijk is neuronen van belang te onderzoeken met scherpe elektroden in dezelfde voorbereiding^8,9.

In de ruwe PDA-gegevens registreren veel diodes redundant de grotere neuronen, en veel bevatten ook gemengde signalen van meerdere neuronen. Een keerpunt was de ontwikkeling van een geautomatiseerde spikesorteermethode met behulp van onafhankelijke componentanalyse om elke ruwe 464-kanaals PDA-dataset snel te verwerken tot een nieuwe set sporen, waarbij elk geregistreerd neuron verschijnt in een afzonderlijk spoor dat alleen zijn actiepotentiaal^10,11bevat .

In dit artikel schetsen we de essentiële stappen die nodig zijn om grootschalige actie-potentiële opnames van gastropode zenuwstelsels te verkrijgen met een fotodiode array en snelle absorptie VSD's.  We illustreren bovendien analysemethoden die kunnen worden gebruikt voor het clusteren en in kaart brengen van de optisch geregistreerde neuronen met betrekking tot hun functionele ensembles, en voor het karakteriseren van kenmerken op populatieniveau die vaak niet zichtbaar zijn door eenvoudige inspectie van de ontstekingssporen^12,13.

Protocol

OPMERKING: De hieronder beschreven werkstroom is samengevat in figuur 2.

1. Minimaliseer trillingen

1. Zorg er indien mogelijk voor dat de installatie zich op de begane grond bevindt en gebruik een op veren gebaseerde isolatietafel, die een breder scala aan trillingsfrequenties dempt dan luchttafels.
2. Als u een op veren gebaseerde tafel gebruikt, zorg er dan voor dat deze zwevend is (deze moet worden aangepast telkens wanneer u iets toevoegt of van de tafel haalt).
3. Verminder trillingen in de beeldvormingsruimte zoveel mogelijk, zelfs in de mate van het uitschakelen van de luchtstroom tijdens de beeldvorming indien nodig. Minimaliseer trillingen als gevolg van vloeistofturbulentie in perfusiesystemen.
   OPMERKING: De neurale voorbereiding mag niet bewegen tijdens de acquisitie. Bewegingen van welke aard dan ook produceren verschuivingen van contrastranden over de diodes, wat leidt tot artefactuele signalen. Als de procedure een stimulus tijdens de verwerving inhoudt, mag deze geen voorbereidingsbeweging veroorzaken.

2. Voer een pinhole-test uit om ganglionfoto's goed af te stemmen op de PDA-gegevens

1. Plaats een stuk aluminiumfolie met 3 kleine gaatjes erin gestoken op een microscoopschuif. Maak een foto van de drie gaten met de digitale camera gemonteerd op zijn parfocale fotopoort.
2. Met behulp van de beeldvormingssoftware die bij de PDA wordt geleverd, verkrijgt u een kort bestand (bijv. 5 s). Halverwege de acquisitie tikt u op de tafel om trillingsartefacten te induceren die zeer zichtbaar zijn rond de randen van de pinholes, waardoor het beeld van de pinholes nauwkeurig kan worden uitgelijnd met de optische gegevens.
3. Gebruik de functie Superimpose in de beeldvormingssoftware, te vinden in menu-item "Display | Pagina Overlappen | Superimpose Traces met externe afbeelding | Plaats afbeelding"om de diodegegevens op de foto van de pinholes te plaatsen en vervolgens de x-, y- en vergrotingsinstellingen voor de foto iteratief aan te passen totdat de pinholes direct bovenop de pinhole-artefacten in de diodegegevens zitten.
   1. Sla deze nummers op om voorbereidingsfoto's die met de camera zijn gemaakt, uit te lijnen met de diodegegevens in toekomstige experimenten.
      OPMERKING: Pinhole uitlijning van de PDA hoeft slechts één keer te worden uitgevoerd nadat de PDA op de microscoop is gemonteerd, totdat deze wordt gedraaid of verwijderd, waarna deze opnieuw moet worden uitgevoerd.

3. Dissecties voor drie mariene gastropode soorten

1. Voor soorten die tot grote omvang groeien, zoals Tritonia en Aplysia,beginnen met kleinere individuen, die dunnere, minder ondoorzichtige ganglia hebben, waardoor voldoende licht wordt verkregen voor optimaal signaal-ruis.
2. Laat gefilterd kunstmatig zeewater klaar maken om te worden gebruikt als zoutoplossing voor de ontledingen en beeldvormingsexperimenten.
   OPMERKING: In alle volgende stappen van het protocol duidt "zoutoplossing" op kunstmatig zeewater.
3. Dissectie van Tritonia diomedea
   1. Zet een dier ongeveer 20 minuten in de koelkast om het te verdoven.
   2. Voor grotere dieren, bloot de hersenen door het dier in één hand te houden, laat het hoofdeinde over de wesvinger draperen om de "nek" bloot te leggen. Voor kleinere dieren, speld ze dorsale kant omhoog in een met was omzoomde dissectieschaal voordat je de hersenen blootstelt.
   3. Maak met een dissectieschaar een 3-4 cm middellijnincisie aan de dorsale kant van het dier, boven de buccale massa (die door de lichaamswand kan worden gevoeld).
      OPMERKING: Het benodigde deel van het CZS, bestaande uit gesmolten, bilaterale cerebropleurale en pedaalganglia, is oranje en onderscheidend van het omringende weefsel; het ligt onmiddellijk achter de neushoorns en bovenop de buccale massa.
   4. Accijns het CZS door het doorsnijden van die zenuwen innervating het lichaam van het dier met behulp van tang en microdissection schaar, het houden van intact al die zenuwen die de centrale ganglia verbinden. Laat een lange lengte pedaalzenuw 3 (PdN3) achter, of welke zenuw dan ook wordt gestimuleerd.
   5. Gebruik minutienpennen om het CZS op de bodem van een met zoutoplossing gevulde met elastomeer beklede schaal aan te brengen voor verdere dissectie. Houd de bereidingstemperatuur op 11 °C door de schotel te doordrenken met zoutoplossing die wordt geleverd met een feedbackgestuurd, in-line Peltier-koelsysteem met behulp van een peristaltische pomp.
   6. Verwijder met behulp van een tang en microdissectieschaar voorzichtig de losjes aansluitende laag van het bindweefsel rond het CZS. Laat de fijne schede dicht bij de ganglia.
   7. Dip de ganglia kort (~10 s) in een oplossing van 0,5% glutaraldehyde in zoutoplossing. Plaats de ganglia terug in de met zoutoplossing doordrenkte met elastomeer beklede schaal, zodat zoutoplossing het glutaraldehyde kan wegspoelen voordat u begint met VSD-kleuring.
      OPMERKING: Deze lichte fixatie van het bindweefsel en de intrinsieke spieren helpt beweging tijdens beeldvorming te voorkomen.
4. Ontleding van Aplysia californica
   1. Verdoof een dier van ongeveer 40 g door ~20 ml van 350 mM MgCl₂ via het ventrale oppervlak (voet) in het lichaam te injecteren.
   2. Gebruik pinnen om de ventrale kant van het dier omhoog te plaatsen in een met was gevoerde dissectieschaal.
   3. Maak met een dissectieschaar een middellijnincisie van 2-3 cm langs de meest voorste omvang van de voet. Speld de kleppen van de voet aan weerszijden van de incisie vast om een deel van het CZS en de buccale massa te onthullen.
      OPMERKING: Het benodigde deel van het CZS, bestaande uit gesmolten cerebrale ganglia, en nauw apposed, bilaterale pleura- en pedaalganglia, is geeloranje en onderscheidt zich van het omringende weefsel; het zit dorsaal en posterolateraal aan de bolvormige spier buccale massa.
   4. Gebruik een tang en dissectieschaar om de buccale massa voorzichtig te ontleden en de cerebrale ganglia te onthullen.
   5. Accijns het CZS door het doorsnijden van die zenuwen innervating het lichaam van het dier met behulp van tang en microdissection schaar, het houden van intact al die zenuwen die de centrale ganglia verbinden. Laat een lange lengte pedaalzenuw 9 (PdN9) achter, of welke zenuw dan ook wordt gestimuleerd.
   6. Gebruik minutienpennen om het CZS in een met zoutoplossing gevulde met elastomeer beklede schaal te plaatsen. Houd de bereidingstemperatuur op 15-16 °C door de schaal met zoutoplossing door een Peltier-koelapparaat te laten gaan.
   7. Verwijder met behulp van een tang en microdissectieschaar overmatig bindweefsel uit het CZS en ontleed een oppervlakkig deel van de schede op het ganglion of ganglia dat moet worden afgebeeld. Wees voorzichtig tijdens dit proces om geen gat in de schede te maken, wat zou resulteren in neuronen die van binnenuit uitlopen.
   8. Dip de ganglia kort (~20 s) in een oplossing van 0,5% glutaraldehyde in zoutoplossing. Plaats de ganglia terug in de met zoutoplossing doordrenkte met elastomeer beklede schaal, zodat zoutoplossing het glutaraldehyde kan wegspoelen voordat u begint met VSD-kleuring.
5. Ontleding van Berghia stephanieae
   1. Zet een dier ongeveer 20 minuten in de koelkast om het te verdoven.
   2. Plaats minutienpen in zowel het hoofd als de staart met behulp van een met elastomeer beklede schaal gevuld met zoutoplossing op kamertemperatuur.
   3. Maak met behulp van een microdissectieschaar een dorsale incisie van 5-7 mm oppervlakkig voor het CZS.
      OPMERKING: De ogen, donkere vlekken die zich in het dier naast het CZS bevinden, markeren gemakkelijk de positie van het benodigde deel CNS, dat bestaat uit bilateraal gesmolten cerebropleurale en pedaalganglia en bovenop de buccale massa zit.
   4. Accijns het CZS door het doorsnijden van die zenuwen die het lichaam van het dier binneninvaten met behulp van een tang en een microdissectieschaar. Laat elke zenuw voldoende lang worden gestimuleerd voor een zuigelektrode.

4. Bevlek het preparaat met een spanningsgevoelige kleurstof

1. Bereid voorraadoplossingen voor van RH155 (ook bekend als NK3041) of RH482 (ook bekend als NK3630 of JPW1132).
   1. RH155: Los 5,4 mg vaste kleurstof op in 1 ml 100% EtOH en pipetteer 29 μL in elk van de 34 microcentrifugebuizen. Als de inhoud van elke buis aan de lucht wordt blootgesteld, laat u ze 's nachts in het donker drogen. Dop en plaats de resulterende vaste aliquots RH155, elk met 0,15 mg, in een vriezer van -20 °C.
   2. RH482: Los 2 mg vaste kleurstof op in 100 μL DMSO, verdeel de oplossing in 20 aliquots van 5 μL, elk met 0,1 mg RH482, en bewaar in een vriezer van -20 °C.
      OPMERKING: Voor Tritonie en Aplysiakan badperfusie of druktoepassing worden gebruikt om de VSD RH155 in de membranen van de neuronen in het preparaat te laden. Druktoepassing heeft het voordeel dat alleen het ganglion wordt blootgesteld aan de VSD.
2. Voeg voor badperfusie 5 ml zoutoplossing toe aan elk van de twee bovengenoemde aliquots vaste RH155 en vortex in de oplossing, waardoor een gecombineerde oplossing van 10 ml wordt verzacht die 0,03 mg/ml RH155 bevat.
   1. Perfuseer in het donker (om fotobleaching te voorkomen) gedurende 1 tot 1,5 uur bij 11 °C voor Tritonie en bij 16 °C voor Aplysia. Houd de temperatuur op peil door de perfusieoplossing door een Peltier koelsysteem te laten gaan.
3. Voeg voor druktoepassing 500 μL zoutoplossing toe aan één aliquot RH155 en vortex om een kleurstofconcentratie van 0,3 mg/ml te produceren.
   1. Trek ongeveer 200 μL van de oplossing in polyethyleen buizen met behulp van een handheld microdispenser, zodat er een goede match is tussen de buisdiameter en de diameter van het ganglion dat moet worden gekleurd.
   2. Gebruik een micromanipulator om het uiteinde van de buis voorzichtig over het doelganglion te plaatsen en laat het zakken totdat het een nauwsluitende afdichting op het ganglion vormt. Gebruik het hierboven beschreven type koelsysteem om de ganglia op de gewenste temperatuur te houden.
   3. Dim de kamerlampen om fotobleaching te voorkomen en draai de microdispenser applicatorknop om de 5 minuten om meer kleurstof op het ganglion te forceren.
   4. Controleer op 30 minuten om te bevestigen dat er goede vlekken optreden en ga dan door voor een totale kleuringstijd van ongeveer 1 uur.
4. Voeg voor kleuring in Berghia1 ml zoutoplossing toe aan een bevroren aliquot RH482 en vortex om op te lossen.
   1. Breng 200 μL van deze oplossing over in een microcentrifugebuis met 800 μL zoutoplossing en vortex in een oplossing, waardoor een uiteindelijke kleuroplossing van 0,02 mg/ml RH482 in zoutoplossing met 0,1% DMSO ontstaat.
   2. Plaats het hele CZS in de microcentrifugebuis, wikkel de buis in aluminiumfolie om fotobleaching te voorkomen en schud elke 5-6 minuten met de hand gedurende ongeveer 1 uur. Bewaar de resterende 800 μL van de eerste oplossing in de koelkast en gebruik deze maximaal 3 dagen om latere preparaten te bevlekken.

5. Maak de voorbereiding plat en stel deze in voor zenuwstimulatie

OPMERKING: De stappen in deze sectie moeten worden uitgevoerd onder minimale verlichting of met groen licht om fotobleaching te minimaliseren.

1. Dompel het CZS na het kleuren onder in zoutoplossing in de beeldkamer en plaats het onder een ontleedmicroscoop.
2. Plaats stukjes siliconen (voor Tritonia of Aplysia)of klodders vaseline (voor Berghia)links en rechts van het ganglion/ganglia om in beeld te brengen.
3. Druk een stuk van een glas of plastic deksel van de juiste grootte op het preparaat om het plat te maken. Druk stevig, maar niet zo hard dat de neuronen beschadigd raken.
   OPMERKING: Door het bolle oppervlak van het preparaat op deze manier af te vlakken, wordt een groter aantal neuronen parfocaal, waardoor het aantal geregistreerde neuronen toeneemt, en zal het bovendien helpen om het preparaat tijdens de beeldvorming te immobiliseren.
4. Als u een zenuw stimuleert om een fictief motorisch programma uit te lokken, bereid dan een zuigelektrode voor waarvan de voorste punt ongeveer even breed is als de zenuwdiameter. Bereik dit door een segment PE-100 polyethyleen buizen voorzichtig over een vlam te smelten terwijl u voorzichtig aan beide uiteinden van het buizensegment trekt en vervolgens de resulterende taps toelopende op het gewenste punt snijdt.
   1. Trek een klein volume zoutoplossing door het taps toelopende uiteinde van een polyethyleen zuigelektrode, gevolgd door het uiteinde van de te stimuleren zenuw, door een lengte van dikwandige, flexibele polymeerbuizen aan de achterkant van de elektrode te bevestigen en mondzuiging te gebruiken om negatieve druk uit te oefenen.
   2. Controleer of de zoutoplossing in de elektrode geen bellen heeft die de elektrische geleiding kunnen onderbreken.

6. Voorbereiding en optimalisatie voor beeldvorming

1. Verplaats de kamer naar de beeldvormingsinstallatie. Start de zoutoplossingperfusie door de opnamekamer en plaats de temperatuursonde in de buurt van het preparaat. Stel de temperatuurregelaar in voor de gewenste temperatuur voor de afgebeelde soort (voor Tritonia, 11 °C, voor Aplysia, 15-16 °C, of voor Berghia, 26-27 °C).
2. Plaats een chloride zilverdraad langs de zuigelektrode en zorg ervoor dat deze in contact komt met de zoutoplossing in de elektrode en plaats de andere Ag-AgCl-draad (het retourpad) in de badzoutoplossing, in de buurt van de zuigelektrode.
3. Laat de wateronderdompelingslens in de zoutoplossing zakken. Sluit het basismembraan en til vervolgens de subtrapcondensator op of neer en pas de scherpstelling aan totdat de randen van het membraan scherp zijn, waardoor Köhler-verlichting ontstaat.
   1. Focus op de regio van de te bebeelden voorbereiding. Bias gericht op kleinere neuronen dan grotere neuronen, omdat optische signalen afkomstig uit grotere neuronen waarschijnlijker zijn dan kleinere neuronen die worden geregistreerd, zelfs als ze enigszins on scherp zijn.
   2. Maak een foto van het ganglion om in beeld te worden brengen met de parfocale digitale camera.
   3. Met de gain-schakelaar van het bedieningspaneel ingesteld op 1x, inspecteert u de rustlichtintensiteit (RLI) in de beeldvormingssoftware door op de knop "RLI"te klikken en de gemiddelde RLI van de diodes te controleren. Pas het spanningsniveau aan dat van een stimulator naar de LED-lampvoeding wordt gestuurd en blijf het gemiddelde RLI-niveau controleren totdat het zich in het gewenste bereik bevindt (meestal ongeveer 3-4 V).
      OPMERKING: Hoge RRI's, overeenkomend met ongeveer 3-4 V op de PDA, zijn wenselijk. Hoe hoger het licht, hoe beter de signaal-ruisverhouding van de optische signalen, maar dit moet worden afgewogen tegen een snellere snelheid van fotobleaching bij hogere RTI's. Dit risico wordt geminimaliseerd door het gebruik van high-NA objectieve lenzen. De gebruikte wateronderdompelings objectieve lenzen zijn 10x/0.6 NA, 20x/0.95 NA, 40x/0.8 NA en 40x/1.15 NA.
4. Stel de versterkingsschakelaar van het bedieningspaneel in op 100x voor de opname.
5. Als u een zenuw stimuleert, stelt u de gewenste spanning, frequentie en duur in op een afzonderlijke stimulator die wordt gebruikt om het lichtniveau in te stellen. Controleer of de TTL-activering tussen het bedieningspaneel en de stimulator correct is geconfigureerd.
   OPMERKING: De parameters voor zenuwprikkels bij elke soort zijn als volgt: Tritonie PdN3, 2 s, 10 Hz pulstrein van 5 ms, 10 V pulsen; Aplysia PdN9, 2,5 s, 20 Hz pulstrein van 5 ms, 8 V pulsen; een Berghia pedaalzenuw, 2 s, 10 Hz pulstrein van 5 ms, 5 V pulsen.
6. Controleer nogmaals of de veer- of luchttafel drijft.

7. Optische opname

1. Schakel de kamerverlichting uit of dim ze, inclusief eventuele bovengrondse TL-verlichting.
2. Stel de gewenste bestandsduur, het pad en de bestandsnaam in en klik vervolgens op de knop "Gegevens opnemen" in de beeldvormingssoftware om bestanden te verkrijgen tot de capaciteit van het beschikbare RAM-geheugen van de computer. Blijf stil tijdens de optische opname, omdat kleine trillingen grote artefacten in de optische opnamegegevens kunnen introduceren.
   OPMERKING: Voor acquisities die het beschikbare RAM-geheugen van de computer zouden overschrijden, is een op maat gemaakt C ++ acquisitieprogramma beschikbaar via Dr. Jian-young Wu van Georgetown University.
3. Om gegevens onmiddellijk na de verwerving te bekijken, gebruikt u de functie Superimpose in de beeldvormingssoftware om de gegevens die door alle 464 dioden zijn verzameld, te overlappen boven het beeld van het ganglion dat eerder van de voorbereiding is genomen⁷. Klik op een van de diodes die in de software worden weergegeven om uit te vouwen wat ze op een apart traceerscherm hebben opgenomen.
   1. Bereik een exacte uitlijning van de dioden met betrekking tot het preparaat door de x-, y- en vergrotingsfactoren in te voeren zoals eerder bepaald door de pinhole-test.
   2. Om de zichtbaarheid van actiepotentiaal te maximaliseren en de neuronopbrengst voor daaropvolgende spikesortering¹⁴te verbeteren, legt u een bandpass Butterworth-filter op met 5 Hz en 100 Hz-cutoffs (beschikbaar in beeldvormingssoftware) om zowel laag- als hoogfrequent geluid te verwijderen.
   3. Om gefilterde optische gegevens op te slaan als tekstbestand voor verdere analyse in een wetenschappelijk computerplatform, selecteert u eerst het vak "TP-filter" net onder het scherm "Pagina" in de beeldvormingssoftware. Selecteer vervolgens "Pagina opslaan als ASCII" op het tabblad "Uitvoer" en voer de gewenste bestandsnaam in het dialoogvenster in dat verschijnt.

Resultaten

Tritonie
Huidcontact met zijn zeesterroofdier activeert tritonia diomedea's ontsnappingszwemmen, bestaande uit een ritmische reeks buigingen van het hele lichaam die het in veiligheid brengen (figuur 3A). In geïsoleerde hersenpreparaten roept een korte stimulus op pedaalzenuw 3 (PdN3) het ritmische zwemmotorische programma (SMP) op voor dit gedrag, dat gemakkelijk herkenbaar is in optische opnamen van de pedaalganglia. Figuur 3B toont de lay-out van een VSD-beeldvormingsexperiment dat is ontworpen om de vuuractiviteit van neuronen op het dorsale oppervlak van het linker Tritonia pedaalganglion, waarover de PDA was geplaatst, vast te leggen als een stimulans voor de contralaterale (rechtse) PdN3 die de SMP uitlokt. Ruwe en gefilterde gegevens (bandpass Butterworth-filter, 5 en 100 Hz cutoffs) van 20 diodes die activiteit registreren voor, tijdens en na stimulatie van PdN3 worden weergegeven in respectievelijk figuren 3C,D. De zenuwprikkel werd 20 s in het bestand van 2 minuten geleverd. Onmiddellijk na de verwerving kunnen de signalen gemeten door alle 464 dioden van de opnamearray topografisch worden weergegeven over een afbeelding van de voorbereiding in de beeldvormingssoftware (figuur 3E). Op dit punt bevatten veel sporen spikes die redundant zijn geregistreerd vanuit dezelfde neuronen, en sommige sporen bevatten spikes van meer dan één neuron. Spike-sortering van de gefilterde diodesporen met ICA leverde 53 unieke neuronale sporen op, waarvan er 30 worden weergegeven in figuur 3F. De kinetiek van individuele spikes kan worden gewaardeerd in figuur 3G, die een fragment van vier sporen uit figuur 3F (rode doos) uitbreidt; de nauwkeurigheid van het ICA spikesorteeralgoritme werd eerder geverifieerd met behulp van gelijktijdige scherpe elektrodeopnamen, waaruit bleek dat alle spikes in de gesorteerde sporen overeenkomen met intracellulair geregistreerde spikes van individuele neuronen^11,14.

Aplysia
Een sterk aversieve staartprikkel voor Aplysia californica roept een stereotiepe tweedelige ritmische ontsnappingsreactie op¹⁵. De eerste fase van de respons is een galop van verschillende cycli van koplongen en staarttrekkingen die het dier snel naar voren bewegen. Dit wordt meestal gevolgd door een periode van kruipen, waarbij herhaalde golven van hoofd-tot-staart gespierde samentrekkingen betrokken zijn die het dier enkele minuten met een lagere snelheid naar voren drijven (figuur 4A). Om deze ontsnappingsmotorische programma's vast te leggen in optische opnames, was de PDA gericht op het dorsale oppervlak van het rechter pedaalganglion in een geïsoleerd hersenpreparaat, en werd een zuigelektrode op de contralaterale (linker) pedaalzenuw geplaatst 9 (PdN9; Figuur 4B). Een minuut in een continue optische opname van 20 minuten(figuur 4C),pdn9 werd gestimuleerd om de galop-crawl motorische programmasequentie uit te lokken. De probabilistische Gaussiaanse ruimtelijke verdelingen van de signalen van alle 81 geregistreerde neuronen werden in kaart gebracht op het ganglion (Figuur 4D). Dimensionaliteitsreductie toegepast op de volledige opname toonde aan dat de galop (cyaan) en kruip (donkerblauw) fasen van het ontsnappingsprogramma verschillende gebieden bezetten en verschillende trajecten vormden, spiraal- en lusachtig, respectievelijk in de hoofdcomponentruimte (Figuur 4E).

Drie video's op basis van de Aplysia-opname in figuur 4 laten verdere soorten analyses zien die op dergelijke datasets kunnen worden uitgevoerd. Video 1 animeert het afvuren van alle opgenomen neuronen gedurende de volledige duur van de opname. De eerste poststimulatorische periode van het ontsnappingsmotorische programma werd gekenmerkt door een galop, waarbij de activiteit in het ganglion werd gekenmerkt door afwisselend barsten van verschillende functionele clusters (Video 2). De galop ging vervolgens over in een kruip, waarbij de activiteit over neuronale clusters grotendeels phasisch bleef, maar een rotatietraject tegen de klok in in het ganglion aannam (Video 3). De laatste twee video's bevatten ook consensusclustering, die het vuren en de locaties van de verschillende functionele ensembles voor de galop- en kruipfasen van de ontsnappingsrespons afzonderlijk onthult. Merk op dat veel neuronen die aan dezelfde cluster waren toegewezen in zowel de galop- als de kruipfase fysieke nabijheid van elkaar vertoonden in het ganglion, consistent met eerdere bevindingen¹².

Berghia
De aeolide nudibranch Berghia stephanieae (figuur 5A) vertegenwoordigt een nieuw modelsysteem voor neurowetenschappen. De beeldvormingsopstelling voor een typisch Berghia-experiment is weergegeven in figuur 5B. Om grootschalige neuronale activiteit uit te lokken, werd een zuigelektrode op de meest prominente linker pedaalzenuw geplaatst en werd een zenuwprikkel 30 s in een opname van 2 minuten geleverd. ICA-verwerkte sporen onthulden zowel spontane als stimulus-opgeroepen activiteit in 55 neuronen (Figuur 5C). Communitydetectie via consensusclustering identificeerde tien verschillende functionele ensembles, die worden weergegeven in figuur 5D in een netwerkgrafiek en in figuur 5E, die de sporen in figuur 5C reorganiseert op basis van hun clustertoewijzingen. Gaussiaanse verdelingen van de signalen van alle geregistreerde neuronen worden op een afbeelding van het preparaat in figuur 5F geplaatst om de posities van alle 55 geregistreerde neuronen aan te geven.

Figuur 1: Weergaven van de optische beeldvormingsinstallatie en fotodiode array (PDA). (A) De optische beeldvormingsinstallatie, die PDA, digitale camera, microscoop, en stadium kenmerkt. (B) Het interne ontwerp van de PDA, waarbij glasvezel het beeldopening verbindt met 464 fotodiodes. Boven de fotodiodes bevindt zich een rij versterkers. (C) Het zeshoekige vlak van de beeldopening waarop het afgebeelde gebied is gericht. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2: Een stroomdiagram dat de essentiële workflow illustreert bij het verkrijgen van optische opnamen. De essentiële stappen in het VSD imaging protocol, van dissectie en kleuring tot de details van beeldvorming, worden in dit stroomdiagram weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3: Resultaten van Tritonia diomedea, ter illustratie van ruwe, gefilterdeen spike-gesorteerde gegevens. (A) Tritonia ontsnapt uit de roofzuchtige zeester Pycnopodia helianthoides door zijn zwemtocht, die bestaat uit afwisselende rug- en ventrale buigingen van het lichaam. (B) Schematisch van de beeldvormingsinstelling. Ce=cerebrale kwab van het cerebropleural ganglion; Pl = pleurale kwab van het cerebropleural ganglion; Pd = pedaal ganglion. (C) Ruwe gegevens van 20 fotodiodes, die activiteit in het linker pedaalganglion weergeven tot stimulatie van de contralaterale PdN3 (stimulus aangegeven door de pijl). (D) Gefilterde gegevens uit dezelfde diodes als in C (5 en 100 Hz bandpass Butterworth filter). (E) Imaging software output waarbij gecomprimeerde sporen verzameld door alle 464 diodes topografisch worden overgeimposeerd over een afbeelding van het preparaat. De posities van de 20 diodes waarvan de sporen in C en D zijn weergegeven, zijn rood gemarkeerd. (F) Dertig geselecteerde single-neuron sporen gegenereerd door spike-sortering via ICA. (G) Een uitgebreide weergave van vier single-neuron sporen, overeenkomend met het rode vak in F, toont hun actiepotentiaal bij een hogere temporele resolutie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4: Resultaten van Aplysia californica, ter illustratie van langdurige registratie, signaalmapping en dimensionaliteitsreductie. (A) De twee fasen van Aplysia's sequentiële ontsnappingsmotorprogramma, de galop en de kruip. (B) Schematisch van de beeldvormingsinstelling. Ce = cerebrale ganglion; Pl = pleura ganglion; Pd = pedaal ganglion. (C) Een opname van 20 minuten van 81 neuronen in het rechter pedaal ganglion die reageren op een stimulus op de contralaterale PdN9 (aangegeven door de pijl). Groene, cyaan en donkerblauwe balken onder de sporen geven respectievelijk de preprikkelperiode, de galop en de kruipfasen van het ontsnappingsmotorische programma aan. (D) Een beeld van de voorbereiding met in kaart gebrachte probabilistische Gaussiaanse verdelingen van de locaties van alle 81 neuronale signaalbronnen geïdentificeerd door ICA. De groene omtrek vertegenwoordigt de positie van het zeshoekige gezicht van de PDA ten opzichte van het ganglion. De nummers op elke Gaussiaan komen overeen met de sporen in C. (E) Dimensionaliteitsreductie met behulp van de analyse van de hoofdcomponenten waarbij de eerste drie hoofdcomponenten in de loop van het bestand van 20 minuten tegen elkaar worden uitgezet. De prestimulatorische basislijn, galop en kruipperioden worden respectievelijk weergegeven in groen, cyaan en donkerblauw. Zie Video's 1-3 voor animaties van neuronaal vuren die overeenkomen met deze opname. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5: Resultaten van Berghia stephanieae, een nieuwe soort voor neurowetenschappen, ter illustratie van netwerkgrafieken, functionele clusteringen bilaterale signaalmapping. A Een Berghia exemplaar. (B) Schematisch van de beeldvormingsinstelling. Ce = hersenkwab van het cerebropleurale ganglion; Pl = pleurale kwab van het cerebropleural ganglion; Pd = pedaal ganglion; Rh = neushoorn ganglion. (C) Sporen die de spontane en stimulus-opgeroepen activiteit van 55 bilaterale neuronen in de cerebropleurale ganglia weergeven (de afgifte van de stimulus wordt aangegeven door de pijl). (D) Een netwerkgrafiek met de tien functionele ensembles, elk met een unieke kleur, geïdentificeerd door middel van consensusclustering. Knooppunten in dit plot vertegenwoordigen neuronen, waarbij afstand in de netwerkruimte de mate van vuurcorrelatie binnen en tussen ensembles vertegenwoordigt. (E) De sporen in C worden herschikt en kleurgecodeerd (volgens het kleurenschema van D) in functionele ensembles. (F) Een afbeelding van het preparaat met de in kaart gebrachte locaties van de signalen van elk geregistreerd neuron en de sporen in C en E waarmee ze overeenkomen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Video 1: Animatie van het volledige Aplysia escape locomotor-programma van 20 minuten. De dekking van de witte vormen die 81 individuele neuronen in het rechter pedaalganglion (linkerpaneel) overspannen, werd aangedreven door de overeenkomstige neuronale sporen (rechterpaneel) en varieerde lineair als functie van de gemiddelde pieksnelheid (binned per elke 0,61 s real-time in de opname). Voor elk neuron werd de volledige dekking genormaliseerd tot de maximale vuursnelheid gedurende de duur van de opname. Een seconde van de verstreken tijd in de video vertegenwoordigt 12,2 s real-time. De schaalbalk komt overeen met real-time, met de groene, cyaan- en donkerblauwe lijnen onder de sporen die respectievelijk de preprikkelbasislijn-, galop- en kruipfasen van het ontsnappingsmotorische programma aangeven. De gele vakjes rond de galopfase en een deel van de kruipfase geven de opnamefragmenten aan die worden gebruikt om de animaties in video's 2 en 3te genereren. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Video 2: Animatie van de galopfase van het Aplysia escape locomotor programma. Consensusclustering werd uitgevoerd op alle 81 geregistreerde neuronen in alleen de galopfase van het motorische programma om de functionele ensembles af te leiden, met behulp van de aanpak en software beschreven en beschikbaar gesteld in ref.¹². Neuronale ensembles die grotendeels tonic of onregelmatige vuurpatronen vertonen tijdens deze fase van het ontsnappingsprogramma werden weggelaten uit deze video. De actiepotentiaal van de neuronen die behoren tot de zwarte en olijfgroene ensembles is te horen in de audiotrack van de video, waarbij de bijbehorende neuronen en sporen worden gemarkeerd. Gemiddelde piekpercentages werden genormaliseerd zoals in Video 1 en met gelijkwaardige tijd binning; 1 s verstreken tijd in de video komt overeen met 6,1 s real-time. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Video 3: Animatie van de kruipfase van het Aplysia escape locomotor programma. Consensusclustering werd uitgevoerd op alle 81 geregistreerde neuronen in alleen de kruipfase van het motorische programma om de functionele ensembles af te leiden. Ensembles die tijdens deze fase van het motorische programma grotendeels tonic of onregelmatige vuurpatronen vertoonden, werden uit deze video weggelaten. Gemiddelde piekpercentages werden genormaliseerd zoals in video's 1 en 2 en met vergelijkbare tijd binning; 1 s verstreken tijd in de video komt overeen met ongeveer 12,2 s real-time. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Discussie

Een van de belangrijkste details bij het implementeren van onze grootschalige VSD-beeldvormingsbenadering is het minimaliseren van trillingen, die bewegingen van contrastranden over de diodes produceren, wat resulteert in grote artefactuele signalen. Omdat absorptie VSD's zeer kleine veranderingen in lichtintensiteit produceren met actiepotentiaal, kunnen trillingsartefacten, indien niet voorkomen, de neuronale signalen van belang verduisteren. We gebruiken verschillende methoden om trillingsartefacten te minimaliseren. Ten eerste bevindt onze beeldvormingsruimte zich op de begane grond, die het preparaat isoleert van trillingen met betrekking tot luchtbehandelingsapparatuur voor gebouwen en vele andere bronnen. Ten tweede werd een op veer gebaseerde isolatietafel gebruikt, waarvan andere PDA-gebruikers hebben bevestigd dat deze een betere trillingsdemping biedt dan de meer gebruikelijke luchttafel¹⁶. Ten derde werden wateronderdompelingsdoelstellingen gebruikt, die beeldschommelingen als gevolg van oppervlakterimpelingen elimineren. Ten vierde werd het preparaat dat in beeld werd gebracht lichtjes tussen de bodem van de kamerbekleding gedrukt en een deklipfragment dat van bovenaf naar beneden werd gedrukt en dat op zijn plaats wordt gehouden door siliconenpluggen of vaseline, waardoor het preparaat verder wordt gestabiliseerd. Dit maakt ook het bolle oppervlak van het ganglion of ganglia dat wordt afgebeeld plat, wat resulteert in meer neuronen in het scherpstelvlak van het doel, wat het aantal geregistreerde neuronen verhoogt.

Om de signaal-ruisverhouding te maximaliseren voor de zeer kleine veranderingen in de mate van VSD-lichtabsorptatie als gevolg van een actiepotentieel, is het essentieel om bijna-verzadigend licht te bereiken door de voorbereiding op de PDA, terwijl tegelijkertijd het fotobleachen van de kleurstof wordt geminimaliseerd. Hiertoe werken we meestal op 3-4 V rustlichtintensiteit, zoals gemeten met de PDA-bedieningspaneelversterkingsschakelaar in de 1x-positie (de 464 versterkers van de PDA verzadigen bij 10 V licht). Tijdens het verzamelen van gegevens wordt deze versterkingsfactor gewijzigd in 100x. Het verkrijgen van voldoende licht om 3-4 V te bereiken, zoals gemeten door de PDA, kan op verschillende manieren worden bereikt. Gebruik eerst een ultrabright LED-lichtbron die een golflengte levert die past bij de absorptie-eigenschappen van de gebruikte absorptiekleurstof. Dienovereenkomstig werd een 735 nm LED gebotste lamp gebruikt, die overlapt met de optimale absorptiegolflengten van RH155 en RH482. Gebruik vervolgens, indien nodig, een flip-top subtrapcondensator die het licht van de LED-lichtbron naar een kleiner gebied concentreert. Stel ten derde de condensorhoogte in om Köhler-verlichting te bereiken, wat zorgt voor een hoge, gelijkmatige helderheid en maximale beeldkwaliteit. Ten vierde, zorg ervoor dat er geen warmtefilters in de optische route zijn, die de golflengte van de LED-lamp van 735 nm kunnen dempen. Ten vijfde, verwijder diffusers, als er meer licht nodig is, van de optische route. Ten zesde, gebruik high-NA doelstellingen, die een hoge ruimtelijke resolutie bieden, en laat voldoende niveaus van licht om de PDA te bereiken bij lagere lichtintensiteiten. Dit heeft ons in staat gesteld om fotobleaching te minimaliseren in de mate dat we verschillende acquisitiebestanden van 10-20 minuten duur per voorbereiding kunnen verkrijgen met dezelfde lichtintensiteit voor alle bestanden en zonder een significant verlies van signaalamplitude of de noodzaak van herkleuring. Cruciaal is dat als de experimenteerder neuronen over deze langere bestanden wil volgen, zorg er dan voor dat het brandpuntsvlak niet verandert en dat de voorbereiding niet beweegt. Ten slotte is een extra manier om voldoende licht naar de PDA te routeren, het gebruik van jongere dieren, die dunnere en dus minder ondoorzichtige ganglia hebben.

Van tijd tot tijd zien we dat de signaal-ruisverhouding van de optische signalen verslechtert en/of de ritmes van het motorische programma suboptimaal zijn (bijv. langzaam of abnormaal). Wanneer dit consequent begint te gebeuren, mengen we nieuwe oplossingen van VSD. Aliquots van VSD blijven meestal ongeveer 6 maanden levensvatbaar in een vriezer van -20 °C. Gerelateerd is het vermeldensvermogend dat voor Berghiade beste resultaten tot nu toe zijn verkregen met de absorptie VSD RH482. Omdat RH482 meer lipofiel is dan RH155, kan het berghia's relatief kleinere neuronen beter bevlekken of effectiever in de neuronale membranen blijven bij de hogere opname zoute temperatuur die voor deze tropische soort wordt gebruikt.

Een beperking van PDA-gebaseerde beeldvorming van neurale activiteit heeft betrekking op de AC-koppeling van de spanningssignalen in hardware vóór de 100x voorversterkerstap: hoewel dit een noodzakelijk kenmerk is om de grote DC-offset te verwijderen die wordt geproduceerd door het hoge rustlichtniveau dat door deze techniek wordt vereist, sluit de AC-koppeling die inherent is aan de PDA het meten van langzame veranderingen in membraanpotentiaal uit, zoals die welke verband houden met synaptische ingangen. Als het opnemen van langzame of steady-state potentiële veranderingen gewenst is, kan een DC-gekoppeld CMOS-camerabeeldsysteem worden gebruikt om subthreshold-activiteit vast te leggen. Byrne en collega's gebruikten onlangs een dergelijke opstelling met RH155 om de activiteit van neuronen in het buccale ganglion van Aplysia¹⁷,¹⁸ⁱⁿbeeld te brengen . We hebben beide systemen gebruikt en ontdekten dat de CMOS-camera, vanwege de veel hogere dichtheid van detectoren (128 x 128), 50x grotere gegevensbestanden genereert voor dezelfde beeldtijd⁷. De kleinere bestanden van de PDA vergemakkelijken een snellere verwerking en analyse. Dit maakt ook uitgebreide single-trial opnames (Figuur 4) en studies van leren mogelijk, waarbij gegevens uit meerdere proeven worden samengevoegd tot één groot bestand voordat spike-sortering, waardoor netwerkorganisatie kan worden gevolgd naarmate het leren zich ontwikkelt¹⁹.

In andere camera-gebaseerde onderzoeken, fluorescerende VSD's zijn gebruikt door Kristan en collega's om netwerkfunctie in de segmentale ganglia van de bloedzuiger te onderzoeken. In een invloedrijke studie leidde dit tot de identificatie van een neuron dat betrokken was bij de beslissing van het dier om te zwemmen of te kruipen²⁰. In een andere studie onderzochten Kristan et al. in hoeverre het zwem- en kruipgedrag van de bloedzuiger wordt aangedreven door multifunctionele versus speciale circuits²¹. Meer recent gebruikten Wagenaar en collega's een tweezijdige microscoop voor spanningsbeeldvorming waarmee ze van bijna alle neuronen in een bloedzuigersegmentaal ganglion²²kunnen opnemen. In tegenstelling tot veel cameragebaseerde beeldvormingsmethoden, is een voordeel van onze PDA-gebaseerde beeldvormingsmethode snelle en onbevooroordete spike-sortering door ICA, een vorm van blinde bronscheiding waarbij geen beslissingen worden genomen over neuronale grenzen voor resultaatverwerking.

Met betrekking tot de keuze van VSD's is een voordeel van de absorptiekleurstoffen RH155 en RH482 de weinig tot geen fototoxiciteit die ermee gepaard gaat^23,24, waardoor langere opnametijden mogelijk zijn dan typisch is voor fluorescerende VSD's. Bovendien zijn de vsd's met snelle absorptie die we gebruiken zeer geschikt voor het registreren van de overschrijding van somatische actiepotentiaal in gastropode preparaten, die meestal 80 mV in amplitude zijn. Zoals weergegeven in figuur 3G,kan onze optische methode actiepotentiaalonderschepingen registreren (geen van onze opnamen is trace-gemiddeld): dit suggereert dat de VSD's die we gebruiken actiepotentiaal moeten kunnen onderscheiden in andere modelsystemen die tot op zekere hoogte dempen en dus niet overschrijden tegen de tijd dat ze de soma bereiken. Toch is onze optische benadering misschien niet ideaal voor soorten waarvan bekend is dat ze zeer verzwakte actiepotentiaal vertonen wanneer ze in de soma worden geregistreerd.

Veel huidig onderzoek naar neurale netwerken is gericht op een klein aantal designer transgene soorten. Neurowetenschappen profiteren echter van de studie van een breed scala aan fylogenetisch verschillende soorten. Het bestuderen van veel verschillende soorten geeft inzicht in hoe circuits evolueren^25,26, en verlicht principes van netwerkfunctie die gemeenschappelijk kunnen zijn in phyla^1,2,3,4,27. We hebben tot nu toe onze beeldvormingsmethode toegepast op een aantal gastropode soorten, waaronder Aplysia californica^{8,11,12,13,14,28,} Tritonia diomedea^{8,9,11,14,19,28,} Tritonia festiva^28, Pleurobranchaea californica (ongepubliceerde gegevens) en meest recent Berghia stephanieae (figuur 5). Een aantrekkingskracht van deze aanpak is dat het gemakkelijk kan worden toegepast op veel soorten, zonder dat er transgene dieren nodig zijn. We willen erkennen dat ons gebruik van VSD-beeldvorming met snel absorberende kleurstoffen en een PDA in de voetsporen treedt van baanbrekend werk dat dit heeft bereikt in semi-intacte, zich gedragende Navanax^29- en Aplysia^{30-preparaten.} Onze nadruk op de snelheid van onze aanpak is deels een antwoord op de bezorgdheid dat veel onderzoekers steeds terughoudender kunnen zijn om netwerkstudies bij nieuwe soorten te starten uit angst dat jarenlange studie nodig zal zijn om de basisnetwerkorganisatie te karakteriseren voordat we wetenschappelijke vragen van breed belang voor neurowetenschappen kunnen onderzoeken³¹. Daarom is ons doel hier om een techniek te demonstreren die het proces aanzienlijk versnelt - tot het punt dat significante inzichten op dezelfde dag in netwerkorganisatie kunnen worden verkregen uit enkele voorbereidingen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Achromat 0.9 NA swing condenser	Nikon	N/A
Bipolar temperature controller	Warner Instruments	CL-100 with SC-20	Controleert perfusie zoutoplossing temperatuur
Chamber thermometer	Physitemp	BAT-12 with IT-18 microprobe
Digital camera	Optronics	S97808
Dissecting forceps	Dumont	#5
Dissecting scissors	American Diagnostic Corp.	ADC-3410Q
Imaging microscope	Olympus	BX51WIF
Imaging perfusion chamber	Siskiyou	PC-H
Instant Ocean	Instant Ocean	SS6-25	Maakt 25 gallons per keer
Master-8 pulse stimulator	A.M.P.I.	Master-8
Microdispenser	Drummond Scientific	3-000-752	Verf applicator voor drukskleuring
Microdissection scissors	Moria	15371-92
Minutien pins (0.1 mm)	Fine Science Tools	NC9677548	Voor positionering en stabilisering van het CZS
Motorized microscope platform	Thorlabs	GHB-BX	Gibraltar platform
NeuroPlex imaging software	RedShirtImaging	NeuroPlex	Compatibel met de WuTech fotodiodenarray
Objective lenses	Olympus	XLPLN10XSVMP, XLUMPLFLN20XW, LUMPLFLN40XW, UAPON40XW340
PE-100 polyethylene tubing	VWR	63018-726	Slang voor het maken van zuignaalden
Perfusion pump	Instech	P720 with DBS062SDBSU tube set
Petroleum jelly	Equate	NDC 49035-038-54
Photodiode array with control panel	WuTech Instruments	469-IV fotodiodenarray	Neem contact op met jianwu2nd@gmail.com voor bestelinformatie
RH155	Santa Cruz Biotechnology	sc-499432	Spanningsgevoelige verf
RH482	Univ of Conn. Health Center	JPW-1132	Spanningsgevoelige verf; speciale bestelling bij Leslie Leow
Silicone earplugs	Mack's	Model 7	Te gebruiken voor compressievoorbereiding
Staining PE tubing	VWR	63018-xxx	Verschillende maten afhankelijk van de pasvorm
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Dow Corning	Sylgard 184 silicone elastomer kit
Thorlabs LED and driver	Thorlabs	M735L2-C1, DC2100	LED lamp en driver
Tygon tubing	Fisher Scientific	14-171-xxx
Vibration isolation table	Kinetic Systems	MK26	Veer gebaseerd