Dit protocol biedt methoden voor visualisatie van bacteriële cellen en polysaccharidesyntheselocus (Psl) polysaccharide in het sputum van cystische fibrosepatiënten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Visualisatie van Pseudomonas aeruginosa in het sputum van patiënten met cystische fibrose
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Vroege opsporing en uitroeiing van Pseudomonas aeruginosa in de longen van patiënten met cystische fibrose kan de kans op het ontwikkelen van een chronische infectie verminderen. De ontwikkeling van chronische P. aeruginosa-infecties gaat gepaard met een afname van de longfunctie en verhoogde morbiditeit. Daarom is er een groot belang bij het ophelderen van de redenen voor het niet uitroeien van P. aeruginosa met antibiotische therapie, die voorkomt bij ongeveer 10-40% van de pediatrische patiënten. Een van de vele factoren die van invloed kunnen zijn op de klaring van P. aeruginosa door de gastheer en de gevoeligheid voor antibiotica, zijn variaties in ruimtelijke organisatie (zoals aggregatie of biofilmvorming) en polysaccharideproductie. Daarom waren we geïnteresseerd in het visualiseren van de in situ kenmerken van P. aeruginosa in het sputum van CF-patiënten. Een weefselopruimingstechniek werd toegepast op sputummonsters na het inbedden van de monsters in een hydrogelmatrix om de 3D-structuren ten opzichte van gastheercellen te behouden. Na het opruimen van het weefsel werden fluorescerende labels en kleurstoffen toegevoegd om visualisatie mogelijk te maken. Fluorescentie in situ hybridisatie werd uitgevoerd voor de visualisatie van bacteriële cellen, binding van fluorescerend gelabelde anti-Psl-antilichamen voor de visualisatie van het exopolysaccharide en DAPI-kleuring om gastheercellen te kleuren om structureel inzicht te verkrijgen. Deze methoden maakten het mogelijk om P. aeruginosa met hoge resolutie in het sputum van CF-patiënten te impliceren via confocale laserscanmicroscopie.
Inleiding
In deze studie werden experimenten ontworpen om de in vivo structuur van Pseudomonas aeruginosa in het sputum van pediatrische cystische fibrose (CF) patiënten te visualiseren. P. aeruginosa-infecties worden chronisch bij 30-40% van de pediatrische CF-populatie; Als chronische infecties eenmaal zijn vastgesteld, zijn ze bijna onmogelijk te elimineren1. P. aeruginosa-isolaten van patiënten met een vroege infectie zijn over het algemeen vatbaarder voor antimicrobiële stoffen, daarom worden deze behandeld met antipseudomonale antibiotica om het ontstaan van chronische infectie tevoorkomen2. Helaas....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Goedkeuring van de Research Ethics Board (REB) is vereist om sputummonsters van menselijke proefpersonen te verzamelen en op te slaan. De hierin gepresenteerde studies zijn goedgekeurd door het Hospital for Sick Children REB#1000058579.
1. Sputum-collectie
- Bewaar slijm in een steriele opvangbeker en bewaar onmiddellijk bij 4 °C gedurende maximaal 24 uur voorafgaand aan de fixatie.
OPMERKING: Als u het sputum te lang op 4 °C laat staan zonder fixatie, kan dit leiden tot cellulaire afbraak, met name afbraak van witte bloedcellen. Zo snel mogelijk fixeren heeft de voorkeur. - Breng de sputummonsters over in een steriele bu....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De algemene opzet van het experiment is samengevat in figuur 1 en figuur 2. Figuur 1 geeft een samenvatting van de protocollen voor sputumverwerking en sputumzuivering. Het verwerken en opruimen van sputum kan tot 17 dagen duren. Het protocol kan echter worden gestopt en monsters kunnen worden bewaard na fixatie met PFA (dag 2) of na weefselopruiming (dag 5-17, afhankelijk van de opruimtijd). In figuur 2
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het doel van dit protocol is om een glimp op te vangen van de in-situ organisatie van P. aeruginosa-cellen in sputum van CF-patiënten. Sputummonsters moeten bij 4 °C worden bewaard totdat ze worden verwerkt als ze niet onmiddellijk kunnen worden gefixeerd. Het is aangetoond dat het aantal P. aeruginosa-cellen in sputum niet significant verandert als het wordt verwerkt om 1 uur, 24 uur of 48 uur, wanneer het wordt bewaard bij 4 °C, hoewel het aantal bacteriële cellen aanzienlijk zal toenemen als het gedu.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
De auteurs willen graag de Cystic Fibrosis Foundation bedanken die dit onderzoek financierde en MedImmune voor hun genereuze donatie van anti-Psl0096-antilichamen. Voor deze studie werd beeldvorming uitgevoerd in de CAMiLoD-beeldvormingsfaciliteit van de Universiteit van Toronto.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 29:1 acrylamide bisacrylamide, 30 % solution | BioRad | 161-0146 | |
| 8-Chambered Coverglass Nunc Lab-Tek | ThermoFischer Scientific | 155411 | |
| Anaerogen2.5L | Oxid Inc. | 35108 | |
| Coverwell perfusion chambers | Electron Microscopry Sciences | 70326 -12/-14 | |
| HistoDenz | Sigma | D2158 | |
| Protect RNA Rnase Inhibitor | Sigma | R7387 | |
| PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC | Eurofins | Besteldetails: Product: Gemodificeerd DNA Oligo; Naam: PseaerA; Volgorde: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Synthese: 50 nmol; Zuivering: HPLC; Verzendtoestand: Volledige opbrengst (droog) | |
| Psl0096-Texas Red | Medimmune | De Psl0096-Texas red antilichamen werden vriendelijk ter beschikking gesteld door Medimmune en het bedrijf dient te worden gecontacteerd voor bestellingen. | |
| VA-044 Hardener | Wako | 27776-21-21 |
Referenties
- Banerjee, D., Stableforth, D. The treatment of respiratory pseudomonas infection in cystic fibrosis: What drug and which way. Drugs. 60 (5), 1053-1064 (2000).
- Rosenfeld, M., Ramsey, B. W., Gibson, R. L.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
