Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Visualisatie van Pseudomonas aeruginosa in het sputum van patiënten met cystische fibrose

3.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61631

⸱

16 juli 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Medicine, Hospital for Sick Children, 2Center for Microbial Pathogenesis, Department of Pediatrics, University of Pittsburgh, 3Microbiology, Department of Pediatric Laboratory Medicine, Hospital for Sick Children, 4Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Hospital for Sick Children

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol biedt methoden voor visualisatie van bacteriële cellen en polysaccharidesyntheselocus (Psl) polysaccharide in het sputum van cystische fibrosepatiënten.

Samenvatting

Vroege opsporing en uitroeiing van Pseudomonas aeruginosa in de longen van patiënten met cystische fibrose kan de kans op het ontwikkelen van een chronische infectie verminderen. De ontwikkeling van chronische P. aeruginosa-infecties gaat gepaard met een afname van de longfunctie en verhoogde morbiditeit. Daarom is er een groot belang bij het ophelderen van de redenen voor het niet uitroeien van P. aeruginosa met antibiotische therapie, die voorkomt bij ongeveer 10-40% van de pediatrische patiënten. Een van de vele factoren die van invloed kunnen zijn op de klaring van P. aeruginosa door de gastheer en de gevoeligheid voor antibiotica, zijn variaties in ruimtelijke organisatie (zoals aggregatie of biofilmvorming) en polysaccharideproductie. Daarom waren we geïnteresseerd in het visualiseren van de in situ kenmerken van P. aeruginosa in het sputum van CF-patiënten. Een weefselopruimingstechniek werd toegepast op sputummonsters na het inbedden van de monsters in een hydrogelmatrix om de 3D-structuren ten opzichte van gastheercellen te behouden. Na het opruimen van het weefsel werden fluorescerende labels en kleurstoffen toegevoegd om visualisatie mogelijk te maken. Fluorescentie in situ hybridisatie werd uitgevoerd voor de visualisatie van bacteriële cellen, binding van fluorescerend gelabelde anti-Psl-antilichamen voor de visualisatie van het exopolysaccharide en DAPI-kleuring om gastheercellen te kleuren om structureel inzicht te verkrijgen. Deze methoden maakten het mogelijk om P. aeruginosa met hoge resolutie in het sputum van CF-patiënten te impliceren via confocale laserscanmicroscopie.

Inleiding

In deze studie werden experimenten ontworpen om de in vivo structuur van Pseudomonas aeruginosa in het sputum van pediatrische cystische fibrose (CF) patiënten te visualiseren. P. aeruginosa-infecties worden chronisch bij 30-40% van de pediatrische CF-populatie; Als chronische infecties eenmaal zijn vastgesteld, zijn ze bijna onmogelijk te elimineren1. P. aeruginosa-isolaten van patiënten met een vroege infectie zijn over het algemeen vatbaarder voor antimicrobiële stoffen, daarom worden deze behandeld met antipseudomonale antibiotica om het ontstaan van chronische infectie tevoorkomen2. Helaas worden niet alle P. aeruginosa-isolaten effectief uit de longen verwijderd na antibioticatherapie. De precieze mechanismen die verband houden met antibioticafalen zijn niet volledig opgehelderd. Eerdere studies hebben aangetoond dat variaties in de dichtheid, aggregatie en productie van polysachariden van biofilmcellen de werkzaamheid van antibiotica kunnen beïnvloeden3. P. aeruginosa produceert drie extracellulaire polysachariden: Pel, Psl en alginaat4. De meeste stammen van P. aeruginosa hebben de genetische capaciteit om elk van de exopolysachariden tot expressie te brengen, hoewel vaak één type polysacharide overwegend tot expressie wordt gebracht5. Het exopolysacharide alginaat wordt in verband gebracht met chronische infecties in de CF-long, wat resulteert in een mucoïde fenotype 6,7. De polysachariden Pel en Psl hebben meerdere functies, waaronder het helpen bij de initiële hechting en het behoud van de biofilmstructuur, en het verlenen van antibioticaresistentie8.

Methoden gericht op het visualiseren van in vivo structuren van weefsels zijn ontwikkeld voor een verscheidenheid aan monstertypes 9,10,11. Meer recentelijk zijn ze op maat gemaakt om in vivo microbiële gemeenschappen in sputum van CF-patiënten te visualiseren12. De optimalisatie van een weefselopruimingsprotocol specifiek voor de identificatie van microbiële gemeenschappen in sputum is ontwikkeld door DePas et al., 201612. De term MiPACT, wat staat voor microbial identification after Passive CLARITY technique, werd bedacht voor het opruimen van CF-sputum11,12. Voor weefselopruimingstechnieken worden de monsters eerst gefixeerd en vervolgens transparant gemaakt, terwijl hun inherente architectuur intact blijft voor kleuring en microscopische visualisatie11. Door CF-sputummonsters te fixeren en op te ruimen, kunnen onderzoekers vragen beantwoorden met betrekking tot biofilmstructuur, bacteriële celdichtheid, polymicrobiële associaties en associaties tussen ziekteverwekkers en gastheercellen. Het voordeel van het direct onderzoeken van bacteriën die in het sputum bewaard zijn gebleven, is dat ze kunnen worden geanalyseerd en gevisualiseerd in een gastheerspecifieke context. Hoewel in vitro groei van klinische isolaten in het laboratorium voor experimenten zeer informatief kan zijn, zijn dergelijke methoden niet in staat om de CF-longomgeving volledig na te bootsen, wat resulteert in een discrepantie tussen laboratoriumresultaten en patiëntresultaten.

De hier gepresenteerde methoden kunnen worden gebruikt om sputum te fixeren en te verwijderen om bacteriën te visualiseren, of het nu gaat om CF-patiënten of patiënten met andere luchtweginfecties. Het specifieke type kleuring en microscopische analyse dat hierin wordt beschreven, is fluorescentie in situ hybridisatie (FISH), gevolgd door anti-Psl-antilichaambinding in de hydrogel en daaropvolgende analyse via confocale laserscanningmicroscopie (CLSM). Na weefselopruiming kunnen ook andere immunohistochemie en microscopiemethoden worden toegepast.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Goedkeuring van de Research Ethics Board (REB) is vereist om sputummonsters van menselijke proefpersonen te verzamelen en op te slaan. De hierin gepresenteerde studies zijn goedgekeurd door het Hospital for Sick Children REB#1000058579.

1. Sputum-collectie

  1. Bewaar slijm in een steriele opvangbeker en bewaar onmiddellijk bij 4 °C gedurende maximaal 24 uur voorafgaand aan de fixatie.
    OPMERKING: Als u het sputum te lang op 4 °C laat staan zonder fixatie, kan dit leiden tot cellulaire afbraak, met name afbraak van witte bloedcellen. Zo snel mogelijk fixeren heeft de voorkeur.
  2. Breng de sputummonsters over in een steriele buis van 15 ml.
  3. Voeg een gelijk volume van 4% paraformaldehyde (PFA) toe aan de sputummonsters. Als het sputummonster bijvoorbeeld 0,5 ml is, voeg dan 0,5 ml 4% PFA toe. Meng door zachte inversie.
  4. Incubeer het sputum een nacht bij 4 °C.
  5. Was het monster door 5 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe te voegen aan elke 2 ml vast sputum.
    NOTITIE: Er is geen centrifugeren nodig voor deze wasstap.
  6. Verwijder het supernatans voorzichtig met een pipet.
    NOTITIE: Vermijd het opzuigen van het sputum met de pipet door de punt van het sputum af te richten en zeer langzaam de oppervlaktevloeistof op te zuigen. De wasstap omvat geen centrifugeren om de structurele integriteit van de sputumpluggen niet te verstoren.
  7. Herhaal stap 1.6-1.7 nog twee keer.
  8. Resuspendeer de pellet in 2x het volume PBS met 0,01 % (m/v) natriumazide.
  9. Bewaar het sputum bij 4 °C.

2. MiPACT (tissue clearing technique) verwerking van sputum

  1. Ontgas de hydrogelcomponenten (30% 29:1 acrylamide:bis-acrylamide, verharder en PBS) in een afgesloten container met een anaërobe verpakking voorafgaand gedurende 72 uur.
    NOTITIE: De anaërobe verpakking en de verzegelde container zijn nodig omdat zuurstof de polymerisatie van acrylamide remt. Als alternatief kan zuurstof worden verwijderd door deze stap uit te voeren in een anaërobe kap, door een vacuüm toe te passen op een afgesloten container of doorN2-gas door het acrylamidemengsel te laten borrelen.
    1. Voeg 2 ml van een 30% 29:1 acrylamide:bis-acrylamide-oplossing toe aan een tube van 15 ml met de dop eraf in de afgesloten anaërobe container.
    2. Maak een geconcentreerde bouillon van 10% (m/v) verharder door 0,5 g verharder toe te voegen aan 5 ml PBS in een tube van 15 ml. Laat de dop van de tube en bewaar in de afgesloten anaërobe container.
    3. Laat een paar ml steriele PBS in een buisje, met de dop eraf, in de anaërobe container.
  2. Maak 5 ml hydrogeloplossing met een eindconcentratie van 0,2% verharder en 4% 29:1 acrylamide:bis-acrylamide in PBS in een tube van 15 ml. Meng door inversie en filter steriliseren.
  3. Haal sputummonsters uit de koelkast en snijd ze vervolgens onder steriele omstandigheden met een scalpel in kleine secties (ongeveer 5 mm in diameter).
    OPMERKING: Als het sputum vrij vloeibaar is, kan deze stap nog steeds worden uitgevoerd, maar het vergt meer geduld en oefening om het sputum met een pincet uit de bewaaroplossing te verwijderen voordat u het scalpel gebruikt om de gewenste fracties te scheiden.
  4. Plaats de gesneden sputummonsters in een putje van een dekglaasje met 8 kamers.
  5. Voeg 300 μL filter gesteriliseerde hydrogeloplossing uit stap 2.2 toe aan elk van de putjes die sputum bevatten.
  6. Plaats het afdekglas met 8 kamers gedurende 3 uur bij 37 °C in een afgesloten container met een anaërobe verpakking.
    OPMERKING: Eenmaal gepolymeriseerd, moet de hydrogel met ingebed sputum de consistentie van stevige gel hebben.
  7. Breng de gestolde hydrogel-sputummonsters over in een kweekbuis van 15 ml met 5 ml 8% natriumdodecylsulfaat (SDS), pH 8, en laat de monsters 3-14 dagen klaren bij 37 °C (met of zonder schudden), totdat het sputum transparant wordt.
    OPMERKING: De opruimingstijden zijn afhankelijk van de samenstelling van het sputum en kunnen over het algemeen worden verkort door te schudden. Zorg er echter voor dat u de schudsnelheid niet zodanig verhoogt dat de integriteit van het monster wordt verstoord. Meer DNA-rijke monsters hebben meer tijd nodig om te wissen in vergelijking met slijmrijke monsters.
  8. Doe de 8% SDS-oplossing in een afvalcontainer. Breng met een steriel pincet elk in hydrogel ingebed monster over in een steriele conische buis van 50 ml. Voeg 10 ml PBS toe aan elk van de conische buizen van 50 ml om de hydrogels te wassen en laat de oplossing 30 minuten tot 1 uur intrekken voordat u het decanteert. Herhaal dit nog 2x meer.
    NOTITIE: Bij deze wasstap wordt niet gecentrifugeerd. Overtollig vocht en supernatans worden voorzichtig verwijderd met een pipet.
  9. Bewaar gewassen monsters in PBS met 0,01% (m/v) natriumazide en 1x RNaseremmer bij 4 °C.

3. Hydrogel fluorescerende in situ hybridisatie (FISH) protocol

  1. Haal de hydrogelmonsters met een steriel pincet uit hun bewaaroplossing en plaats de monsters op een steriel oppervlak (zoals een glasplaatje of petrischaal).
  2. Snijd de hydrogels met een steriel scalpel in plakjes van ~ 1 mm dik.
  3. Plaats de stukjes hydrogel van 1 mm in steriele buisjes van 1,5 ml.
  4. Bereid 1 ml de hybridisatiebuffer (25% formamide, 0,9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl [pH 7,6], 0,01% SDS, gezuiverd en gedeïoniseerd H2O) in een buisje van 1,5 ml.
  5. Voeg de fluorescerend gelabelde PseaerA-sonde (150,7 nM12) toe aan de hybridisatiebuffer en meng door inversie.
    NOTITIE: Formaline-oplossing moet uit de buurt van open vuur worden gehouden. De hybridisatiebuffer kan vooraf worden bereid en in aliquots bij -20 °C13 worden opgeslagen.
  6. Voeg 200-500 μL hybridisatiebuffer toe aan elk stuk hydrogel van ~1 mm en zorg ervoor dat het hele hydrogelmonster wordt ondergedompeld.
  7. Laat de PseaerA-sonde hybridiseren met de hydrogelmonsters door ze ~ 18-24 uur in het donker te plaatsen, bij 46 °C, zonder te schudden.
  8. Decanteer de hybridisatiebuffer in een afvalcontainer.
  9. Spoel de monsters eenmaal af met een gesteriliseerde wasbuffer met filter (337,5 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA (ethyleendiaminetetra-azijnzuur) [pH 7,2], 0,01% SDS en gezuiverde en gedeïoniseerde H2O) door 1 ml wasbuffer toe te voegen aan elk van de 1,5 ml buizen en deze vervolgens te verwijderen.
    NOTITIE: De wasbuffer kan van tevoren worden gemaakt en bij kamertemperatuur (RT) worden bewaard.
  10. Voeg 1 ml verse wasbuffer toe aan de buizen en incubeer de monsters vervolgens gedurende 6 uur in het donker bij 48 °C, zonder te schudden.

4. Hydrogel en Psl0096-antilichaambinding

  1. Verwijder de wasbuffer steriel met een pipettor van 1 ml.
  2. Spoel de monsters met een 2% BSA (w/v) in PBS-oplossing door 1 ml van de 2% BSA-oplossing toe te voegen en te verwijderen.
  3. Voeg 500 μL van de 2% BSA/PBS-oplossing toe aan de hydrogelmonsters om niet-specifieke eiwitbinding te blokkeren. Incubeer de monsters vervolgens 's nachts, in het donker, bij RT, zonder te schudden.
  4. Verwijder de blokkerende oplossing steriel met behulp van een pipet van 1 ml.
  5. Bereid de Psl0096-Texas Red-antilichaamoplossing voor door het antilichaam te verdunnen tot een eindconcentratie van 0,112 μg/ml in 500 μL verse 2% BSA/PBS.
  6. Voeg de 500 μL antilichaamoplossing toe aan de hydrogelmonsters en incubeer ze gedurende 6 uur bij RT, beschermd tegen licht, zonder te schudden.

5. DAPI (4′,6′-diamidino-2-fenylindol) kleuring

  1. Bereid de brekingsindex-matchingoplossing (RIMS) door 40 g niet-ionisch dichtheidsgradiëntmedium, 30 μl Tween20, 3 μg natriumazide en 30 ml PBS toe te voegen aan een kolf met een magnetische roerstaaf. Roer de oplossing gedurende 15 minuten op een magnetische roerder, of tot het volledig is opgelost.
  2. Filter steriliseer de oplossing in een conische buis van 50 ml met behulp van een spuit van 10 ml en een steriel filter van 0,2 μm.
    OPMERKING: De oplossing kan enkele maanden bij 4 °C worden bewaard.
  3. Verwijder de Psl0096-Texas Red-antilichaamoplossing met een steriele pipet van 1 ml.
  4. Spoel de hydrogelmonsters af door 1 ml PBS toe te voegen en vervolgens te verwijderen.
  5. Incubeer de hydrogelmonsters met 250 μL RIMS-oplossing en 10 μg/ml DAPI bij RT met zacht schudden, in het donker, gedurende een nacht.
  6. Voorafgaand aan confocale beeldvorming monteert u de monsters op perfusiekamers van 0,9 mm of 1,7 mm en sluit u ze af met een glazen dekglaasje.
    OPMERKING: Na FISH en/of immunohistochemie en vóór onderdompeling in RIMS kunnen fluorescerende lectinekleuringen worden aangebracht als visualisatie van sputumslijm gewenst is12.

6. Beeldvorming

  1. Voer confocale laserscanmicroscopiebeeldvorming uit met behulp van standaardtechnieken bij vergrotingen van 25x, 40x, 63x of 100x.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De algemene opzet van het experiment is samengevat in figuur 1 en figuur 2. Figuur 1 geeft een samenvatting van de protocollen voor sputumverwerking en sputumzuivering. Het verwerken en opruimen van sputum kan tot 17 dagen duren. Het protocol kan echter worden gestopt en monsters kunnen worden bewaard na fixatie met PFA (dag 2) of na weefselopruiming (dag 5-17, afhankelijk van de opruimtijd). In figuur 2

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het doel van dit protocol is om een glimp op te vangen van de in-situ organisatie van P. aeruginosa-cellen in sputum van CF-patiënten. Sputummonsters moeten bij 4 °C worden bewaard totdat ze worden verwerkt als ze niet onmiddellijk kunnen worden gefixeerd. Het is aangetoond dat het aantal P. aeruginosa-cellen in sputum niet significant verandert als het wordt verwerkt om 1 uur, 24 uur of 48 uur, wanneer het wordt bewaard bij 4 °C, hoewel het aantal bacteriële cellen aanzienlijk zal toenemen als het gedu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Dankbetuigingen

De auteurs willen graag de Cystic Fibrosis Foundation bedanken die dit onderzoek financierde en MedImmune voor hun genereuze donatie van anti-Psl0096-antilichamen. Voor deze studie werd beeldvorming uitgevoerd in de CAMiLoD-beeldvormingsfaciliteit van de Universiteit van Toronto.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
29:1 acrylamide bisacrylamide, 30 % solutionBioRad161-0146
8-Chambered Coverglass Nunc Lab-TekThermoFischer Scientific155411
Anaerogen2.5LOxid Inc.35108
Coverwell perfusion chambersElectron Microscopry Sciences70326 -12/-14
HistoDenzSigmaD2158
Protect RNA Rnase InhibitorSigmaR7387
PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGCEurofinsBesteldetails: Product: Gemodificeerd DNA Oligo; Naam: PseaerA; Volgorde: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Synthese: 50 nmol; Zuivering: HPLC; Verzendtoestand: Volledige opbrengst (droog)
Psl0096-Texas RedMedimmuneDe Psl0096-Texas red antilichamen werden vriendelijk ter beschikking gesteld door Medimmune en het bedrijf dient te worden gecontacteerd voor bestellingen.
VA-044 HardenerWako27776-21-21

Referenties

  1. Banerjee, D., Stableforth, D. The treatment of respiratory pseudomonas infection in cystic fibrosis: What drug and which way. Drugs. 60 (5), 1053-1064 (2000).
  2. Rosenfeld, M., Ramsey, B. W., Gibson, R. L. Pseudomonas acquisition in young patients with cystic fibrosis: Pathophysiology, diagnosis, and management. Current Opinion in Pulmonary Medicine. 9 (6), 492-497 (2003).
  3. Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. Tolerance and Resistance of Pseudomonas aeruginosa Biofilms to Antimicrobial Agents-How P. aeruginosa Can Escape Antibiotics. Frontiers in Microbiology. 10, 913(2019).
  4. Billings, N., et al. The Extracellular Matrix Component Psl Provides Fast-Acting Antibiotic Defense in Pseudomonas aeruginosa Biofilms. PLoS Pathogens. 9 (8), 1003526(2013).
  5. Franklin, M. J., Nivens, D. E., Weadge, J. T., Lynne Howell, P. Biosynthesis of the Pseudomonas aeruginosa extracellular polysaccharides, alginate, Pel, and Psl. Frontiers in Microbiology. 2, 167(2011).
  6. Yang, L., et al. Polysaccharides serve as scaffold of biofilms formed by mucoid Pseudomonas aeruginosa. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 366-376 (2012).
  7. Wozniak, D. J., et al. Alginate is not a significant component of the extracellular polysaccharide matrix of PA14 and PAO1 Pseudomonas aeruginosa biofilms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7907-7912 (2003).
  8. Baker, P., et al. Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Science Advances. 2 (5), 1-9 (2016).
  9. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  10. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  11. Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).
  12. DePas, W. H., et al. Exposing the three-dimensional biogeography and metabolic states of pathogens in cystic fibrosis sputum via hydrogel embedding, clearing, and rRNA labeling. mBio. 7 (5), 1-11 (2016).
  13. Molecular Instruments HCR v3.0 protocol for bacteria in suspension. , Available from: www.molecularinstruments.com 1-6 (2019).
  14. Murray, M. P., Doherty, C. J., Govan, J. R. W., Hill, A. T. Do processing time and storage of sputum influence quantitative bacteriology in bronchiectasis. Journal of Medical Microbiology. 59 (7), 829-833 (2010).
  15. Efthimiadis, A., Jayaram, L., Weston, S., Carruthers, S., Hargreave, F. E. Induced sputum: Time from expectoration to processing. European Respiratory Journal. 19 (4), 706-708 (2002).
  16. Chao, Y., Zhang, T. Optimization of fixation methods for observation of bacterial cell morphology and surface ultrastructures by atomic force microscopy. Applied Microbiology and Biotechnology. 92 (2), 381-392 (2011).
  17. St-Laurent, J., Boulay, M. E., Prince, P., Bissonnette, E., Boulet, L. P. Comparison of cell fixation methods of induced sputum specimens: An immunocytochemical analysis. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 36-42 (2006).
  18. Hogardt, M., et al. Specific and rapid detection by fluorescent situ hybridization of bacteria in clinical samples obtained from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. 38 (2), 818-825 (2000).
  19. Hoffmann, N., et al. Erratum: Novel mouse model of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection mimicking cystic fibrosis. Infection and Immunity. 73 (8), 5290(2005).
  20. Nair, B., et al. Utility of Gram staining for evaluation of the quality of cystic fibrosis sputum samples. Journal of Clinical Microbiology. 40 (8), 2791-2794 (2002).
  21. Howlin, R. P., et al. Low-Dose Nitric Oxide as Targeted Anti-biofilm Adjunctive Therapy to Treat Chronic Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis. Molecular Therapy. 25 (9), 2104-2116 (2017).
  22. Pestrak, M. J., et al. Treatment with the Pseudomonas aeruginosa glycoside hydrolase PslG combats wound infection by improving antibiotic efficacy and host innate immune activity. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (6), 00234(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Sputum bij cystische fibroseweefselverhelderingfluorescentie in situ hybridisatieconfocale laser scanning microscopieexopolysacharide Pslinbedding in hydrogelantilichaamkleuringDAPI kleuringruimtelijke organisatie
Visualisatie van Pseudomonas aeruginosa in het sputum van patiënten met cystische fibrose
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.