Methodenartikel

Een bioinformaticapijplijn voor het onderzoeken van moleculaire evolutie en genexpressie met behulp van RNA-seq

DOI:

10.3791/61633

⸱

28 mei 2021

 , 
1Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van dit protocol is om de evolutie en expressie van kandidaatgenen te onderzoeken met behulp van RNA-sequencinggegevens.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het distilleren en rapporteren van grote datasets, zoals hele genoom- of transcriptoomgegevens, is vaak een ontmoedigende taak. Een manier om resultaten op te splitsen is door je te concentreren op een of meer genfamilies die belangrijk zijn voor het organisme en de studie. In dit protocol schetsen we bioinformatische stappen om een fylogenie te genereren en de expressie van interessegenen te kwantificeren. Fylogenetische bomen kunnen inzicht geven in hoe genen zich ontwikkelen binnen en tussen soorten en orthologie onthullen. Deze resultaten kunnen worden verbeterd met behulp van RNA-seq-gegevens om de expressie van deze genen in verschillende individuen of weefsels te vergelijken. Studies van moleculaire evolutie en expressie kunnen modi van evolutie en behoud van genfunctie tussen soorten onthullen. De karakterisering van een genfamilie kan dienen als springplank voor toekomstige studies en kan een belangrijke genfamilie benadrukken in een nieuw genoom of transcriptoompapier.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vooruitgang in sequencingtechnologieën heeft de sequencing van genomen en transcriptomen van niet-modelorganismen vergemakkelijkt. Naast de toegenomen haalbaarheid van het sequentiëren van DNA en RNA van veel organismen, is een overvloed aan gegevens openbaar beschikbaar om genen van belang te bestuderen. Het doel van dit protocol is om bio-informatische stappen te bieden om de moleculaire evolutie en expressie van genen te onderzoeken die een belangrijke rol kunnen spelen in het organisme van belang.

Het onderzoeken van de evolutie van een gen of genenfamilie kan inzicht geven in de evolutie van biologische systemen. Leden van een genfamilie worden meestal bepaald door het identificeren van geconserveerde motieven of homologe gensequenties. Genfamilie-evolutie werd eerder onderzocht met behulp van genomen van verre verwante modelorganismen1. Een beperking van deze benadering is dat het niet duidelijk is hoe deze genfamilies evolueren in nauw verwante soorten en de rol van verschillende selectieve omgevingsdruk. In dit protocol nemen we een zoektocht op naar homologen bij nauw verwante soorten. Door een fylogenie op fylumniveau te genereren, kunnen we trends in de evolutie van genfamilies opmerken, zoals die van geconserveerde genen of afstammingsspecifieke duplicaties. Op dit niveau kunnen we ook onderzoeken of genen orthesen of paralogen zijn. Hoewel veel homologen waarschijnlijk op dezelfde manier met elkaar functioneren, is dat niet noodzakelijk het geval2. Het opnemen van fylogenetische bomen in deze studies is belangrijk om op te lossen of deze homologe genen orthesen zijn of niet. Bij eukaryoten behouden veel ortheologen vergelijkbare functies in de cel, zoals blijkt uit het vermogen van zoogdiereiwitten om de functie van gistortheologen te herstellen3. Er zijn echter gevallen waarin een niet-orthologisch gen een gekarakteriseerde functie vervult4.

Fylogenetische bomen beginnen relaties tussen genen en soorten af te bakenen, maar de functie kan niet alleen worden toegewezen op basis van genetische relaties. Genexpressiestudies in combinatie met functionele annotaties en verrijkingsanalyse bieden een sterke ondersteuning voor de genfunctie. Gevallen waarin genexpressie kan worden gekwantificeerd en vergeleken tussen individuen of weefseltypen kunnen meer vertellen over de potentiële functie. Het volgende protocol volgt methoden die worden gebruikt bij het onderzoeken van opsinegenen in Hydra vulgaris7, maar ze kunnen worden toegepast op elke soort en elke genfamilie. De resultaten van dergelijke studies vormen een basis voor verder onderzoek naar genfunctie en gennetwerken in niet-modelorganismen. Het onderzoek naar de fylogenie van opsines, eiwitten die de fototransductiecascade initiëren, geeft bijvoorbeeld context aan de evolutie van ogen en lichtdetectie8,9,10,11. In dit geval kunnen niet-modelorganismen, met name basale diersoorten zoals cnidarianen of ctenoforen, de instandhouding of veranderingen in de fototransductiecascade en het gezichtsvermogen over de clades12,13,14verduidelijken . Evenzo zal het bepalen van de fylogenie, expressie en netwerken van andere genfamilies ons informeren over de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan aanpassingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol volgt de richtlijnen voor dierverzorging van UC Irvine.

1. RNA-seq bibliotheekvoorbereiding

  1. Isoleer RNA op de volgende manieren.
    1. Verzamel monsters. Als RNA op een later tijdstip moet worden geëxtraheerd, moet het monster in de flits worden gevriesdroogd of in RNA-opslagoplossing worden gebracht15 (Tabel met materialen).
    2. Euthanaseer en ontleed het organisme om weefsels van belang te scheiden.
    3. Extraheer totaal RNA met behulp van een extractiekit en zuiver het RNA met behulp van een RNA-zuiveringskit (Tabel van materialen)
      OPMERKING: Er zijn protocollen en kits die beter kunnen werken voor verschillende soorten en weefseltypen16,17. We hebben RNA geëxtraheerd uit verschillende lichaamsweefsels van een vlinder18 en een gelatineachtige Hydra19 (zie discussie).
    4. Meet de concentratie en kwaliteit van het RNA van elk monster (Tabel van materialen). Gebruik samples met RNA-integriteitsnummers (RIN) hoger dan 8, idealiter dichter bij 920 om cDNA-bibliotheken te bouwen.
  2. Construeren cDNA-bibliotheek en -volgorde als volgt.
    1. Bouw cDNA-bibliotheken volgens de handleiding voor bibliotheekvoorbereiding (zie discussie).
    2. Bepaal de cDNA-concentratie en -kwaliteit (Tabel van materialen).
    3. Multiplex de bibliotheken en volg ze.

2. Toegang tot een computercluster

OPMERKING: RNA-seq-analyse vereist manipulatie van grote bestanden en kan het beste worden uitgevoerd op een computercluster (Tabel met materialen).

  1. Meld u aan bij het computerclusteraccount met behulp van de opdracht ssh username@clusterlocation op een terminal (Mac) of PuTTY (Windows) toepassingsvenster.

3. Verkrijg RNA-seq leest

  1. RNA-seq-leespunten verkrijgen van de sequencingfaciliteit of, voor gegevens die in een publicatie zijn gegenereerd, uit de gegevensopslagplaats waar deze is gedeponeerd (3.2 of 3.3).
  2. Ga als volgt te werk om gegevens te downloaden uit opslagplaatsen zoals ArrayExpress:
    1. Doorzoek de site met behulp van het toetredingsnummer.
    2. Zoek de koppeling om de gegevens te downloaden en klik met de linkermuisknop en selecteer Koppeling kopiëren.
    3. Typ in het terminalvenster de koppeling wget en selecteer Plakken om de gegevens naar de map te kopiëren voor analyse.
  3. Volg deze alternatieve stappen om NCBI Short Read Archive (SRA)-gegevens te downloaden:
    1. Download op de terminal SRA Toolkit v. 2.8.1 met wget.
      OPMERKING: Voor het downloaden en installeren van programma's naar het computercluster is mogelijk roottoegang vereist, neem contact op met de beheerder van het computercluster als de installatie mislukt.
    2. Voltooi de installatie van het programma door tar -xvf $TARGZFILE tetypen.
    3. Zoek NCBI naar het SRA-toetredingsnummer voor de monsters die u wilt downloaden, het moet de indeling SRRXXXXXX hebben.
    4. Verkrijg de RNA-seq-gegevens door [sratoolkitlocatie]/bin/prefetch SRRXXXXXX in het terminalvenster te typen.
    5. Voor paired-end bestanden type [sratoolkit locatie]/bin/fastq-dump --split-files SRRXXXXXX om twee fastq bestanden te krijgen (SRRXXXXXX_1.FASTQ en SRRXXXXXX_2.FASTQ).
      OPMERKING: Gebruik voor een Trinity de novo-assemblage de opdracht [sratoolkit-locatie]/bin/fastq-dump --defline-seq '@$sn[_$rn]/$ri' --split-files SRRXXXXXX

4. Trimadapters en leesbare leesten van lage kwaliteit (optioneel)

  1. Installeer of laad Trimmomatic21 v. 0.35 op het computercluster.
  2. Typ in de map waar de RNA-seq-gegevensbestanden zich bevinden een opdracht met de locatie van het trimmomatische jar-bestand, de INVOER FASTQ-bestanden, uitvoer FASTQ-bestanden en optionele parameters zoals leeslengte en kwaliteit.
    OPMERKING: De opdracht varieert door de onbewerkte en gewenste kwaliteit en lengte van de leess. Voor Illumina 43 bp leest met Nextera primers, gebruikten we: java -jar /data/apps/trimmomatic/0.35/trimmomatic-0.35.jar PE $READ 1. FASTQ $READ 2. FASTQ paired_READ1. FASTQ unpaired_READ1. FASTQ paired_READ2. FASTQ unpaired_READ2. FASTQ ILLUMINACLIP:adapters.fa:2:30:10 LEIDEN:20 TRAILING:20 SLIDINGWINDOW:4:17 MINLEN:30.

5. Vraag referentieassemblage aan

  1. Zoek in Google, EnsemblGenomes en NCBI Genomes en Nucleotide TSA (Transcriptome Shotgun Assembly) naar een referentiegenoom of geassembleerd transcriptoom voor de soort van belang (Figuur 1).
    OPMERKING: Als een referentiegenoom of transcriptoom niet beschikbaar of van lage kwaliteit is, gaat u verder met STAP 6 om een de novo assemblage te genereren.
  2. Als er een referentiegenoom of geassembleerd transcriptoom bestaat, downloadt u het als een fasta-bestand naar waar de analyse zal worden uitgevoerd volgens de onderstaande stappen.
    1. Zoek de link om het genoom te downloaden, klik met de linkermuisknop en kopieer de koppeling.
    2. Typ in het terminalvenster wget en plak het koppelingsadres. Kopieer indien beschikbaar ook het GTF-bestand en het proteïne FASTA-bestand voor het referentiegenoom.

6. Genereer een de novo montage (alternatief voor stap 5)

  1. Combineer de RNA-seq READ1 en READ2 fastq bestanden voor alle samples door cat *READ1 te typen. FASTQ > $all_READ1. FASTQ en kat *READ2. FASTQ > all_READ2. FASTQ op het terminalvenster.
  2. Installeer of laad Trinity22 v.2.8.5 op het computercluster.
  3. Genereren en assembleren door op de terminal te typen: Trinity --seqType fq --max_memory 20G --left $all_READ1. FASTQ --rechts $all_READ2. FASTQ.

7. Kaart leest naar het genoom (7.1) of de novo transcriptoom (7.2)

  1. Kaart leest naar het referentiegenoom met BEHULP VAN STAR23 v. 2.6.0c en RSEM24 v. 1.3.0.
    1. Installeer of laad STAR v. 2.6.0c. en RSEM v. 1.3.0 aan het computercluster.
    2. Indexeer het genoom door rsem-prepare-reference --gtf $GENOME te typen. GTF --ster -p 16 $GENOME. FASTA $OUTPUT.
    3. Kaart leest en berekent expressie voor elk monster door rsem-calculate-expression -p 16 --star --paired-end $READ 1 te typen. FASTQ $READ 2. FASTQ $INDEX $OUTPUT.
    4. Wijzig de naam van het resultatenbestand in iets beschrijvend met behulp van mv RSEM.genes.results $sample.genes.results.
    5. Genereer een matrix van alle tellingen door rsem-generate-data-matrix *[genes/isoforms.results] > $OUTPUTte typen.
  2. Breng RNA-seq in kaart met de Trinity de novo assemblage met RSEM en bowtie.
    1. Trinity22 v.2.8.5, Bowtie25 v. 1.0.0 en RSEM v. 1.3.0 installeren of laden.
    2. Kaart leest en berekent expressie voor elk voorbeeld door [trinity_location]/align_and_estimate_abundance.pl --prep-reference --transcripts $TRINITY te typen. FASTA --seqType fq --links $READ 1. FASTQ --rechts $READ 2. FASTQ --est_method RSEM --aln_method strik --trinity_mode --output_dir $OUTPUT.
    3. Wijzig de naam van het resultatenbestand in iets beschrijvend met behulp van mv RSEM.genes.results $sample.genes.results.
    4. Genereer een matrix van alle tellingen door [trinity_location]/abundance_estimates_to_matrix.pl --est_method RSEM *[genen/isovormen].resultaten

8. Identificeer genen van belang

OPMERKING: De volgende stappen kunnen worden uitgevoerd met nucleotide- of eiwit FASTA-bestanden, maar werken het beste en zijn eenvoudiger met eiwitsequenties. BLAST-zoekopdrachten met behulp van eiwitten naar eiwitten geven eerder resultaten bij het zoeken tussen verschillende soorten.

  1. Gebruik voor een referentiegenoom het eiwit FASTA-bestand uit STAP 5.2.2 of zie Aanvullende materialen om een aangepaste genfunctie GTF te genereren.
  2. Voor een de novo transcriptoom, genereer een eiwit FASTA met behulp van TransDecoder.
    1. Installeer of laad TransDecoder v. 5.5.0 op de computercluser.
    2. Zoek het langste open leesframe en voorspelde peptidesequentie door [Transdecoder-locatie]/TransDecoder.LongOrfs -t $TRINITY te typen. FASTA.
  3. Zoek in NCBI Genbank naar homologen bij nauw verwante soorten.
    1. Open een internetbrowservenster en ga naar https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/.
    2. Typ op de zoekbalk de naam van het betrokken gen en de naam van nauw verwante soorten die zijn gesequenced of geslacht of fylum. Selecteer aan de linkerkant van de zoekbalk eiwit en klik vervolgens op zoeken.
    3. Pak reeksen uit door op Verzenden naar te klikken en selecteer vervolgens Bestand. Selecteer FASTA onder Opmaak en klik vervolgens op Bestand maken.
    4. Verplaats FASTA-bestand met homologs naar het computercluster door scp$$FASTA username@clusterlocation:/$DIR in een lokaal terminalvenster te typen of FileZilla te gebruiken om bestanden van en naar computer en cluster over te zetten.
  4. Zoek naar kandidaatgenen met BLAST+26.
    1. Installeer of laad BLAST+ v. 2.8.1 op het computercluster.
    2. Maak op het computercluster een BLAST-database van het genoom of transcriptoom vertaalde eiwit FASTA door [BLAST+ locatie]/makeblastdb -in $PEP te typen. FASTA -dbtype prot -out $OUTPUT
    3. BLAST de homologe gensequenties van NCBI naar de database van de soorten van belang door [BLAST+ location]/blastp -db $DATABASE -query $FASTA -evalue 1e-10 -outfmt 6 -max_target_seqs 1 -out $OUTPUTte typen .
    4. Bekijk het uitvoerbestand met de opdracht meer. Kopieer unieke gen-ID's van de interessesoort naar een nieuw tekstbestand.
    5. Extraheer de sequenties van kandidaatgenen door perl -ne 'if(/^>(\S+)/){$c=$i{$1}}$c?print:chomp;$i{$_}=1 if @ARGV' $gene_id.txt $PEP te typen. FASTA > $OUTPUT.
  5. Bevestig genannotatie met behulp van wederkerige BLAST.
    1. Ga in de internetbrowser naar https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.
    2. Selecteer tblastn, plak vervolgens de kandidaatsequenties, selecteer de database niet-redundante eiwitsequentie en klik op BLAST.
  6. Identificeer extra genen door alle genen in het genoom of transcriptoom te annoteren met genontologie (GO) termen (zie discussie).
    1. Breng het eiwit FASTA over naar de lokale computer.
    2. Download en installeer Blast2GO27,28,29 v. 5.2 op de lokale computer.
    3. Open Blast2GO, klik op Bestand, ga naar Laden, ga naar Laad reeksen, klik op Fasta-bestand laden (fasta). Selecteer het FASTA-bestand en klik op Laden.
    4. Klik op Blast, kies NCBI Blasten klik op Volgende. Bewerk parameters of klik op Volgende, bewerk parameters en klik op Uitvoeren om de meest vergelijkbare genbeschrijving te vinden.
    5. Klik op toewijzing en klik vervolgens op Uitvoeren om genontologie-annotaties te zoeken naar vergelijkbare eiwitten.
    6. Klik vervolgens op interpro, selecteer EMBL-EBI InterProen klik op Volgende. Bewerk parameters of klik op Volgendeen klik op Uitvoeren om te zoeken naar handtekeningen van bekende genfamilies en domeinen.
    7. Exporteer de aantekeningen door op Bestandte klikken , selecteer Exporteren, klik op Tabel exporteren. Klik op Bladeren, geef het bestand een naam, klik op Opslaan, klik op Exporteren.
    8. Zoek in de annotatietabel naar go-termen om aanvullende kandidaatgenen te identificeren. De sequenties uit het FASTA-bestand extraheren (STAP 8.4.5)

9. Fylogenetische bomen

  1. Download en installeer MEGA30 v. 7.0.26 op uw lokale computer.
  2. Open MEGA, klik op Uitlijnen, klik op Uitlijning bewerken/bouwen, selecteer Een nieuwe uitlijning maken klik op OK, selecteer Eiwit.
  3. Wanneer het uitlijningsvenster wordt geopend, klikt u op Bewerken, klikt u op Reeksen invoegen uit bestand en selecteert u de FASTA met eiwitsequenties van kandidaatgenen en waarschijnlijke homologen.
  4. Selecteer alle reeksen. Zoek het armsymbool en beweeg er overheen. Er zou moeten staan Uitlijnen sequenties met behulp van MUSCLE31 algoritme. Klik op het armsymbool en klik vervolgens op Eiwit uitlijnen om de sequenties uit te lijnen. Bewerk parameters of klik op OK om uit te lijnen met standaardparameters.
  5. Inspecteer visueel en breng handmatige wijzigingen aan en sla het uitlijningsvenster op en sluit het.
  6. Klik in het hoofdvenster van MEGA op Modellen, klik op Beste DNA/Eiwitmodellen (ML)zoeken, selecteer het uitlijningsbestand en selecteer overeenkomstige parameters zoals: Analyse: Modelselectie (ML), Te gebruiken boom: Automatisch (buur-verbindende boom), Statistische methode: Maximale waarschijnlijkheid, Substitutietype: Aminozuur, Gap/ontbrekende gegevensbehandeling: Gebruik alle sites, Branch site filter: Geen.
  7. Zodra het beste model voor de gegevens is bepaald, gaat u naar het hoofdvenster MEGA. Klik op Phylogeny en klik op Contruct/Test Maximum Probability Tree en selecteer indien nodig de uitlijning. Selecteer de juiste parameters voor de boom: Statistische methode: Maximale waarschijnlijkheid, Test van Phylogeny: Bootstrap-methode met 100 replica's, substitutietype: aminozuur, model: LG met Freqs. (+F), tarieven tussen sites: gamma distributed (G) met 5 discrete gammacategorieën, gap/missing data treatment: gebruik alle sites, ML heuristische methode: Nearest-Neighbor-Interchange (NNI).

10. Visualiseer genexpressie met TPM

  1. Voor Trinity gaat u op het computercluster naar de map waar abundance_estimates_to_matrix.pl is uitgevoerd en moet een van de uitvoer matrix zijn. TPM.not_cross_norm. Breng dit bestand over naar uw lokale computer.
    OPMERKING: Zie Aanvullende materialen voor kruismonsternormalisatie.
  2. Volg voor TPMs uit een genoomanalyse de onderstaande stappen.
    1. Ga op het computercluster naar de RSEM-installatielocatie. Kopieer rsem-generate-data-matrix door scp rsem-generate-data-matrix rsem-generate-TPM-matrix tetypen. Gebruik nano om het nieuwe bestand te bewerken en "mijn $offsite = 4" te wijzigen van 4 naar 5 voor TPM, het zou nu "mijn $offsite = 5" moeten lezen.
  3. Ga naar de map waar de RSEM-uitvoerbestanden .genes.results zich bevinden en gebruik nu rsem-generate-TPM-matrix *[genes/isoforms.results] > $OUTPUT om een TPM-matrix te genereren. Resultaten overbrengen naar een lokale computer.
  4. Visualiseer de resultaten in ggplot2.
    1. Download R v. 4.0.0 en RStudio v. 1.2.1335 naar een lokale computer.
    2. Open RStudio aan de rechterkant van het scherm ga naar het tabblad Pakketten en klik op Installeren. Typ ggplot2 en klik op installeren.
    3. In het R-scriptvenster gelezen in de TPM-tabel door gegevens te typen<-read.table("$tpm.txt",header = T)
    4. Voor staafgrafieken vergelijkbaar met figuur 4 typt iets vergelijkbaars met: p<- ggplot() + geom_bar(aes(y=TPM, x=Symbol, fill=Tissue), data=data, stat="identity")
      vul<-c("#d7191c","#fdae61", "#ffffbf", "#abd9e9", "#2c7bb6")
      p<-p+scale_fill_manual(waarden=invullen)
      p + thema(axis.text.x = element_text(hoek = 90))

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De bovenstaande methoden zijn samengevat in figuur 1 en werden toegepast op een dataset van Hydra vulgaris weefsels. H. vulgaris is een zoetwater ongewervelde die behoort tot de phylum Cnidaria die ook koralen, kwallen en zee-anemonen omvat. H. vulgaris kunnen zich aseksueel voortplanten door te ontluiken en ze kunnen hun hoofd en voet regenereren wanneer ze worden doorsneden. In deze studie wilden we de evolutie en expressie van opsinegenen in Hydra

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van dit protocol is om een overzicht te geven van de stappen voor het karakteriseren van een genfamilie met behulp van RNA-seq-gegevens. Het is bewezen dat deze methoden werken voor verschillende soorten en datasets4,34,35. De hier opgerichte pijplijn is vereenvoudigd en moet gemakkelijk genoeg zijn om te worden gevolgd door een beginner in bioinformatica. Het belang van het protocol is dat het alle stappen en noodzakel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken Adriana Briscoe, Gil Smith, Rabi Murad en Aline G. Rangel voor advies en begeleiding bij het opnemen van enkele van deze stappen in onze workflow. We zijn ook Katherine Williams, Elisabeth Rebboah en Natasha Picciani dankbaar voor hun commentaar op het manuscript. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een George E. Hewitt Foundation for Medical research fellowship aan A.M.M.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Bioanalyzer-DNA kitAgilent5067-4626wet lab materials
Bioanalyzer-RNA kitAgilent5067-1513wet lab materials
BLAST+ v. 2.8.1Op computercluster*
https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/
Blast2GO (op uw pc)Op lokale computer
https://www.blast2go.com/b2g-register-basic
boost v. 1.57.0Op computercluster
Bowtie v. 1.0.0Op computercluster
https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/
Computing cluster (ten zeerste aanbevolen)OPMERKING: Analyses van genomische gegevens worden het best uitgevoerd op een high-performance computing cluster omdat de bestanden erg groot zijn.
Cufflinks v. 2.2.1Op computercluster
edgeR v. 3.26.8 (in R)In Rstudio
https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html
gcc v. 6.4.0Op computercluster
Java v. 11.0.2Op computercluster
MEGA7 (op uw pc)Op lokale computer
https://www.megasoftware.net
MEGAX v. 0.1Op lokale computer
https://www.megasoftware.net
NucleoSpin RNA II kitMacherey-Nagel740955.5wet lab materials
perl 5.30.3Op computercluster
pythonOp computercluster
Qubit 2.0 FluorometerThermoFisherQ32866wet lab materials
R v.4.0.0Op computercluster
https://cran.r-project.org/src/base/R-4/
RNAlaterThermoFisherAM7021wet lab materials
RNeasy kitQiagen74104wet lab materials
RSEM v. 1.3.0Computersoftware
https://deweylab.github.io/RSEM/
RStudio v. 1.2.1335Op lokale computer
https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download
Samtools v. 1.3Computersoftware
SRA Toolkit v. 2.8.1Op computercluster
https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit
STAR v. 2.6.0cOp computercluster
https://github.com/alexdobin/STAR
StringTie v. 1.3.4dOp computercluster
https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/
Transdecoder v. 5.5.0Op computercluster
https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases
Trimmomatic v. 0.35Op computercluster
http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic
Trinity v.2.8.5Op computercluster
https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases
TRIzolThermoFisher15596018wet lab materials
TruSeq RNA Library Prep Kit v2IlluminaRS-122-2001wet lab materials
TURBO DNA-free KitThermoFisherAM1907wet lab materials
*Downloads en installatie op de computercluster vereisen mogelijk root-toegang. Neem contact op met uw netwerkbeheerder.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lespinet, O., Wolf, Y. I., Koonin, E. V., Aravind, L. The role of lineage-specific gene family expansion in the evolution of eukaryotes. Genome Research. 12 (7), 1048-1059 (2002).
  2. Gabaldón, T., Koonin, E. V. Functional and evolutionary implications of gene orthology. Nature Reviews Genetics. 14 (5), 360-366 (2013).
  3. Dolinski, K., Botstein, D. Orthology and Functional Conservation in Eukaryotes. Annual Review of Genetics. 41 (1), (2007).
  4. Macias-Muñoz, A., McCulloch, K. J., Briscoe, A. D. Copy number variation and expression analysis reveals a non-orthologous pinta gene family member involved in butterfly vision. Genome Biology and Evolution. 9 (12), 3398-3412 (2017).
  5. Cannon, S. B., Mitra, A., Baumgarten, A., Young, N. D., May, G. The roles of segmental and tandem gene duplication in the evolution of large gene families in Arabidopsis thaliana. BMC plant biology. 4, 10(2004).
  6. Eastman, S. D., Chen, T. H. P., Falk, M. M., Mendelson, T. C., Iovine, M. K. Phylogenetic analysis of three complete gap junction gene families reveals lineage-specific duplications and highly supported gene classes. Genomics. 87 (2), 265-274 (2006).
  7. Macias-Munõz, A., Murad, R., Mortazavi, A. Molecular evolution and expression of opsin genes in Hydra vulgaris. BMC Genomics. 20 (1), 1-19 (2019).
  8. Hisatomi, O., Tokunaga, F. Molecular evolution of proteins involved in vertebrate phototransduction. Comparative Biochemistry and Physiology - B Biochemistry and Molecular Biology. 133 (4), 509-522 (2002).
  9. Arendt, D. Evolution of eyes and photoreceptor cell types. International Journal of Developmental Biology. 47, 563-571 (2003).
  10. Shichida, Y., Matsuyama, T. Evolution of opsins and phototransduction. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 364 (1531), 2881-2895 (2009).
  11. Porter, M. L., et al. Shedding new light on opsin evolution. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1726), 3-14 (2012).
  12. Plachetzki, D. C., Degnan, B. M., Oakley, T. H. The origins of novel protein interactions during animal opsin evolution. PLoS ONE. 2 (10), 1054(2007).
  13. Ramirez, M. D., et al. The last common ancestor of most bilaterian animals possessed at least nine opsins. Genome Biology and Evolution. 8 (12), 3640-3652 (2016).
  14. Schnitzler, C. E., et al. Genomic organization, evolution, and expression of photoprotein and opsin genes in Mnemiopsis leidyi: a new view of ctenophore photocytes. BMC Biology. 10, 107(2012).
  15. Pedersen, K. B., Williams, A., Watt, J., Ronis, M. J. Improved method for isolating high-quality RNA from mouse bone with RNAlater at room temperature. Bone Reports. 11, 100211(2019).
  16. Ridgeway, J. A., Timm, A. E., Fallon, A. Comparison of RNA isolation methods from insect larvae. Journal of Insect Science. 14 (1), 4-8 (2014).
  17. Scholes, A. N., Lewis, J. A. Comparison of RNA isolation methods on RNA-Seq: Implications for differential expression and meta-Analyses. BMC Genomics. 21 (1), 1-9 (2020).
  18. Briscoe, A. D., et al. Female behaviour drives expression and evolution of gustatory receptors in butterflies. PLoS genetics. 9 (7), 1003620(2013).
  19. Murad, R., Macias-Muñoz, A., Wong, A., Ma, X., Mortazavi, A. Integrative analysis of Hydra head regeneration reveals activation of distal enhancer-like elements. bioRxiv. , 544049(2019).
  20. Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. Impact of RNA degradation on measurements of gene expression. BMC Biology. 12, 42(2014).
  21. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  22. Trinity. RNA-Seq De novo Assembly Using Trinity. , 1-7 (2014).
  23. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).
  24. Li, B., Dewey, C. N. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC bioinformatics. 12, 323(2011).
  25. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome biology. 10, 25(2009).
  26. Camacho, C., et al. BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinformatics. 10, 421(2009).
  27. Conesa, A., Götz, S. Blast2GO: A comprehensive suite for functional analysis in plant genomics. International Journal of Plant Genomics. 619832, (2008).
  28. Conesa, A., et al. Blast2GO: A universal tool for annotation, visualization and analysis in functional genomics research. Bioinformatics. 21 (18), 3674-3676 (2005).
  29. Götz, S., et al. High-throughput functional annotation and data mining with the Blast2GO suite. Nucleic Acids Research. 36 (10), 3420-3435 (2008).
  30. Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0 for bigger datasets. Molecular biology and evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).
  31. Edgar, R. C. MUSCLE: Multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Research. 32 (5), 1792-1797 (2004).
  32. Taddei-Ferretti, C., Musio, C., Santillo, S., Cotugno, A. The photobiology of Hydra's periodic activity. Hydrobiologia. 530, 129-134 (2004).
  33. Chapman, J. A., et al. The dynamic genome of Hydra. Nature. 464 (7288), 592-596 (2010).
  34. Macias-Muñoz, A., Rangel Olguin, A. G., Briscoe, A. D. Evolution of phototransduction genes in Lepidoptera. Genome Biology and Evolution. 11 (8), 2107-2124 (2019).
  35. Macias-Munõz, A., Murad, R., Mortazavi, A. Molecular evolution and expression of opsin genes in Hydra vulgaris. BMC Genomics. 20 (1), (2019).
  36. Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
  37. Tavares, L., Alves, P. M., Ferreira, R. B., Santos, C. N. Comparison of different methods for DNA-free RNA isolation from SK-N-MC neuroblastoma. BMC research notes. 4, 3(2011).
  38. Johnson, M. T. J., et al. Evaluating Methods for Isolating Total RNA and Predicting the Success of Sequencing Phylogenetically Diverse Plant Transcriptomes. PLoS ONE. 7 (11), (2012).
  39. Zhao, S., Zhang, Y., Gamini, R., Zhang, B., Von Schack, D. Evaluation of two main RNA-seq approaches for gene quantification in clinical RNA sequencing: PolyA+ selection versus rRNA depletion. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
  40. Zhao, S., et al. Comparison of stranded and non-stranded RNA-seq transcriptome profiling and investigation of gene overlap. BMC Genomics. 16 (1), 1-14 (2015).
  41. Corley, S. M., MacKenzie, K. L., Beverdam, A., Roddam, L. F., Wilkins, M. R. Differentially expressed genes from RNA-Seq and functional enrichment results are affected by the choice of single-end versus paired-end reads and stranded versus non-stranded protocols. BMC Genomics. 18 (1), 1-13 (2017).
  42. Haas, B. J., et al. De novo transcript sequence reconstruction from RNA-seq using the Trinity platform for reference generation and analysis. Nature Protocols. 8 (8), 1494-1512 (2013).
  43. Pertea, M., et al. StringTie enables improved reconstruction of a transcriptome from RNA-seq reads. Nature biotechnology. 33 (3), 290-295 (2015).
  44. Bray, N. L., Pimentel, H., Melsted, P., Pachter, L. Near-optimal probabilistic RNA-seq quantification. Nature Biotechnology. 34 (5), 525-527 (2016).
  45. Patro, R., Duggal, G., Love, M. I., Irizarry, R. A., Kingsford, C. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nature Methods. 14 (4), 417-419 (2017).
  46. Araujo, F. A., Barh, D., Silva, A., Guimarães, L., Thiago, R. OPEN GO FEAT a rapid web-based functional annotation tool for genomic and transcriptomic data. , 8-11 (2018).
  47. Huerta-Cepas, J., et al. Fast genome-wide functional annotation through orthology assignment by eggNOG-mapper. Molecular Biology and Evolution. 34 (8), 2115-2122 (2017).
  48. Huerta-Cepas, J., et al. EggNOG 5.0: A hierarchical, functionally and phylogenetically annotated orthology resource based on 5090 organisms and 2502 viruses. Nucleic Acids Research. 47, 309-314 (2019).
  49. Törönen, P., Medlar, A., Holm, L. PANNZER2: A rapid functional annotation web server. Nucleic Acids Research. 46, 84-88 (2018).
  50. Robinson, M., Mccarthy, D., Chen, Y., Smyth, G. K. edgeR differential expression analysis of digital gene expression data User's Guide. , (2013).
  51. Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nature Protocols. 4 (1), 44-57 (2009).
  52. Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: Paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Research. 37 (1), 1-13 (2009).
  53. Letunic, I., Bork, P. Interactive tree of life (iTOL) v3: an online tool for the display and annotation of phylogenetic and other trees. Nucleic acids research. 44, 242-245 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

RNA seq analysefylogenetische stamboomopsinegenendifferenti le expressieBLAST zoekopdrachtMEGA aligneringedgeR analyse

Gerelateerde artikelen