Wij bieden een protocol voor het genereren van een farmacologische DYT /PARK-ATP1A3 dystonie muis model via implantatie van canules in basale ganglia en cerebellum aangesloten op osmotische pompen. We beschrijven de inductie van dystonie-achtige bewegingen via toepassing van een motorische uitdaging en de karakterisering van het fenotype via gedragsscoresystemen.
Methodenartikel
Implantatie van osmotische pompen en inductie van stress om een symptomatisch, farmacologisch muismodel voor DYT/PARK-ATP1A3 Dystonie vast te stellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Genetisch gemodificeerde muismodellen worden geconfronteerd met beperkingen, vooral bij het bestuderen van bewegingsstoornissen, waarbij de meeste beschikbare transgene knaagdiermodellen geen motorisch fenotype presenteren dat lijkt op de klinische aspecten van de menselijke ziekte. Farmacologische muismodellen zorgen voor een meer directe studie van de pathomechanismen en hun effect op het gedragsfenotype. Osmotische pompen aangesloten op hersenblikjes openen de mogelijkheid om farmacologische muismodellen te maken via lokale en chronische medicijnlevering. Voor de erfelijke bewegingsstoornis van snel beginnende dystonie-parkinsonisme kan de verlies-van-functie mutatie in de α3-subunit van de Na+/K+-ATPase worden gesimuleerd door een zeer specifieke blokkade via de glycoside ouabain. Om lokaal de α3-subunit in de basale ganglia en het cerebellum te blokkeren, die de twee hersenstructuren zijn waarvan wordt aangenomen dat ze sterk betrokken zijn bij de pathogenese van snel beginnende dystonie-parkinsonisme, wordt een bilateraal canule stereotaxically geïmplanteerd in het striatum en wordt een extra enkele canule in het cerebellum geïntroduceerd. De canules zijn via vinylbuizen verbonden met twee osmotische pompen, die onderhuids op de rug van de dieren worden geïmplanteerd en de chronische en nauwkeurige levering van ouabain mogelijk maken. Het farmacologische muismodel voor snel beginnende dystonie-parkinsonisme draagt het bijkomende voordeel van het hervatten van de klinische en pathologische kenmerken van asymptomatische en symptomatische mutatiedragers. Net als mutatiedragers van snel beginnende dystonie parkinsonisme, ontwikkelen de door ouabain-perfused muizen dystonie-achtige bewegingen pas na extra blootstelling aan stress. We tonen een mild stressparadigma en introduceren twee gewijzigde scoresystemen voor de beoordeling van een motorisch fenotype.
Inleiding
De voordelen van een continue drug levering rechtstreeks in de hersenen zijn talrijk. Repetitieve en frequente injecties, die een onnodige stressfactor voor dieren vertegenwoordigen, kunnen worden vermeden en een constantere intracerebrale concentratie van het medicijn kan worden bereikt. Dit is vooral geldig wanneer systemisch toegediende geneesmiddelen niet gemakkelijk doordringen in de bloed-hersenbarrière. Bovendien, chronische drug levering via osmotische pompen zorgt voor de gelokaliseerde levering van substraten die anders systeem-brede bijwerkingen zou hebben. De medicijnen kunnen gericht worden geleverd aan de gewenste hersenstructuren, het resulterende effect kan dus direct worden getraceerd. Dit kan worden gebruikt voor een scala aan toepassingen, zoals de studie van therapeutische effecten, evenals de studie van pathomechanisms. Deze laatste toepassing werd gebruikt in het project hierin om een farmacologische muis model voor dystonie te creëren.
De analyse en het begrip van dystonische syndromen, die de derde meest voorkomende bewegingsstoornis vertegenwoordigen, zijn sterk beperkt door het feit dat genetische diermodellen grotendeels niet de ziekte fenotype reproduceren die bij zieke menselijke evenals pathofysiologie wordt gevonden. Deze kwestie is niet beperkt tot dystonische syndromen, maar betreft in feite veel transgene knaagdiermodellen op het gebied van bewegingsstoornissen1,2. De reden voor het ontbreken van een fenotype in transgene knaagdiermodellen zou gebaseerd kunnen zijn op zeer effectieve compenserende mechanismen3. In het geval van dystonie wordt de ziekte gekenmerkt door onwillekeurige spiercontracties die draaiende bewegingen en abnormale houdingen veroorzaken4. De studie van secundaire oorzaken (d.w.z. hersenletsel) van dystonische symptomen, heeft geholpen om de structuren te identificeren die betrokken zijn bij de manifestatie van deze motorische afwijkingen, zoals de basale ganglia5. Hersenbeeldvormingsstudies van erfelijke vormen van dystonie hebben functionele afwijkingen aangetoond in bijna alle hersengebieden die verantwoordelijk zijn voor motorische controle en sensorimotorische integratie6,7. Knaagdiermodellen zijn echter nog steeds nodig om het begrip van de neurale disfuncties op moleculair en grootschalig netwerkniveau en voor de ontwikkeling van therapeutische opties te verdiepen. Dit is waar farmacologische muismodellen de mogelijkheid bieden om de klinische en pathologische kenmerken van een ziekte nauwkeuriger te repliceren.
Snel beginnende dystonie-parkinsonisme (DYT/PARK-ATP1A3; RDP; DYT12) is een van de erfelijke vormen van dystonie. Het wordt veroorzaakt door verlies-van-functie mutaties in het ATP1α3-gen, dat codeert voor de α3-subunit van de Na+/K+-ATPase8. Bovendien wordt erkend dat genmutatiedragers jarenlang vrij kunnen zijn van symptomen voordat ze een blijvende gegeneraliseerde dystonie en parkinsonisme kunnen ontwikkelen na blootstelling aan een stressvolle gebeurtenis. Inderdaad, de penetrance van DYT/PARK-ATP1A3 is onvolledige en stressvolle gebeurtenissen die fungeren als een trigger variëren van fysieke overexertion en extreme temperaturen tot overconsumptie van alcohol en infecties9,10. Om DYT/PARK-ATP1A3 te bestuderen en potentiële therapeutische interventies te vinden, is het vele malen geprobeerd om de stress-afhankelijke ziekteontwikkeling in knaagdiermodellen na te bootsen. Afgezien van het bestaande genetische DYT/PARK-ATP1A3 muismodel, waarbij voorbijgaande abnormale en stuiptrekkingsachtige bewegingen werden veroorzaakt door onderkoeling, zijn alle gepubliceerde genetische muismodellen voor DYT/PARK-ATP1A3 er niet in geslaagd dystonische symptomen te produceren1,11,12. Calderon et al. eerder aangetoond dat het blokkeren van de α3-subunit bilateraal in de basale ganglia en het cerebellum via de cardiale glycoside ouabain in wilde type muizen resulteert in milde loop verstoring13. De extra blootstelling aan elektrische voetschokken in een warme omgeving leidde tot een dystonisch en bradykinetisch fenotype, wat aantoont dat chronische en gerichte perfusie van ouabain gevolgd door stress met succes het DYT/PARK-ATP1A3 fenotype imiteert.
Het blootstellen van dieren aan elektrische voetschokken in een warme omgeving van 38-40 °C gedurende een periode van twee uur veroorzaakt echter pijn en angst bij dieren, die verstorende factoren zijn, met name voor de beoordeling van veranderingen in het catecholaminesysteem in verband met de ontwikkeling van dystonie. Zo beschrijven we hierin een ander soort stress paradigma met een hoge translationele waarde, die betrekking heeft op het feit dat milde tot matige oefening zijn beschreven als triggers in DYT / PARK-ATP1A3 patiënten9. Bovendien is repetitieve oefening een bekende trigger voor focale dystonie14. Muizen werden herhaaldelijk onderworpen aan uitdagende motorische taken bestaande uit drie afdalingen van een houten paal ("paaltest") en drie runs op een Rotarod-apparaat ("Rotarod-prestatietest"). De plaatsing van dieren op de top van een 50 cm houten paal werd gebruikt om de dieren af te dwingen om af te dalen, het Rotarod-apparaat werd gebruikt om muizen te onderwerpen aan gedwongen activiteit door ze op een roterende staaf te plaatsen.
De karakterisering van het motorfenotype van een muismodel voor dystonie is bijzonder uitdagend vanwege het gebrek aan vooraf gedefinieerde tests en scores. De afgelopen jaren is echter herhaaldelijk een variatie van een beoordeling van motorische handicaps gebruikt om de ernst en de verdeling van dystonie-achtige bewegingen bij knaagdieren13,15,16te evalueren . We presenteren hierin een aangepaste versie van de dystonie rating schaal, die effectief bleek te zijn bij het evalueren van de dystonie-achtige fenotype van dieren wanneer waargenomen over een periode van vier minuten. Als tweede methode voor het beoordelen van dystonie-achtige bewegingen presenteren we een nieuw ontwikkeld scoresysteem voor de beoordeling van abnormale bewegingen tijdens een staartsuspensietest. Het maakt de beoordeling van de frequentie en duur van dystonie-achtige bewegingen en houdingen van de voorste ledematen, achterpoten en romp.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de toepasselijke internationale, nationale en/of institutionele richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van dieren. De lokale autoriteiten van de Regierung von Unterfranken, Würzburg, Duitsland, keurden alle dierproeven goed.
1. Priming van osmotische pompen
LET OP: Deze stap moet ten minste 48 uur worden uitgevoerd voorafgaand aan de operatie. ALZET osmotische pompen moeten worden voorgevuld om ervoor te zorgen dat de pompsnelheid een stabiele toestand bereikt vóór de implantatie.
- Bereid vooraf de gewenste oplossing voor chronische perfusie. Zorg ervoor dat het oplosmiddel en het middel compatibel zijn met de osmotische pompen en katheters. Ontdooi voor het project hierin een 10x voorraadoplossing van ouabain (opgeslagen bij -20 °C) bij kamertemperatuur en vortex voor 10 s.
LET OP: Ouabain is giftig: het mag alleen met handschoenen worden behandeld en alleen onder een steriele capuchon worden geopend om inademing te voorkomen. - Zet de steriele kap aan; desinfecteren de kap, evenals alle instrumenten en materiaal die nodig zijn alvorens ze onder de motorkap.
- Doe chirurgische handschoenen aan voordat u de osmotische pompen gebruikt. Bereid afzonderlijk de ouabain-oplossing voor die is aangewezen voor de pompen van het striatum en het cerebellum.
OPMERKING: Houd er rekening mee dat de concentratie van de oplossing in de pomp voor het striatum moet worden verdubbeld ten opzichte van de concentratie van de oplossing in de pomp die is aangewezen voor het cerebellum. Dit is te wijten aan het feit dat de pomp voor het striatum is aangesloten op een dubbele canule, de stroomsnelheid is echter hetzelfde als voor de pomp van het cerebellum, die is aangesloten op een enkele canule. - Bereken de benodigde hoeveelheid oplossing met behulp van de volgende formule:
massaleveringssnelheid (ko) = volumeleveringssnelheid (Q) x concentratie van het agens in het voertuig (Cd)
Voor het onderhavige project werden de osmotische pompen geprimed en gevuld met een ouabain-oplossing met een concentratie van 11,2 ng/h of 0,9% zout voor de controlegroep. - Vortex zowel ouabain oplossingen voor 10 s en steriele filter (dat wil zeggen, 0,22 μm spuit-end filter) ze in aparte, nieuwe microcentrifuge buizen, met behulp van een ander filter voor elke oplossing.
- Weeg de lege osmotische pompen samen met de stroommoderator (ongeveer 0,4 g).
- Vul een 1 mL spuit met een 27 G vulblikje (bij voorkeur met een stompe punt) met steriele gefilterde ouabain-oplossing of voertuigoplossing.
- Haal alle luchtbellen uit de spuit, houd de osmotische pomp rechtop, steek de canule helemaal in de pomp en vul het reservoir langzaam op tot er een overmaat aan de bovenkant verschijnt (vermijd snelle vulling omdat dit kan leiden tot luchtbellen in de pomp). Plaats vervolgens de stroommoderator in de pomp (overtollige oplossing moet bovenaan verschijnen).
- Trek de stroommoderator uit (ongeveer 5 mm), trek voorzichtig de witte flens met een schaar uit en sluit een stukje vinylbuizen aan op de stroommoderator. Zorg ervoor dat de katheter een lengte van ongeveer 2 cm heeft om een goede mobiliteit van het dier mogelijk te maken.
- Weeg de gevulde osmotische pomp nogmaals af om ervoor te zorgen dat het verschil in gewicht tussen gevulde en lege pomp overeenkomt met het verwachte gewicht van de beladen oplossing.
LET OP: Voor de meeste waterige oplossingen is dit gewicht gelijk aan het volume in microliter. Als het gewicht niet overeenkomt met het verwachte volume, kan de lucht worden opgesloten in de pomp, die moet worden geleegd en bijgevuld. - Voor de priming van de pompen, bereid twee 2 mL microcentrifuge buizen, een buis voor het striatum en een voor het cerebellum.
- Dompel de pompen onder in de microcentrifugebuizen die halverwege gevuld zijn met 0,9% zoutoplossing. Dompel het open uiteinde van de katheter niet onder. Doe de microcentrifugebuizen 48 uur bij 37 °C in een thermocycler om ervoor te zorgen dat de pomp vóór de implantatie een constante pompsnelheid heeft bereikt en de katheters voorgevuld zijn.
2. Canule en osmotische pompimplantatie
- Plaats de muis (mannelijk, C57Bl/6N, 11-12 weken oud) in een kamer ontworpen voor inademing anesthesie; de stroomsnelheid van isoflurane op 2-3% en de stroomsnelheid van zuurstof op 2 L/min.
- Nadat de muis diep verdoofd is volgens goedgekeurde protocollen, scheert u de bovenkant van het hoofd van het dier, rugnek en proximale derde van de rug.
- Plaats het dier in een stereotactisch frame en zet de anesthesie voort met isoflurane via een muis anesthesiemasker ontworpen voor het stereotactische instrument (isoflurane stroomsnelheid 1,5-2%, 2 L/min zuurstof).
- Met behulp van rubberen uiteinden of niet-breuk oorspen, bevestig het hoofd van het dier in het stereotactische frame, zorg ervoor dat het hoofd is genivelleerd.
- Om onderkoeling te voorkomen, plaatst u een verwarmingskussen onder het dier, plaatst u een rectale temperatuursonde en stelt u de temperatuur in op 37 °C. Bescherm de ogen van het dier tegen uitdroging door een druppel oogheelkundige zalf op elk oog te gebruiken.
- Breng een pijnstiller, zoals Carprofen (5 mg/kg lichaamsgewicht), onderhuids voor het begin van de operatie.
- Met een spuit onderhuids injecteren tot 0,2 mL van bupivacaine 0,25% en wacht 30 s voor de lokale anesthesie van kracht.
- Desinfecteer de geschoren gebieden grondig met een antiseptisch, zoals octenidinedihydrochloride.
- Na grondige desinfectie van het chirurgische gebied, gebruik een scalpel om een incisie aan de bovenkant van het hoofd te plaatsen en gebruik een schaar om de incisie tot aan de voorpoten voort te zetten. Leg de schedel bloot met behulp van bulldogklemmen en veeg het periosteum af met een steriele applicator met katoenkantel.
- Lijn een pen of het puntje van een canule gekleurd in zwarte inkt met bregma en gebruik de juiste coördinaten om de drie toegangspunten voor de hersen canules op de schedel te markeren (coördinaten voor de bilaterale gaten die nodig zijn voor perfusie van de basale ganglia: voorste/achterste: + 0,74 mm, medial/laterale: +/- 1,50 mm (+ met vermelding van de rechterkant, - de linkerkant ten opzichte van bregma); coördinaten voor het gat op de middellijn van het cerebellum: voorste/achterste: - 6,90 mm). Boor vervolgens voorzichtig de gaten voor de dubbele canule die is aangewezen voor de basale ganglia en de enkele canule die is aangewezen voor het cerebellum(figuur 1A).
- Boor een vierde gat voor een kleine schroef tussen het striatum en het cerebellum. Deze schroef zal uiteindelijk worden ingebed in tandcement en bieden extra houvast voor de canules. Met behulp van fijne tangen en een schroevendraaier, voorzichtig de schroef in het kleine gaatje totdat het stevig is bevestigd in de schedel. Implanteer de schroef niet te diep omdat dit het hersenweefsel beschadigt.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om door te gaan met de osmotische pompimplantatie voordat u de osmotische canules invoegt. Dit voorkomt dat er onbedoelde schade aan de canules ontstaat bij het implanteren van de pompen. - Om een kleine zak te maken voor de osmotische pomp aan elke kant van de dieren terug, gebruik weefsel tangen om de onderhuidse weefsellagen te scheiden. Verhuis de tangen naar één achterbeen en open de tangen iets om de onderhuidse zak te verbreden. Herhaal dezelfde procedure voor de andere kant, eerst het verwijderen van de tangen uit de incisie en vervolgens duwen ze zachtjes naar het tweede achterbeen.
LET OP: De zak moet het mogelijk maken de pomp gemakkelijk naar binnen te schuiven, maar het moet niet te veel ruimte hebben om onder de huid te bewegen. - Met behulp van weefsel tangen neem de eerste pomp samen met de aangesloten stuk van buizen en schuif het in een onderhuidse zak. Herhaal dezelfde procedure met de tweede pomp.
- Met behulp van een minipomphouder introduceert u een enkele osmotische canule met een aangepaste lengte van 3,0 mm in het gat dat in de middellijn van het cerebellum wordt geboord. Maak de canulekop voorzichtig los en bevestig de canule en de kleine schroef met tandcement, waarbij u ervoor zorgt dat het verbindingsstuk voor de slang van de osmotische pomp niet wordt bedekt. Zorg ervoor dat het tandcement rond de canule volledig is gedroogd voordat u verdergaat met een operatie.
- Voordat u een dubbele canule met een midden-naar-middenafstand van 3,0 mm en een op maat gemaakte lengte van 4,0 mm in de bilateraal geboorde gaten boven de basale ganglia plaatst, bevestigt u twee korte stukken vinylbuizen (0,5 cm) aan de twee aansluitende stukken van de dubbele canule. Sluit de vinylbuizen aan met een bifurcatieadapter en vul het hele buizenstelsel zorgvuldig voor, inclusief de adapter en canule met ouabain-oplossing of voertuig (kamertemperatuur, steriele filter vooraf). Dit kan het beste met een 1 mL spuit en een 27 G vulblikje geïntroduceerd in de enkele achterkant van de bifurcatie adapter (Figuur 1B).
- Steek met behulp van een minipomphouder de dubbele canule voorzichtig in de bilaterale gaten. Gebruik een klem om de canulekop los te maken en bevestig de dubbele canule met tandcement.
- Sluit de katheters van de osmotische pompen aan op respectievelijk de bifurcatieadapter en de enkele canule. Zorg ervoor dat de katheters een sterke greep hebben op de verbindingsstukken van de canules.
OPMERKING: Beide pompen hebben een gelijke debietsnelheid, dus wees voorzichtig om de osmotische pomp met de dubbele geconcentreerde oplossing aan te sluiten op de bifurcatieadapter om ervoor te zorgen dat dezelfde concentratie zowel de basale ganglia als het cerebellum bereikt. - Sluit de incisie op de rug van de dieren met steken zo ver mogelijk in de richting van de schedel, wees voorzichtig niet te overbelasten de huid (Figuur 1C).
- Onderhuids injecteren 0,5 mL van 0,9% zoutoplossing, die lichaamstemperatuur moet hebben, in een huidplooi aan elke kant van de rug van de dieren om uitdroging van de muizen te voorkomen, zorgvuldig vermijden van de pompen.
3. Motoruitdaging
- Onderwerp ouabain- of voertuig-perfused muizen aan uitdagende motorische taken als een vorm van milde stress blootstelling 4 uur na de operatie en herhaaldelijk elke 24 uur daarna om dystonie-achtige bewegingen te induceren. Dit omvat geen gedragskarakterisering; het doel is om een hoger stressniveau te induceren in vergelijking met normale kooihouden.
- Plaats de muis op een 50 cm ruw oppervlak, houten paal met een diameter van 1 cm, neus naar beneden gericht. Zorg ervoor dat de paal in een grote kooi met voldoende beddengoed wordt geplaatst in geval van vallen. Het is niet nodig om de tijd van de afdaling te meten, maar kijk uit voor onwillekeurige hyperextensies van voorste ledematen en achterpoten gepresenteerd door ouabain-perfused dieren tijdens het afdalen van de paal. Laat muizen de paal drie keer afdalen en laat 2 minuten herstel tussen afdalingen.
OPMERKING: Ouabain-perfused muizen moeten de eerste symptomen vertonen zoals bradykinesia 4 uur na de operatie. Echter, 24 uur na de operatie muizen moeten beginnen met onwillekeurige hyperextensies van de voorste ledematen en achterpoten presenteren als een teken van dystonie-achtige bewegingen tijdens de afdaling. - Voor de tweede motortaak plaatst u muizen op de roterende staaf zoals gedaan voor de Rotarod-prestatietest. Het Rotarod-apparaat wordt niet gebruikt als een maat voor de latentie om te vallen, het doel is om muizen te onderwerpen aan gedwongen activiteit. Plaats de muizen drie keer op de roterende staaf en laat 2 minuten herstel tussen de tests.
OPMERKING: Gebruik een versnellend Rotarod-apparaat om de blootstelling aan stress te verhogen. Voor het hier beschreven project accelereert de hengel van 5 naar 50 tpm over een bepaalde periode van 300 sec. - Laat dieren 30 minuten herstellen tussen de paaltest en de Rotarod-prestatietest en nog eens 30 minuten voordat ze scoren op dystonieachtige bewegingen zoals beschreven onder protocolstap 4. Tussen de repetitieve stressblootstelling, laat muizen 24 uur met intervallen herstellen.
4. Scoresystemen voor de beoordeling van dystonie-achtige bewegingen
OPMERKING: De experimentator moet worden verblind voor de groepstoewijzing die wordt geanalyseerd om bias te voorkomen. De gedragstests die worden gebruikt om het fenotype van de muizen te karakteriseren zijn twee scoresystemen: een dystonie rating schaal scoren abnormale, dystonie-achtige bewegingen en een gedragsscore met behulp van de staart suspensie test. Beoordeel de dystonie-achtige bewegingen na een hersteltijd van 30 min na de blootstelling aan milde stress.
- Dystonie rating schaal
OPMERKING: Vanwege het gebrek aan vooraf gedefinieerde gedragstaken, werd de dystonie rating schaal vastgesteld als een waarnemer gebaseerd scoresysteem vergelijkbaar met de klinische rating schalen van menselijke dystonie. Het is een aangepaste versie van de dystonie rating schaal gebruikt door Calderon et al.13.- Record houding en gang van dieren over een periode van 4 min nadat dieren zijn geplaatst in een plastic of houten doos.
- Score voor frequentie en verdeling van dystonie-achtige bewegingen van 0 tot 4 punten: (0) normaal motorisch gedrag; (1) abnormaal motorisch gedrag, geen dystonie-achtige bewegingen; (2) milde motorische stoornissen met milde focale dystonie-achtige bewegingen; (3) matige motorische stoornissen met ernstige focale dystonie-achtige bewegingen; (4) ernstige bijzondere waardevermindering, met aanhoudende, gegeneraliseerde dystonie-achtige bewegingen (figuur 2). Beschouw de volgende bewegingen of houdingen als dystonie-achtige: hyperextensie van de voorste ledematen, brede houding of hyperextensie van achterpoten en kyfose. Overweeg dystonie als brandpunt in het geval een enkel lichaamsdeel wordt beïnvloed en zoals gegeneraliseerd in het geval de stam en ten minste twee andere lichaamsdelen worden beïnvloed.
- Staartsveertest
LET OP: De staart suspensie test wordt vaak gebruikt om te observeren en te scoren voor achterpoot clasping. Dit is echter een zeer niet-specifiek fenotype dat wijst op een motorische stoornis. Het volgende protocol stelt een scoresysteem voor dat specifiek is voor dystonie-achtige bewegingen. Vanwege de generalisatie van dystonie bij DYT/PARK-ATP1A3 patiënten, moeten dystonie-achtige bewegingen worden beoordeeld in voorste ledematen, romp en achterpoten. Een nieuw ontwikkeld scoresysteem van 0-8 punten werd ontwikkeld, een totale score < 2 gaf aan dat er geen dystonie-achtige bewegingen aanwezig waren(figuur 3).- Pak de muis bij de staart in de buurt van de basis en til het dier op. Neem een 2 min video van de staart schorsing test en wijs een score in een latere, grondige analyse van de opname.
- Score de voorste ledematen van 0 tot 4 punten, waar herhaalde of aanhoudende tonic intrekkingen van een of beide voorste ledematen, evenals een hyperextensie in combinatie met kruising van de voorste ledematen, werden geclassificeerd als dystonie-achtige: (0) geen abnormale bewegingen; (1) verminderde beweging van voorste ledematen met hyperextensie van poten gezien ≥ 50% van de geregistreerde tijd; (2) milde dystonie-achtige bewegingen van de voorste ledematen(en) < 50% van de geregistreerde tijd; (3) milde dystonie-achtige bewegingen van de voorste ledematen(en) ≥ 50% van de geregistreerde tijd of ernstig < 50% van de geregistreerde tijd; (4) ernstige dystonie-achtige bewegingen van de voorste ledemaat(en) ≥ 50% van de geregistreerde tijd.
OPMERKING: Hindlimb clasping is een abnormale beweging die niet mag worden gescoord als dystonie-achtige. - Score de achterpoten van 0 tot 3 punten, waar intrekking en klemmen van achterste ledematen en aanhoudende hyperextensie werden beoordeeld als dystonie-achtige: (0) geen abnormale bewegingen; (1) verminderde beweging van achterpoten met hyperextensie van poten gezien ≥ 50% van de geregistreerde tijd; (2) dystonie-achtige bewegingen van één achterpoot; (3) dystonie-achtige bewegingen van beide achterpoten.
- In het geval van truncal vervorming > 80% van de opgenomen tijd, wordt een extra punt toegevoegd aan de score.
- Plaats het dier terug in zijn kooi.
Resultaten
Figuur 4 is gewijzigd van Rauschenberger et al.17. Voor gegevensanalyse van zowel de dystonie rating schaal(A) en de staart schorsing test(B),bereken de totale score voor elk tijdstip punt voor elk dier. Het gemiddelde van elk tijdspunt en elke groep moet worden uitgezet op een geschikte grafiek. De verdeling van de waarden moet worden onderzocht en de juiste statistische test moet worden toegepast om de betekenis te bepalen. Bij een voldoende aantal dieren kan een motorfenotype worden gedetecteerd, zowel met de dystonieclassificatieschaal als met de beoordeling van abnormale bewegingen in de staartsuspensietest. Het dystonie-achtige fenotype wordt aangetoond door de aanzienlijk hogere motorische score in beide beoordelingen in de ouabain-perfused, gestreste groep in vergelijking met ouabain-perfused, niet-gestreste muizen en de controlemuizen.
Figuur 1: De belangrijkste chirurgische stappen voor canule en osmotische pompimplantatie. (A) Voor de aangegeven coördinaten moeten de gaten bilateraal worden geboord voor de dubbele canule die is aangewezen voor de basale ganglia en voor de enkele canule die op de middellijn van het cerebellum is geplaatst. De twee volledig geconstrueerde osmotische pompen worden aan weerszijden van het dier getoond. (B) De foto toont een geïmplanteerde, enkele canule in het cerebellum, bevestigd met tandcement. De dubbele canule voor de basale ganglia moet worden aangesloten op de bifurcatieadapter en voor de implantatie met ouabain worden gevuld. (C) Afbeelding van de voltooide procedure. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Beoordeling van dystonie-achtige bewegingen met een dystonie rating schaal. Tijdens een 4 min video, dystonie-achtige bewegingen werden gescoord op basis van lichaamsverdeling en duur. Onwillekeurige hyperextensie van de voorste ledematen, een brede houding of hyperextensie van achterpoten en kyfose werden beoordeeld als dystonie-achtige. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Beoordeling van dystonie-achtige bewegingen tijdens een staartsuspensietest. Het nieuw ontwikkelde scoresysteem voor abnormale bewegingen tijdens een 2 min staart suspensie test evalueert dystonie-achtige bewegingen in de voorste ledematen, achterpoten en romp van 0-8 punten in totaal. Voor de voorste ledematen, een hyperextensie en kruising van de voorste ledematen, evenals een tonic flexie naar de romp gekwalificeerd als dystonie-achtige. Voor de achterpoten werd de onvrijwillige hyperextensie en intrekking met uitbreiding over de middellijn als dystonie-achtig beoordeeld. Een truncal vervorming meer dan 80% van de geregistreerde tijd werd gescoord met een punt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Representatieve grafieken van de dystonie-ratingschaal en de staartsuspensietest. (A) De grafiek toont de dystonie-rating schaal voor NaCl-perfused, gestreste muizen (gestippelde zwarte lijn), ouabain-perfused, niet-gestreste muizen (gestippelde oranje lijn) en ouabain-perfused, gestreste muizen (donkerblauwe lijn). Voor elk tijdspunt worden de gemiddelde waarden ± standaardfout van het gemiddelde (SEM) weergegeven. (B) Het diagram toont de beoordeling van abnormale bewegingen tijdens een 2-min staart suspensie test voor NaCl-perfused, gestreste muizen (gestippelde zwarte lijn), ouabain-perfused, niet-gestreste muizen (gestippelde oranje lijn) en ouabain-perfused, gestreste muizen (donkerblauwe lijn). Statistische analyse werd gedaan voor de dystonie rating schaal en de staart schorsing test scoren met behulp van de twee-tailed Mann-Whitney test. Bonferroni-Holm correctie (§) van de p-waarden toonde een significant verschil voor de observationele periode van 72 uur. Donkerblauw * duidt op significante verschillen tussen ouabain-perfused, gestreste muizen en ouabain-perfused, niet-gestreste muizen muizen, zwart * duiden significante verschillen aan tussen NaCl-perfused, gestreste muizen en ouabain-perfused, gestreste muizen en tussen NaCl-perfused, gestreste muizen en ouabain-perfused, niet-gestreste muizen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussie
Dit DYT/PARK-ATP1A3 farmacologische muismodel maakt de gedetailleerde analyse mogelijk van intracerebrale structurele en neurochemische veranderingen die uitsluitend worden veroorzaakt door remming van de natriumkaliumionenpomp in de basale ganglia en cerebellum, alsmede veranderingen in verband met stressblootstelling. In het geval van muizen kunnen maximaal twee osmotische pompen onderhuids worden geïmplanteerd. We presenteren hierin een methode die chronische medicijnlevering aan meerdere hersenstructuren detailert door een dubbele canule te implementeren die is aangesloten op een bifurcatieadapter naast een enkele canule. Deze methodologie kan worden gebruikt voor elke toepassing die vereist meerdere hersenstructuren gelijktijdig en chronisch worden geperfundeerd.
We presenteren een muismodel van een zeldzame bewegingsstoornis, waarbij patiënten blijvende symptomen ontwikkelen na blootstelling aan stress. Deze veronderstelde gen-milieu interactie is nog steeds niet goed begrepen, maar kan een van de belangrijkste pathomechanismen in DYT / PARK-ATP1A3 ontwikkeling. Verschillende methoden om muizen bloot te stellen aan stress zijn in het verleden gepubliceerd en omvatten elektrische voetschokken, een beperking, koude of warme omgeving en blootstelling aan verschillende geuren11,12,13. In een poging om muizen bloot te stellen aan een milde stressfactor met translationele waarde, beschrijven we hierin de repetitieve onderwerping van muizen aan uitdagende motorische taken. Voor de pooltest, ouabain-perfused dieren bleek onvrijwillige hyperextensie van de voorste ledematen en achterpoten. Deze bewegingen waren zeer vergelijkbaar met de dystonie-achtige bewegingen waargenomen tijdens de 4-min video-opname van de dieren en de staart schorsing test. De toepassing van milde stress in de vorm van uitdagende motorische taken kan nuttig zijn in andere muismodellen met motorische symptomen of neurodegeneratie, waarbij gen-milieu-interacties de mate van ziekteprogressie enorm beïnvloeden.
Er is een algemeen gebrek aan vooraf gedefinieerde gedragstaken en beoordelingsschalen om abnormale bewegingen en houdingen bij muizen te classificeren. De meeste beschikbare motorische taken onthullen niet-specifieke afwijkingen, zoals achterpootsluiting, wat een bekend fenomeen is in veel muismodellen van bewegingsstoornissen met neurodegeneratie18,19. Voor de juiste karakterisering van een fenotype is het echter noodzakelijk om te analyseren of het muismodel de meest opvallende kenmerken van de ziekte samenvat. Hierin presenteren we de aangepaste versie van een dystonie rating schaal die eerder werd gebruikt voor de beoordeling van motorische handicap in dystonie muis modellen15,16. Daarnaast ontwikkelden we een op waarnemer gebaseerd scoresysteem voor de staartsuspensietest, die op dezelfde manier werd vastgesteld als de klinische beoordelingsschalen van menselijke dystonie. Beide ratingschalen vertonen een aanzienlijk hogere score bij door ouabain-perfused, gestreste muizen in vergelijking met door ouabain-perfused, niet-gestreste dieren en door voertuigen geperfundeerde dieren. De nadelen van elk op waarnemers gebaseerd scoresysteem zijn de noodzakelijke opleiding van beoordelaars om een consistente score te garanderen en de variabiliteit van de waarnemer te verminderen, alsmede het gevaar van een mogelijke vooringenomenheid van de rater, indien deze niet volledig verblind is voor de geanalyseerde groep. Echter, waarnemer-gebaseerde scoring systemen presenteren nog steeds een gemakkelijk toegankelijke methode om een fenotype te karakteriseren en kan worden aangepast aan de muis model geanalyseerd, zoals gedaan in het huidige project voor de beoordeling van dystonie-achtige bewegingen. Om een consistente score tussen de verschillende bepelaars te garanderen, moeten trainingsvideo's beschikbaar worden gesteld. Om eventuele vooroordelen te verminderen, wordt aanbevolen dat verschillende beoordelaars dezelfde videoclips scoren en dat de individuele scores gemiddeld zijn. Beide scoresystemen die in dit werk worden genoemd, registreren de aanwezigheid van dystonie-achtige bewegingen bij dieren. De classificatieschalen kunnen worden aangepast aan de specifieke vereisten binnen een project, zoals eerder gedaan door Ip et al., waar uitsluitend de achterpoten werden gescoord voor dystonie-achtige bewegingen in een muismodel voor dystonie 1 (DYT-TOR1A)20. De rating schalen kunnen worden aangevuld met andere eerder gepubliceerde scoring systemen, het beoordelen van bijvoorbeeld de mate van bradykinesia bij knaagdieren zoals gedaan met de locomotion invaliditeit score door Calderon et al.13.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door het Federale Ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF DysTract aan C.W.I.) en door het Interdisciplinair Centrum voor Klinisch Onderzoek (IZKF) van de Universiteit van Würzburg (Z2-CSP3 naar L.R.). De auteurs danken Louisa Frieß, Keali Röhm, Veronika Senger en Heike Menzel en voor hun technische bijstand en Helga Brünner voor de dierenverzorging.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.9% saline | Fresenius Kabi | PZN06178437 | |
| Alzet osmotic pumps | Durect | 4317 | model 1002, flowrate 0.25 μL/h |
| Anchor Screws | AgnTho's | MCS1x2 | 2 mm lang met een draad van 1 mm O.D. |
| Bulldog Clamps | AgnTho's | 13-320-035 | recht, 3,5 cm |
| Bupivacain 0.25% Jenapharm | mibe GmbH Arzneimittel | ||
| Cannula and Minipump Holder | Stoelting Co. | 51636 | ontworpen om 3,4 mm cannula-koppen te houden |
| Cannula Bifurcation | Plastics One | 21Y | op maat gemaakt |
| Cannula tubing | Plastics One | C312VT/PKG | vinyl, 0,69 mm x 1,14 mm |
| Dumont #5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | fijne pincetten |
| eye cream Bepanthen | Bayer Vital GmbH | ||
| Gas Anesthesia Mask for Stereotaxic, Mouse | Stoelting Co. | 56109M | |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| High Speed Rotary Micromotor Kit | Foredom | K.1070-2 | |
| Isoflurane CP 1 mL/mL, 250 mL | cp-pharma | 1214 | recept nodig |
| Isoflurane System Dräger Vapor 19.3 | Dr. Wilfried Müller GmbH | ||
| Kallocryl A/C | Speiko | 1615 | tandcement, vloeibaar |
| Kallocryl CPGM rot | Speiko | 1692 | tandcement, rode poeder |
| Mouse and neonates adaptor | Stoelting Co. | 51625 | adapter voor muizen voor een traditionele U-frame |
| needle holder | KLS Martin Group | 20-526-14 | |
| Non-Rupture Ear Bars and Rubber Tips f/ Mouse Stereotaxic | Stoelting Co. | 51649 | |
| Octenisept | Schülke | 118211 | |
| Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, double | Plastics One | 3280PD-3.0/SPC | 28 Gauge, lengte 4,0 mm, c/c afstand 3,0 mm |
| Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, single | Plastics One | 3280PM/SPC | 28, Gauge, op maat gemaakte lengte 3,0 mm |
| Ouabain octahydrate 250 mg | Sigma-Aldrich | 03125-250MG | VOORZICHTIG: giftig |
| Precision balance | Kern & Sohn | PFB 6000-1 | |
| Rectal Thermal Probe | Stoelting Co. | 50304 | |
| Rimadyl 50 mg/mL, injectable | Zoetis | Carprofen, recept nodig | |
| Rodent Warmer X1 with Mouse Heating Pad | Stoelting Co. | 53800M | |
| RotaRod Advanced | TSE Systems | ||
| screw driver set | AgnTho's | 30090-6 | |
| Stainless Steel Burrs | AgnTho's | HM71009 | 0,9 mm Ø boor |
| Stainless Steel Burrs | AgnTho's | HM71014 | 1,4 mm Ø boor |
| StereoDrive | Neurostar | software | |
| Stereotaxic instrument | Stoelting Co. | op maat gemaakt door Neurostar | |
| Stereotaxic robot | Neurostar | ||
| suture: coated vicryl, polyglatin 910 | Ethicon | V797D | |
| ThermoMixer C | Eppendorf AG | 5382000015 |
Referenties
- DeAndrade, M. P., Yokoi, F., van Groen, T., Lingrel, J. B., Li, Y. Characterization of Atp1a3 mutant mice as a model of rapid-onset dystonia with parkinsonism. Behavioural Brain Research. 216 (2), 659-665 (2011).
- Dang, M. T., et al. Generation and characterization of Dyt1 DeltaGAG knock-in mouse as a model for early-onset dystonia. Experimental Neurology. 196 (2), 452-463 (2005).
- Kreiner, G. Compensatory mechanisms in genetic models of neurodegeneration: are the mice better than humans. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 56(2015).
- Albanese, A., et al. Phenomenology and classification of dystonia: a consensus update. Movement Disorders. 28 (7), 863-873 (2013).
- Marsden, C. D., Obeso, J. A., Zarranz, J. J., Lang, A. E. The anatomical basis of symptomatic hemidystonia. Brain. 108, Pt. 2 463-483 (1985).
- Carbon, M., et al. Increased sensorimotor network activity in DYT1 dystonia: a functional imaging study. Brain. 133, Pt. 3 690-700 (2010).
- Carbon, M., Su, S., Dhawan, V., Raymond, D., Bressman, S., Eidelberg, D. Regional metabolism in primary torsion dystonia: effects of penetrance and genotype. Neurology. 62 (8), 1384-1390 (2004).
- de Carvalho Aguiar, P., et al. Mutations in the Na+/K+ -ATPase alpha3 gene ATP1A3 are associated with rapid-onset dystonia parkinsonism. Neuron. 43 (2), 169-175 (2004).
- Brashear, A., et al. The phenotypic spectrum of rapid-onset dystonia-parkinsonism (RDP) and mutations in the ATP1A3 gene. Brain. 130 (3), 828-835 (2007).
- Barbano, R. L., et al. New triggers and non-motor findings in a family with rapid-onset dystonia-parkinsonism. Parkinsonism & Related Disorders. 18 (6), 737-741 (2012).
- Isaksen, T. J., et al. Hypothermia-induced dystonia and abnormal cerebellar activity in a mouse model with a single disease-mutation in the sodium-potassium pump. PLOS Genetics. 13 (5), 1006763(2017).
- Sugimoto, H., Ikeda, K., Kawakami, K. Heterozygous mice deficient in Atp1a3 exhibit motor deficits by chronic restraint stress. Behavioural Brain Research. 272, 100-110 (2014).
- Calderon, D. P., Fremont, R., Kraenzlin, F., Khodakhah, K. The neural substrates of rapid-onset Dystonia-Parkinsonism. Nature Neuroscience. 14 (3), 357-365 (2011).
- Cutsforth-Gregory, J. K., et al. Repetitive exercise dystonia: A difficult to treat hazard of runner and non-runner athletes. Parkinsonism & Related Disorders. 27, 74-80 (2016).
- Pizoli, C. E., Jinnah, H. A., Billingsley, M. L., Hess, E. J. Abnormal Cerebellar Signaling Induces Dystonia in Mice. The Journal of Neuroscience. 22 (17), 7825-7833 (2002).
- Jinnah, H. A., et al. Calcium channel agonists and dystonia in the mouse. Movement Disorders. 15 (3), 542-551 (2000).
- Rauschenberger, L., Knorr, S., Al-Zuraiqi, Y., Tovote, P., Volkmann, J., Ip, C. W. Striatal dopaminergic dysregulation and dystonia-like movements induced by sensorimotor stress in a pharmacological mouse model of rapid-onset dystonia-parkinsonism. Experimental Neurology. 323, 113109(2020).
- Fernagut, P. O., Diguet, E., Bioulac, B., Tison, F. MPTP potentiates 3-nitropropionic acid-induced striatal damage in mice: reference to striatonigral degeneration. Experimental Neurology. 185 (1), 47-62 (2004).
- Guyenet, S. J., et al. A simple composite phenotype scoring system for evaluating mouse models of cerebellar ataxia. Journal of Visualized Experiments. 39, 1787(2010).
- Ip, C. W., et al. Tor1a+/- mice develop dystonia-like movements via a striatal dopaminergic dysregulation triggered by peripheral nerve injury. Acta Neuropathologica Communications. 4, 108(2016).
Herprints en machtigingen
