Het verkennen van vetweefselstructuur door methylsalicylaatcle clearing en 3D-beeldvorming

Summary

Hier beschrijven we een eenvoudige, goedkope en snelle clearing methode om de 3D-structuur van zowel muis- als menselijk wit vetweefsel op te lossen met behulp van een combinatie van markers om vasculatuur, kernen, immuuncellen, neuronen en lipidedruppelcoateiwitten te visualiseren door fluorescerende beeldvorming.

Abstract

Obesitas is een belangrijk wereldwijd probleem op het gebied van de volksgezondheid dat het risico op het ontwikkelen van hart- en vaatziekten, diabetes type-2 en leverziekten verhoogt. Obesitas wordt gekenmerkt door een toename van vetweefsel (AT) massa als gevolg van adipocyte hyperplasie en / of hypertrophia, wat leidt tot een grondige verbouwing van de driedimensionale structuur. Inderdaad, de maximale capaciteit van AT om uit te breiden tijdens obesitas is cruciaal voor de ontwikkeling van obesitas-geassocieerde pathologieën. Deze AT-expansie is een belangrijk homeostatisch mechanisme om aanpassing aan een overmaat aan energie-inname mogelijk te maken en om schadelijke lipide-overloop naar andere metabole organen, zoals spieren en lever, te voorkomen. Daarom is het begrijpen van de structurele verbouwing die leidt tot het falen van AT-expansie een fundamentele vraag met een hoge klinische toepasbaarheid. In dit artikel beschrijven we een eenvoudige en snelle clearingmethode die routinematig wordt gebruikt in ons laboratorium om de morfologie van muis en menselijk wit vetweefsel te verkennen door fluorescerende beeldvorming. Deze geoptimaliseerde AT clearing methode is gemakkelijk uit te voeren in elk standaard laboratorium uitgerust met een chemische kap, een temperatuurgecontroleerde orbitale shaker en een fluorescerende microscoop. Bovendien zijn de gebruikte chemische verbindingen direct beschikbaar. Belangrijk is dat deze methode het mogelijk maakt om de 3D AT-structuur op te lossen door verschillende markers te bevlekken om specifiek de adipocyten, de neuronale en vasculaire netwerken en de aangeboren en adaptieve immuuncellenverdeling te visualiseren.

Introduction

Obesitas wordt gekenmerkt door een toename van vetweefsel massa en is uitgegroeid tot een belangrijke wereldwijde volksgezondheid probleem, gezien het feit dat mensen met obesitas hebben een verhoogd risico op het ontwikkelen van hart-en vaatziekten, type-2 diabetes, leverziekten en sommige vormen van kanker.

Een fundamentele fysiologische functie van vetweefsel is het moduleren van lichaam-lichaam glucose en lipide homeostase^1,2. Tijdens de voederperiode slaan de adipocyten (d.w.z. de belangrijkste cellen van het vetweefsel) het teveel aan glucose en lipiden op die door een maaltij....

Protocol

Dit protocol werd getest en is gevalideerd voor alle muis- en menselijke witte vetweefseldepots. Menselijke en muisvetweefsels werden dienovereenkomstig verzameld aan Europese wetten en goedgekeurd door Franse en Zweedse Ethische commissies.

1. Fixatie van muis en menselijk wit vetweefsel

1. Dompel de geoogste muis of menselijke witte vetweefsels onder in ten minste 10 mL PBS met 4% paraformaldehyde (PFA) in een plastic buis van 15 mL.
2. Schud de plastic buis bij kamertemperatuur op een rolplaat gedurende 1 uur.
3. Laat de plastic buis 's nachts op een rolplaat op een rolplaat staan om de fixatie te voltooien.
   OPMER....

Results

Met behulp van de procedure hier beschreven en samengevat in figuur 1, waren we in staat om vlekken en optisch duidelijk menselijke en muis wit vetweefsel zoals gepresenteerd in figuur 2A en figuur 2B, respectievelijk. Het gerooide weefsel werd overgebracht naar de metalen beeldkamer om confocale beeldvorming uit te voeren(figuur 3A). De clearing drastisch verbeterd de diepte van het weefsel beelden die.......

Discussion

De wijzigingen die zich voordoen in het vetweefsel in de loop van pathologische progressie, zoals die van obesitas, is fundamenteel voor het begrip van de mechanismen achter de pathologie. Baanbrekende studies die dergelijke mechanismen in vetweefsel aan het licht brachten, zijn gebaseerd op globale benaderingen zoals gehele vetweefselproteomics²¹, flow cytometrie^22,23en transcriptomics^24,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microtubes	Eppendorff tubes - Dutscher	33528
15 mL plastic tubes	Falcon tubes - Dutscher	352096
18 mm round glass coverslip	Mariendfeld	0117580
20 mL glass bottle	Wheaton	986546
anti-mouse-alexa647-conjugated antibody	Jackson ImmunoResearch	715-605-150	Dilution: 1/100
anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody	Jackson ImmunoResearch	711-605-152	Dilution: 1/100
BSA	Sigma-aldrich	A6003
CD301-PE antibody	Biolegend	BLE145703	Dilution: 1/100
CD31 antibody	AbCam	ab215912	Dilution: 1/50
Commercial 3D analysis software - IMARIS	Oxford instrument		with Cell module
Confocal microscope - Nikon A1R	Nikon
Dapi	ThermoFisher	D1306	Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000
Deoxycholate	Sigma-aldrich	D6750
DMSO	Sigma-aldrich	D8418
Glut4 antibody	Santa Cruz	sc-53566	Dilution: 1/50
Glycine	Sigma-aldrich	G7126
Lectin-DyLight649	Vector Lab	DL-1178-1	Stock Concentration : 2 µg/µL; IV Injection: 50 µL/mice
Metallic imaging chamber equipped with glass bottom - AttoFluor Chamber	Thermofisher	A7816
Methyl salicylate	Sigma-aldrich	M6752
Perilipin antibody	Progen	651156	Dilution: 1/50
Phalloidin-alexa488	ThermoFisher	A12379	Dilution: 1/100
TCR-β-PB antibody	Biolegend	BLE109225	Dilution: 1/100
TH antibody	AbCam	ab112	Dilution: 1/50
Triton X100	Sigma-aldrich	X100
Tween-20	Sigma-aldrich	P416