Methodenartikel

Het verkennen van vetweefselstructuur door methylsalicylaatcle clearing en 3D-beeldvorming

DOI:

10.3791/61640

⸱

19 augustus 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Université Côte d'Azur, Inserm UMR1065, C3M, Team "Cellular and Molecular Pathophysiology of Obesity", Nice, France, 2Integrated Cardio Metabolic Center, Department of Medicine, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden, 3Université Côte d'Azur, Inserm UMR1065, C3M, Team "Haematometabolism in Diseases", Nice, France, 4Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale (IPBS), Université de Toulouse, CNRS, UPS, Toulouse, France

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een eenvoudige, goedkope en snelle clearing methode om de 3D-structuur van zowel muis- als menselijk wit vetweefsel op te lossen met behulp van een combinatie van markers om vasculatuur, kernen, immuuncellen, neuronen en lipidedruppelcoateiwitten te visualiseren door fluorescerende beeldvorming.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obesitas is een belangrijk wereldwijd probleem op het gebied van de volksgezondheid dat het risico op het ontwikkelen van hart- en vaatziekten, diabetes type-2 en leverziekten verhoogt. Obesitas wordt gekenmerkt door een toename van vetweefsel (AT) massa als gevolg van adipocyte hyperplasie en / of hypertrophia, wat leidt tot een grondige verbouwing van de driedimensionale structuur. Inderdaad, de maximale capaciteit van AT om uit te breiden tijdens obesitas is cruciaal voor de ontwikkeling van obesitas-geassocieerde pathologieën. Deze AT-expansie is een belangrijk homeostatisch mechanisme om aanpassing aan een overmaat aan energie-inname mogelijk te maken en om schadelijke lipide-overloop naar andere metabole organen, zoals spieren en lever, te voorkomen. Daarom is het begrijpen van de structurele verbouwing die leidt tot het falen van AT-expansie een fundamentele vraag met een hoge klinische toepasbaarheid. In dit artikel beschrijven we een eenvoudige en snelle clearingmethode die routinematig wordt gebruikt in ons laboratorium om de morfologie van muis en menselijk wit vetweefsel te verkennen door fluorescerende beeldvorming. Deze geoptimaliseerde AT clearing methode is gemakkelijk uit te voeren in elk standaard laboratorium uitgerust met een chemische kap, een temperatuurgecontroleerde orbitale shaker en een fluorescerende microscoop. Bovendien zijn de gebruikte chemische verbindingen direct beschikbaar. Belangrijk is dat deze methode het mogelijk maakt om de 3D AT-structuur op te lossen door verschillende markers te bevlekken om specifiek de adipocyten, de neuronale en vasculaire netwerken en de aangeboren en adaptieve immuuncellenverdeling te visualiseren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obesitas wordt gekenmerkt door een toename van vetweefsel massa en is uitgegroeid tot een belangrijke wereldwijde volksgezondheid probleem, gezien het feit dat mensen met obesitas hebben een verhoogd risico op het ontwikkelen van hart-en vaatziekten, type-2 diabetes, leverziekten en sommige vormen van kanker.

Een fundamentele fysiologische functie van vetweefsel is het moduleren van lichaam-lichaam glucose en lipide homeostase1,2. Tijdens de voederperiode slaan de adipocyten (d.w.z. de belangrijkste cellen van het vetweefsel) het teveel aan glucose en lipiden op die door een maaltijd in triglyceriden worden verstrekt. Tijdens het vasten breken de adipocyten de triglyceriden af in niet-gestreelde vetzuren en glycerol om de energievraag van het lichaam te ondersteunen. Tijdens de ontwikkeling van obesitas breidt vetweefsel uit door de grootte (hypertrophia) en/of het aantal (hyperplasie) van adipocyten1te vergroten, om hun opslagcapaciteit te vergroten. Wanneer de expansie van vetweefsel zijn limiet bereikt, een constante zeer variabele bij patiënten, de resterende lipiden accumuleert in andere metabole organen, waaronder spieren en lever3,4, wat leidt tot hun functionele falen en het initiëren van obesitas-gerelateerde cardio-metabole complicaties1,5. Daarom is het identificeren van de mechanismen die de expansie van vetweefsel regelen een belangrijke klinische uitdaging.

De morfologische modificaties gedocumenteerd in vetweefsels tijdens obesitas zijn gekoppeld aan zijn pathologische disfunctie. Verschillende kleuringsprocedures zijn gebruikt om de weefselorganisatie van het vetweefsel te beschrijven, waaronder actine6, vasculaire markers7, lipidedruppelmarkers8en specifieke immuuncelmarkers9,10. Vanwege de enorme diameter van adipocyten (50 tot 200 μm)11is het echter essentieel om een groot deel van het hele weefsel in drie dimensies te analyseren om de dramatische structurele AT-veranderingen die tijdens obesitas worden waargenomen, nauwkeurig te analyseren. Omdat het licht echter geen ondoorzichtig weefsel binnendringt, is beeldvorming in 3D binnen een groot weefselmonster met behulp van fluorescentiemicroscopie niet mogelijk. Methoden van weefselclearing om ze transparant te maken zijn gemeld in de literatuur (voor een onderzoek, zie12) waardoor men weefsels kan wissen en diepgaande, hele weefselfluorescentiemicroscopie kan uitvoeren. Deze methoden bieden ongekende mogelijkheden om de 3D cellulaire organisatie in gezond en ziek weefsel te beoordelen. Elk van de beschreven methoden hebben voor- en nadelen en moet daarom zorgvuldig worden geselecteerd, afhankelijk van het bestudeerde weefsel (zie13). Sommige benaderingen vereisen immers een lange incubatietijd en/of het gebruik van materialen of verbindingen die duur, giftig of moeilijk te verkrijgen zijn14,15,16,17,18,19. Profiterend van een van de eerste verbindingen die werner Spalteholz een eeuw geleden gebruikte om weefsels20te wissen, hebben we een gebruiksvriendelijk en goedkoop protocol opgezet dat zeer goed is aangepast voor het opruimen van alle muis- en menselijke vetweefseldepots in elk laboratorium met typische apparatuur, waaronder een chemische kap, een temperatuurgecontroleerde orbitale shaker en een confocale microscoop.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol werd getest en is gevalideerd voor alle muis- en menselijke witte vetweefseldepots. Menselijke en muisvetweefsels werden dienovereenkomstig verzameld aan Europese wetten en goedgekeurd door Franse en Zweedse Ethische commissies.

1. Fixatie van muis en menselijk wit vetweefsel

  1. Dompel de geoogste muis of menselijke witte vetweefsels onder in ten minste 10 mL PBS met 4% paraformaldehyde (PFA) in een plastic buis van 15 mL.
  2. Schud de plastic buis bij kamertemperatuur op een rolplaat gedurende 1 uur.
  3. Laat de plastic buis 's nachts op een rolplaat op een rolplaat staan om de fixatie te voltooien.
    OPMERKING: Dit protocol is aangepast voor grote vetweefselmonsters, zoals hele epididymale vetpads verkregen van muizen die een normaal dieet (≈250 mg - ≈0,6 cm3) kregen. Voor grotere monsters zoals epididymale vetpads verkregen van muizen gevoed een vetrijk dieet (≈1,5 g - ≈4 cm3) of menselijke vetweefsel monsters, hoewel het clearingprotocol perfect zou moeten werken voor het hele monster (door de PFA en de antilichaammengsels op te schalen), snijden we in het algemeen weefselstukken rond 1 g (≈2,5 cm3)om de resterende monsters te reserveren voor extra kleuring of toepassingen. Voor de PFA (stap 1.1.) raden we aan om ongeveer 10 keer het volume van het weefsel te gebruiken. Voor de antilichaammengsels (stappen 3.1. en 3.4.) verhoog het volume om het weefsel volledig onder te dompelen en gebruik een plastic buis van 15 mL (zie tabel met materialen)als het weefsel te groot is voor een plastic microtube van 1,5 mL (zie tabel met materialen).

2. Permeabilisatie en verzadiging van muis- en menselijk wit vetweefsel

  1. Spoel het vaste witte vetweefsel in 10 mL PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om alle sporen van PFA te verwijderen.
  2. Dompel het weefsel onder in een 15 mL plastic buis met 10 mL PBS aangevuld met 0,3% glycine (zie tabel van materialen)en schud de buis bij kamertemperatuur in een orbitale shaker voor 1 uur bij 100 omwentelingen per minuut (rpm) om de resterende vrije aldehyde groepen te blussen.
  3. Dompel het weefsel onder in een 15 mL plastic buis met 10 mL PBS aangevuld met 0,2% Triton X-100 (zie Tabel van Materialen)en schud de buis bij 37 °C in een temperatuurgecontroleerde orbitale shaker gedurende 2 uur bij 100 rpm.
  4. Dompel het weefsel onder in een 15 mL plastic buis met 10 mL PBS aangevuld met 0,2% Triton X-100 en 20% DMSO (zie Tabel van Materialen)en schud de buis bij 37 °C in een temperatuurgecontroleerde orbitale shaker bij 100 rpm 's nachts.
  5. Dompel het weefsel onder in een 15 mL plastic buis met 10 mL PBS aangevuld met 0,1% Tween-20 (zie tabel met materialen),0,1% Triton X-100, 0,1% deoxycholaat (zie tabel met materialen)en 20% DMSO en schud de buis bij 37 °C in een temperatuurgestuurde orbitale shaker bij 100 tpm gedurende ten minste 24 uur.
  6. Spoel het weefsel in een 15 mL plastic buis met 10 mL PBS aangevuld met 0,2% Triton X-100 en schud de buis bij kamertemperatuur in een orbitale shaker bij 100 rpm gedurende 1 uur.
  7. Dompel het weefsel onder in een 15 mL plastic buis met 10 mL PBS aangevuld met 0,2% Triton X-100, 10% DMSO en 3% BSA (zie Tabel van materialen)en schud de buis bij 37 °C in een temperatuurgecontroleerde orbitale shaker bij 100 rpm voor 12 uur, om alle sites te verzadigen die specifiek antilichamen konden binden.
    OPMERKING: In stap 2.7 kan de BSA worden vervangen door bloedserum van de soorten van het gebruikte secundaire antilichaam.

3. Kleuringsprocedure voor muis- en menselijk wit vetweefsel

  1. Breng het weefsel over in een plastic microbuis van 1,5 mL met 300 μL PBS, aangevuld met 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 3% BSA en de primaire antilichamen (10x meer geconcentreerd dan voor cryosection-vlekken, maar optimale concentratie van antilichamen moet voor elk antilichaam worden geëvalueerd). Bescherm de buis tegen licht door de bekleding met aluminiumfolie en schud de buis bij 37 °C in een temperatuurgestuurde orbitale shaker bij 100 tpm gedurende ten minste twee dagen (zie de noot in stap 1.1 en stap 3.7.1).
  2. Spoel het weefsel in een 15 mL plastic buis met 10 mL PBS aangevuld met 0,2% Triton X-100, 10% DMSO en 3% BSA en schud de buis beschermd tegen licht bij 37 °C in een temperatuurgecontroleerde orbitale shaker bij 100 rpm gedurende 5 uur. Voer deze stap twee keer uit.
  3. Spoel het weefsel in een 15 mL plastic buis met 10 mL PBS aangevuld met 0,2% Triton X-100, 10% DMSO en 3% BSA en schud de buis, beschermd tegen licht, bij 37 °C in een temperatuurgecontroleerde orbitale shaker bij 100 tpm gedurende een nacht tot twee dagen.
  4. Breng het weefsel over op een 1,5 mL plastic microbuis met 300 μL PBS aangevuld met 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 3% BSA en de secundaire antilichamen (10x meer geconcentreerd dan voor cryosection vlekken). Bescherm de buis tegen licht door de bekleding met aluminiumfolie en schud de buis bij 37 °C in een temperatuurgestuurde orbitale shaker bij 100 tpm gedurende ten minste twee dagen (zie de noot in stap 1.1 en stap 3.7.1).
  5. Spoel het weefsel in een 15 mL plastic buis met 10 mL PBS aangevuld met 0,2% Triton X-100, 10% DMSO en 3% BSA en schud de buis, beschermd tegen licht, bij 37 °C in een temperatuurgestuurde orbitale shaker bij 100 tpm gedurende 5 uur. Voer deze stap twee keer uit.
  6. Spoel het weefsel in een 15 mL plastic buis met 10 mL PBS aangevuld met 0,2% Triton X-100, 10% DMSO en 3% BSA en schud de buis, beschermd tegen licht, bij 37 °C in een temperatuurgestuurde orbitale shaker bij 100 tpm gedurende een nacht tot twee dagen.
  7. Spoel het weefsel in een 15 mL plastic buis met 10 mL PBS en schud de buis, beschermd tegen licht, bij 37 °C in een temperatuurgecontroleerde orbitale shaker bij 100 tpm gedurende 2 uur.
    OPMERKING: Voor de etikettering van specifieke structuren zoals kernen of actine moet bij stap 3.1 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI of gelijkwaardig) en/of fluorescerend geëtiketteerd worden toegevoegd. wanneer alleen fluorescerend geëtiketteerde primaire antilichamen worden gebruikt, of bij stap 3.4. wanneer secundaire antilichamen worden gebruikt.
    OPMERKING: Voor de kleuringsprocedure kunnen primaire antilichamen die al zijn geconjugeerd met fluorchromen (zoals die worden gebruikt voor stroomcytometrie) worden gebruikt en we raden het aan voor de winst van tijd en specificiteit. Zelfs als de primaire antilichamen van muizen kunnen worden gebruikt gevolgd door secundaire antimuisantilichamen, zoals we het hier hebben aangetoond, hebben we vaak niet-specifieke kleuring van bloedvaten waargenomen als gevolg van circulerende immunoglobuline. Daarom, om dit probleem te voorkomen, primaire antilichamen die al zijn geëtiketteerd zijn sterk aanbevolen en hier leveren we bewijs dat de antilichamen die worden gebruikt in flow cytometrie compatibel zijn met onze procedure. In het specifieke geval van een antigeen dat op lage niveaus wordt uitgedrukt, is echter een signaalversterkingsstap via secundaire antilichamen verplicht; wanneer het enige beschikbare primaire antilichaam bij de muis wordt gemaakt, kan een hartperfusie van de muizen met PBS gedurende ten minste 5 minuten bij het offer een groot deel van de circulerende immunoglobuline en dus de niet-specifieke kleuring verwijderen.

4. Clearing procedure voor muis en menselijk wit vetweefsel

  1. Dompel het weefsel onder in een 15 mL plastic buis met 10 mL ethanol van 50% en schud de buis, beschermd tegen licht, bij kamertemperatuur in een orbitale shaker bij 100 rpm gedurende 2 uur.
  2. Dompel het weefsel onder in een 15 mL plastic buis met 10 mL ethanol van 70% en schud de buis, beschermd tegen licht, bij kamertemperatuur in een orbitale shaker bij 100 rpm gedurende 2 uur.
  3. Dompel het weefsel onder in een 15 mL plastic buis met 10 mL ethanol van 95% en schud de buis, beschermd tegen licht, bij kamertemperatuur in een orbitale shaker bij 100 rpm gedurende 2 uur.
  4. Dompel het weefsel onder in een 15 mL plastic buis met 10 mL ethanol van 100% en schud de buis, beschermd tegen licht, bij kamertemperatuur in een orbitale shaker bij 100 rpm gedurende 2 uur.
  5. Dompel het weefsel onder in een 15 mL plastic buis met 10 mL ethanol van 100% ethanol en schud de buis, beschermd tegen licht, bij kamertemperatuur in een orbitale shaker bij 100 rpm 's nachts.
  6. Dompel het weefsel onder in een glazen fles van 20 mL met een plastic dop (zie tabel met materialen) met 5 mL methyylsalicylaat (zie tabel van materialen)onder een chemische kap en schud de glazen container, beschermd tegen licht, bij kamertemperatuur in een orbitale shaker bij 100 rpm gedurende ten minste 2 uur.
    OPMERKING: De clearingprocedure kan aanzienlijk worden versneld (indien nodig) door stap 4.3 te vermijden. en 4.5., hoewel de uiteindelijke clearing kwaliteit zou iets worden verminderd.

5.3D-confocale beeldvorming van gewist wit vetweefsel

  1. Breng het weefsel over naar een metalen beeldkamer voorzien van een glazen bodem (zie tabel met materialen)onder een chemische kap en vul de kamer met verse methyylsalicylaat.
    OPMERKING: Om het weefsel op zijn plaats te krijgen en zo te voorkomen dat het in de kamer zweeft of zijwaarts beweegt, breng je meerdere ronde glazen covers van 18 mm (zie tabel van materialen)aan bovenop het weefsel bij het monteren in de kamer.
  2. Plaats de beeldkamer op een omgekeerde confocale microscoop.
  3. Beeld het weefsel met behulp van een lage vergroting doelstelling (bijvoorbeeld, 4x doelstelling) om een paar cm3 3D-kaarten van het hele vetweefsel of van het menselijk weefsel monster te genereren.
  4. Selecteer verschillende gebieden voor de weefselbemonstering bij een hogere vergroting. Gebruik doorgaans een 20x lange afstandsluchtdoelstelling die een goede verhouding biedt tussen resolutie en diepte. We verwerven grote mozaïekbeelden met z-stacks tussen 600 en 2000 μm diepte.
    OPMERKING: Gebruik een langeafstandsdoelstelling om dieper in het weefsel te beelden.

6. Extractie van kwantitatieve resultaten van de 3D-vetweefselbeelden

OPMERKING: De segmentatie van de verschillende structuren en de daaropvolgende extractie van de kwantitatieve informatie uit de 3D-image stack gegenereerd in punt 5 kan worden uitgevoerd met behulp van een van de vele bestaande image analysis software opties, hetzij commerciële of freeware. In de volgende punten beschrijven we een strategie die routinematig wordt gebruikt in ons laboratorium om kwantitatieve informatie te extraheren uit 3D-vetweefselafbeeldingen met behulp van commerciële software (zie Tabel van Materialen).

  1. Converteer de 3D-stacks op het softwareformaat naar vrijgemaakte geheugenruimte.
  2. Segmenteer de cellen.
    1. Open de celmodule van de software.
    2. Wijzig de instelling Celdetectie in plasmamembraanvlekken.
    3. Kies het fluorescerende kanaal van de marker die wordt gebruikt om de celperiferie af te bakenen (phalloïden die corticale actine- of plasmamembraanmarkeringen zoals F4/80 labelen voor macrofaag, TCR-β voor T-cellen of cluster van differentiatie-cd-eiwitten die specifiek zijn voor subtypen immuuncellen).
    4. Stel de drempelwaarden in en geef een bereik van verwachte celgrootte (d.w.z. 1 tot 200 μm voor celdetectie).
    5. Voer de segmentatie uit. Een volume dat overeenkomt met de z-stack wordt gegenereerd met de gesegmenteerde cellen met een andere kleur voor elk van de aangrenzende cellen.
    6. Pas statistische filters (grootte, rondheid, circulariteit, enz.) toe op het tabblad statistiek om segmentatieartefacten uit te sluiten en/of om de gesegmenteerde cellen te verfijnen op de cel van rente op basis van hun grootte (d.w.z. 20-200 μm voor adipocyten; 5-25 μm voor macrofagen; 1-3 μm voor lymfocyten).
    7. Haal metingen en kwantitatieve gegevens (volume, getal, grootte, diameter, enz.) uit het tabblad statistieken.
  3. Segmentaire componenten (kernen, vesicles, enz.) of vaten als structuur.
    OPMERKING: Hoewel de filamentsegmentatie erg handig is om de connectiviteit van de vaten te bestuderen, gebruiken we de segmentatie van de oppervlaktemodule om gegevens over de grootte, het volume en de diameters van de vaten te extraheren. De kwantificering van de afmetingen van de vaten gaat immers verloren bij het gebruik van de filamentenmodule.
    1. Open de Surface-module van de software.
    2. Selecteer het fluorescerende kanaal van de markering die wordt gebruikt om de subcellulaire component specifiek te labelen om deze in 3D te reconstrueren.
    3. Stel de drempels in en geef een bereik van de verwachte diametergrootte van de structuur (d.w.z. 0,5-5 μm voor kernen; 0-100 μm voor schepen; enz.).
    4. Voer de segmentatie uit. Er wordt een volume met de gesegmenteerde cellulaire structuur gegenereerd. Metingen en kwantitatieve gegevens (volume, aantal, grootte, diameter, enz.) kunnen worden geëxtraheerd uit het tabblad statistieken.
  4. Segmenteer de schepen als een buisair continuüm.
    OPMERKING: Hoewel de filamentsegmentatie erg handig is om de connectiviteit van de vaten te bestuderen, gebruiken we de segmentatie van de oppervlaktemodule om gegevens over de grootte, het volume en de diameters van de vaten te extraheren. De kwantificering van de afmetingen van de vaten gaat immers verloren bij het gebruik van de filamentenmodule.
    1. Open de Filaments module van de software.
    2. Selecteer het fluorescerende kanaal dat overeenkomt met de kleuring van het vat.
    3. Stel de drempelwaarden in voor de fluorescentieintensiteit en selecteer het juiste aantal verwachte verbindingsknooppunten.
    4. Voer de segmentatie uit. Filamenten die het scheepsnetwerk vertegenwoordigen, worden in 3D gegenereerd. Metingen kunnen worden gehaald uit het tabblad statistieken, zodat kwantitatieve gegevens kunnen worden verkrijgt, waaronder de lengte van het vaartuig, het aantal vertakkingen van schepen, enz.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van de procedure hier beschreven en samengevat in figuur 1, waren we in staat om vlekken en optisch duidelijk menselijke en muis wit vetweefsel zoals gepresenteerd in figuur 2A en figuur 2B, respectievelijk. Het gerooide weefsel werd overgebracht naar de metalen beeldkamer om confocale beeldvorming uit te voeren(figuur 3A). De clearing drastisch verbeterd de diepte van het weefsel beelden die...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De wijzigingen die zich voordoen in het vetweefsel in de loop van pathologische progressie, zoals die van obesitas, is fundamenteel voor het begrip van de mechanismen achter de pathologie. Baanbrekende studies die dergelijke mechanismen in vetweefsel aan het licht brachten, zijn gebaseerd op globale benaderingen zoals gehele vetweefselproteomics21, flow cytometrie22,23en transcriptomics24,

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen conflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door INSERM, Université Côte d'Azur, en door subsidies van het Franse Nationale Onderzoeksagentschap (ANR) via de Investments for the Future Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), het programma UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) via Academy 2 "Systèmes Complex academie 4 "Complexité et diversité du vivant", Fondation pour la Recherche Médical (Équipe FRM DEQ20180839587), en het Young Investigator Program naar J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). We danken ook de Imaging Core Facility van C3M gefinancierd door de Conseil Départemental des Alpes-Maritimes en de Région PACA, en die ook wordt ondersteund door het IBISA Microscopie en Imaging Platform Côte d'Azur (MICA). Wij danken Marion Dussot voor technische hulp bij weefselbereiding. Wij danken Abby Cuttriss, UCA International Scientific Visibility, voor het bewijs lezen van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL microtubesEppendorff tubes - Dutscher33528
15 mL plastic tubesFalcon tubes - Dutscher352096
18 mm ronde glazen dekglasMariendfeld0117580
20 mL glazen flesWheaton986546
anti-muis-alexa647-geconjugeerd antilichaamJackson ImmunoResearch715-605-150Verdunning: 1/100
anti-konijn-alexa647-geconjugeerd antilichaamJackson ImmunoResearch711-605-152Verdunning: 1/100
BSASigma-aldrichA6003
CD301-PE antilichaamBiolegendBLE145703Verdunning: 1/100
CD31 antilichaamAbCamab215912Verdunning: 1/50
Commerciële 3D analysesoftware - IMARISOxford instrumentmet Cell module
Confocal microscoop - Nikon A1RNikon
DapiThermoFisherD1306Voorraadconcentratie: 5 mg/mL; verdunning 1/1000
DeoxycholaatSigma-aldrichD6750
DMSOSigma-aldrichD8418
Glut4 antilichaamSanta Cruzsc-53566Verdunning: 1/50
GlycineSigma-aldrichG7126
Lectin-DyLight649Vector LabDL-1178-1Voorraadconcentratie: 2 µg/µL; IV-injectie: 50 µL/muis
Metalen beeldvormingskamer uitgerust met glazen bodem - AttoFluor ChamberThermofisherA7816
Methyl salicylaatSigma-aldrichM6752
Perilipin antilichaamProgen651156Verdunning: 1/50
Phalloidin-alexa488ThermoFisherA12379Verdunning: 1/100
TCR-β-PB antilichaamBiolegendBLE109225Verdunning: 1/100
TH antilichaamAbCamab112Verdunning: 1/50
Triton X100Sigma-aldrichX100
Tween-20Sigma-aldrichP416

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues. Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).
  2. Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E. Adiponectin, Leptin, and Fatty Acids in the Maintenance of Metabolic Homeostasis through Adipose Tissue Crosstalk. Cell Metabolism. 23 (5), 770-784 (2016).
  3. Mittendorfer, B. Origins of metabolic complications in obesity: adipose tissue and free fatty acid trafficking. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 14 (6), 535-541 (2011).
  4. Hammarstedt, A., Gogg, S., Hedjazifar, S., Nerstedt, A., Smith, U. Impaired Adipogenesis and Dysfunctional Adipose Tissue in Human Hypertrophic Obesity. Physiological Reviews. 98 (4), 1911-1941 (2018).
  5. Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders. Journal of Diabetes Research. 2015, 970375(2015).
  6. Vergoni, B., et al. DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
  7. Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).
  8. Zwick, R. K., et al. Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation. Nature Communication. 9 (1), 3592(2018).
  9. Zhang, L., et al. The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice. Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).
  10. Yang, H., et al. Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance. Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).
  11. Laforest, S., et al. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity. 25 (1), Silver Spring. 122-131 (2017).
  12. Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
  13. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  14. Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), e58271(2018).
  15. Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY. Journal of Visualized Experiments. (112), e540225(2016).
  16. Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Experimental & Molecular Medicine. 48 (12), 274(2016).
  17. Zhang, Y., et al. 3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy. Science Advances. 3 (8), 1700553(2017).
  18. Ke, M. T., Imai, T. Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB. Current Protocols in Neuroscience. 66, Unit 2 22(2014).
  19. Hahn, C., et al. High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO). Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368(2019).
  20. Spalteholz, W. Über das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Präparaten und Seine Theoretischen. Hierzel, S. , Leipzig. (1911).
  21. Shields, K. J., Wu, C. Differential Adipose Tissue Proteomics. Methods in Molecular Biology. 1788, 243-250 (2018).
  22. Bourlier, V., et al. Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages. Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).
  23. Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).
  24. Hill, D. A., et al. Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).
  25. Acosta, J. R., et al. Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 250(2017).
  26. Coppack, S. W. Adipose tissue changes in obesity. Biochemical Society Transactions. 33, Pt 5 1049-1052 (2005).
  27. Cancello, R., et al. Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss. Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).
  28. Cinti, S. Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ. Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).
  29. Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue. Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).
  30. Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (144), e59266(2019).
  31. Gustafsson, N., et al. Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations. Nature Communication. 7, 12471(2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Klaarmaken van vetweefsel3D beeldvormingfluorescentiemicroscopieconfocale microscopiefixatie van weefselpermeabilisatie met Triton X 100antilichaamkleuringbeeldvorming van het vasculaire netwerkadipocytmorfologie

Gerelateerde artikelen