Veelzijdig monsterintroductiesysteem met dubbele inlaat voor multi-mode inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie met één deeltje Analyse en validatie

Summary

Hier bieden we een protocol voor het gebruik van een dual-inlet-systeem voor inductief gekoppelde massaspectrometrie met één deeltje dat een standaard onafhankelijke karakterisering van nanodeeltjes mogelijk maakt.

Abstract

Metaalhoudende nanodeeltjes (NP) kunnen worden gekarakteriseerd met inductief gekoppelde plasmamassaspectrometers (ICP-MS) in termen van hun grootte en aantalconcentratie door gebruik te maken van de enkeldeeltjesmodus van het instrument (spICP-MS). De nauwkeurigheid van de meting is afhankelijk van de opstelling, de operationele omstandigheden van het instrument en specifieke parameters die door de gebruiker worden ingesteld. De transportefficiëntie van de ICP-MS is cruciaal voor de kwantificering van de NP en vereist meestal een referentiemateriaal met een homogene grootteverdeling en een bekende deeltjesaantalconcentratie.

Momenteel zijn NP-referentiematerialen slechts voor enkele metalen en in beperkte maten beschikbaar. Als deeltjes worden gekarakteriseerd zonder een referentiestandaard, kunnen de resultaten van zowel de grootte als het aantal deeltjes vertekend zijn. Daarom werd een opstelling met dubbele inlaat ontwikkeld voor het karakteriseren van nanodeeltjes met spICP-MS om dit probleem op te lossen. Deze opstelling is gebaseerd op een conventioneel introductiesysteem dat bestaat uit een pneumatische vernevelaar (PN) voor nanodeeltjesoplossingen en een microdruppelgenerator (μDG) voor ionische kalibratieoplossingen. Er werd een nieuwe en flexibele interface ontwikkeld om de koppeling van μDG, PN en het ICP-MS-systeem te vergemakkelijken. De interface bestaat uit beschikbare laboratoriumcomponenten en maakt de kalibratie, karakterisering van nanodeeltjes (NP) en reiniging van de opstelling mogelijk, terwijl het ICP-MS-instrument nog in werking is.

Er zijn drie onafhankelijke analysemodi beschikbaar voor het bepalen van de deeltjesgrootte en de aantalconcentratie. Elke modus is gebaseerd op een ander kalibratieprincipe. Terwijl modus I (tellen) en modus III (μDG) bekend zijn uit de literatuur, wordt modus II (gevoeligheid) alleen gebruikt om de transportefficiëntie te bepalen met behulp van anorganische ionische standaardoplossingen. Het is onafhankelijk van NP-referentiematerialen. Het hier beschreven μDG-gebaseerde inlaatsysteem garandeert superieure analytgevoeligheden en dus lagere detectielimieten (LOD). De bereikte grootteafhankelijke LOD's zijn minder dan 15 nm voor alle onderzochte NP (Au, Ag, CeO₂).

Introduction

Inductief gekoppelde plasmamassaspectrometers worden op grote schaal gebruikt om de grootte en het aantal NP in verschillende monsters en matrices te kwantificeren in de zogenaamde enkelvoudige deeltjesmodus ^1,2,3. De single particle-modus is een bewerking van het data-acquisitiesysteem met een korte integratie- of verblijftijd. Elke gemeten NP produceert een geïntegreerd signaal in dit tijdsinterval (gebeurtenis gemeten in tellingen per seconde: cps) als een adequate verdunning van de NP-suspensie werd gebruikt om dubbele gebeurtenissen te voorkomen. De kalibratiestandaard, evenals het monster, worden meestal in de ICP-MS geïntroduceerd via een conventioneel monsterinvoersysteem op basis van pneumatische verneveling (PN)⁴. Voorwaarde is echter dat het inbrengdebiet van het monster en de transportefficiëntie (η) moeten worden bepaald om de metaalmassa per NP nauwkeurig te kwantificeren en om hun aantalconcentratie in de suspensie te bepalen. De transportefficiëntie beschrijft de verhouding tussen de massa of het aantal deeltjes dat wordt geïnjecteerd en de massa (afvalinzamelingsmethode)) of het aantal deeltjes (telmethode) dat door de ICP-MS⁵ wordt gedetecteerd. De transportefficiëntie wordt meestal bepaald aan de hand van referentiematerialen op basis van nanodeeltjes⁵. De transporteigenschappen zijn echter afhankelijk van de structuur van de NP en omvatten eigenschappen zoals samenstelling en monsterdispergeermiddel. Andere beïnvloedende factoren zijn instrumentele parameters, zoals de opnamesnelheid van het monster, het gasdebiet van de vernevelaar, de verblijftijd en de totale meettijd.

Aangezien er slechts beperkte referentiematerialen voor nanodeeltjes beschikbaar zijn, kunnen de verkregen NP-analyseresultaten vertekend zijn als gevolg van verschillen in elementaire samenstelling tussen referentie- en monsterdeeltjes. Naast de beschikbaarheid van een beperkt aantal referentiematerialen vormt de detectie van meerdere deeltjesgebeurtenissen per verblijftijd van de detector een andere uitdaging. Dit kan ook van invloed zijn op de nauwkeurigheid van de te bepalen transportefficiëntie.

Om onafhankelijk te zijn van referentiematerialen, verdient idealiter een monsterinvoersysteem met een transportefficiëntie van bijna 100% de voorkeur. Tegelijkertijd kunnen bij gebruik van een laag volume in vergelijking met conventionele introductiesystemen hogere deeltjesconcentraties worden gebruikt. Zelfs als twee deeltjes dicht bij elkaar liggen, kunnen beide afzonderlijk worden gedetecteerd met het op μDG gebaseerde systeem.

De μDG is in staat om monodisperse druppels te genereren met een vast volume in het pL-bereik en is zeer geschikt voor dit doel 6,7,8,9. De μDG vergemakkelijkt de injectie van zowel ionische als deeltjesmonsters in verschillende oplosmiddelen in de ICP-MS. In het geval van ionische metaalmonsters wordt aangenomen dat de gegenereerde druppels op weg naar de ICP volledig zijn opgelost. Dienovereenkomstig verliest de druppel al het water en wordt er een deeltje gevormd uit het resterende zout. De diameter van dit deeltje is recht evenredig met de gebruikte concentratie. Zo kunnen zelfgemaakte referentiestandaarden van dezelfde matrix, massa en grootte, met variërende concentratie van de te onderzoeken ionische oplossing van het te onderzoeken NP, in eigen huis worden geproduceerd. Het volume van een druppel kan eenvoudig worden berekend op basis van de druppeldiameter gemeten door de μDG. Dit is niet mogelijk met een PN die een brede verdeling van druppels met verschillende diameters^10,11 produceert. Door de uniforme monsterintroductie bij een hoge transportefficiëntie van 100% van het μDG kan een hoge instrumentspecifieke analytgevoeligheid worden bereikt. Afhankelijk van de gebruikte matrix leidt dit tot lagere detectielimieten (LOD) van deeltjesmassa en -grootte in vergelijking met de resultaten van conventionele introductiesystemen op basis van PN¹². Door het ontwerp van de μDG kunnen monsters echter niet gemakkelijk worden uitgewisseld wanneer het ICP-MS-systeem nog in werking is. Tussen de metingen van verschillende monsters door moet de μDG worden gereinigd en vervolgens worden gespoeld met de monsteroplossing voor systeemstabilisatie. Bovendien is de tolerantie voor zware matrixmonsters niet in grote mate getest. Bovendien zou vanwege de extreem lage stroomsnelheden de analysetijd om tot goede statistieken te komen extreem lang zijn, wat het praktische nut ervan beperkt, als "echte" monsters, zoals bijvoorbeeld milieuwateren, zouden moeten worden geanalyseerd.

Om deze beperkingen te overwinnen, is de μDG eerder gebruikt in combinatie met een conventioneel pneumatisch vernevelingssysteem, dat de naam kreeg van een dubbel inlaatsysteem¹³. Door de kalibratiestandaarden met de μDG en de NP-suspensie via een pneumatische vernevelaar in de ICP-MS te introduceren, konden Ramkorun-Schmidt et al. profiteren van beide systemen¹³. Er werd een zeer nauwkeurige bepaling van de metaalmassafractie van Au en Ag NP bereikt, zonder dat de transportefficiëntie hoefde te worden bepaald. Met dit dubbele inlaatsysteem werden echter geen deeltjesaantalconcentraties bepaald. Ook het opschonen en uitlijnen van het μDG-systeem bemoeilijkte de toepasbaarheid voor routineanalyse.

In dit artikel stellen we een flexibele dubbele inlaatinterface voor voor het bepalen van de NP-deeltjesgrootte en de concentratie van het deeltjesaantal en demonstreren we de assemblage en het praktische gebruik ervan. Net als het systeem van Ramkorun-Schmidt et al. bestaat het uit zowel een μDG- als een PN-monsterinvoersysteem. We tonen aan dat het dubbele inlaatsysteem, in de huidige ontwikkelingsfase, de toepassing van drie onafhankelijke analysemethoden mogelijk maakt om metaalhoudende NP's te onderzoeken en te karakteriseren. Ons systeem met dubbele inlaat vereenvoudigt de kalibratieprocedure voor de bepaling van NP's en verbetert de analytische cijfers van verdienste, met name de nauwkeurigheid¹⁴. De inlaatsystemen maken een gemakkelijke monsteruitwisseling en reiniging van de μDG mogelijk, zelfs wanneer de ICP-MS nog in werking is, waardoor de totale analysetijd en het risico op verkeerde uitlijning worden verkort. Om de prestaties van het systeem te testen, worden goed gekarakteriseerde referentie-NP (60 nm AuNP – NIST 8013, 75 nm AgNP – NIST 8017) gebruikt voor methodevalidatie en vergelijkbaarheid.

Protocol

1. Montage van de introductieopstelling voor monsters met dubbele inlaat

OPMERKING: Details over verschillende onderdelen worden weergegeven in Tabel 1.

	Onderdelen
Deel 1	Glazen vrouwelijk bolvormig kogelgewricht met een schachtlengte van ongeveer 10 mm
	Glazen mannelijk kogelgewricht met ongeveer 10 mm schachtlengte
	Metalen T-stuk (afmetingen: 1/4 inch)
	Lijm van glas op metaal
	Twee klemmen voor bolvormige glasverbindingen
Deel 2	ICP-MS spuitkamer (voorgesteld type: impactparelspuitkamer, cyclonische spuitkamer of iets dergelijks)
	Pneumatische vernevelaar (aanbevolen type: concentrische vernevelaar)
	Klem
Deel 3	O-ring vrije kwarts fakkel
	Connector gasleiding gesloten uiteinde
	Gasleiding connector open uiteinde
	Geleidende en flexibele siliconen slang
Deel 4	Piëzo-elektrische microdruppelgeneratie-eenheid
Deel 5	Micro-druppel besturingseenheid

Tabel 1: Lijst van componenten die zijn gebruikt om de opstelling met dubbele inlaat op te bouwen.

1. Constructie van een T-stuk connectoreenheid (Figuur 1, Deel 1).
   OPMERKING: Dit deel verbindt het conventionele monsterinvoersysteem (stap 1.2) en de μDG-transporteenheid (stap 1.3).
   1. Plaats een mannelijk en vrouwelijk kogelgewricht in de tegenoverliggende openingen van een T-stukconnector.
   2. Zet de mannelijke en vrouwelijke kogelgewrichten vast met behulp van een glas-op-metaallijm (bijv. siliconenlijm).
   3. Sluit het vrouwelijke kogelgewricht met een klem aan op de injector van de ICP-MS.
2. Bevestiging van een conventioneel monsterinvoersysteem (Figuur 1, deel 2)
   OPMERKING: Dit onderdeel is aangesloten op de T-stuk connectoreenheid (stap 1.1)
   1. Combineer een ICP-MS spuitkamer met een pneumatische vernevelaar (PN), die in de gebruikte spuitkamer past.
   2. Gebruik een clamp om de spuitkameruitlaat aan te sluiten op het mannelijke kogelgewricht van de T-stukconnector (beschreven in stap 1.1).
      OPMERKING: De uitlaat van de spuitkamer is meestal uitgerust met een vrouwelijke kogelgewrichtconnector. De combinatie in figuur 1 bestaat uit een vernevelaar en een slagparelsproeikamer. In plaats van de impact-hielspuitkamer kunnen andere spuitkamers met een transportefficiëntie in het bereik van 2 tot 10% of hoger worden gebruikt.
3. Constructie van de transporteenheid voor microdruppels (Figuur 1, Deel 3)
   NOTITIE: Dit onderdeel verbindt de T-stuk-connectoreenheid (stap 1.1) en de μDG-eenheid (stap 1.4).
   1. Bevestig een demonteerbare kwartstoorts, waarvan de injectorbuis is verwijderd, aan een laboratoriumstandaard met de toortsinlaat aan de bovenkant met behulp van de juiste klemmen.
   2. Blokkeer de plasma-/hulpgasinlaat van de toorts door de gasconnectoren met gesloten uiteinde.
      OPMERKING: Het monster wordt met behulp van een peristaltische pomp naar de vernevelaar getransporteerd. Argongas wordt gebruikt voor het vernevelen van monsters in de spuitkamer en verder transport naar het plasma.
   3. Sluit een heliumgasleiding aan op de toorts via de koelgasinlaat met behulp van een geschikte gasconnector.
      OPMERKING: Het toegepaste heliumgas wordt gebruikt voor het oplossen van gegenereerde druppels en fungeert als een omhulselgas dat voorkomt dat de druppel in botsing komt met de wanden van de opstelling en om te voorkomen dat het ICP-MS-instrument zuurstof in de atmosfeer inbrengt, terwijl de monsterinlaatkop van de μDG moet worden verwijderd voor reiniging en monsteruitwisseling.
   4. Sluit een 30 cm lange geleidende en flexibele siliconenslang (d.w.z. 0,75 cm) met behulp van een adapter aan op het uitgangsuiteinde van de zaklamp (onderkant van de zaklamp).
   5. Sluit het onderste uiteinde van de siliconenslang aan op de T-stukconnectoreenheid door de flexibele siliconenslang over de resterende verticale metalen verbinding te strekken.
      OPMERKING: De flexibele siliconenslang maakt x-y-z tuning van het ICP-MS-instrument mogelijk met de aangesloten setup.
4. Aansluiting van de microdruppelgeneratie-eenheid en de besturingseenheid voor het genereren van microdruppels (Figuur 1, deel 4, deel 5)
   OPMERKING: Dit onderdeel is aangesloten op de μDG-transporteenheid (stap 1.3)
   1. Sluit de voorbereide μDG-eenheid aan op de microdruppeltransporteenheid door de μDG-kop in het monsterinlaatuiteinde van de toorts te steken.
   2. Sluit de voeding aan op de μDG-besturingseenheid.
      OPMERKING: De hier beschreven opstelling bestaat uit een in de handel verkrijgbare μDG-kop en μDG-voeding. Afhankelijk van de gebruikte μDG-kop moet de opstelling dienovereenkomstig worden aangepast.

2. Kwantificering van de druppelgrootte

1. Gebruik een stroboscooplamp en een CCD-camera (bijv. in een open configuratie, zie figuur 1 maatmeetconfiguratie) voor het maken van foto's van geproduceerde druppels door de μDG.
2. Kalibreer de CCD-camera door foto's te maken van een object van bekende grootte in het μm-bereik (bijv. koperdraad met een diameter van 150 μm).
3. Maak foto's van ten minste 1.000 druppels op de instellingen die voor het experiment zijn gebruikt (zie tabel 2).
4. Gebruik een geschikt grafisch softwareprogramma (zie Materiaaltabel) om de afbeeldingen met betrekking tot het object en de druppelgrootte in de volgende stappen te evalueren:
   1. Klik op Bestand en Openen om de afbeelding van het object te laden.
   2. Klik op afbeelding | Aanpassen | Drempel om het gebied van het object te definiëren door de schuifbalken te verplaatsen.
   3. Klik op Toepassen om de instellingen toe te passen.
   4. Klik op de knop Recht segment.
   5. Klik en houd de linkermuisknop ingedrukt om een lijn langs het object te trekken.
   6. Druk op Ctrl + M om de objectgrootte te meten.
   7. Meet de diameter van het object op 5 verschillende punten.
   8. Kopieer en plak de tabel "Resultaten" in een spreadsheetsoftware.
   9. Bereken het rekenkundig gemiddelde van de kolom "Lengte".
   10. Bereken de pixel-beeldverhouding (PAR): werkelijke objectgrootte (μm)/gemiddelde objectgrootte in de afbeelding (px).
   11. Klik op Bestand | Invoer | Afbeeldingsreeks om de afbeeldingen van de druppels te importeren en te laden.
   12. Klik op Rechthoekig en markeer de druppel van de eerste afbeelding.
   13. Klik met de rechtermuisknop op de muismat en kies Dupliceren om de druppels van de afbeeldingsreeks te scheiden van de rest van de afbeelding.
   14. Scheid de druppels van de achtergrond zoals gespecificeerd in stap 2.4.2.
   15. Klik op Proces | Binair | Eroderen om lichtreflecties op het druppeloppervlak te verwijderen.
   16. Klik op Proces | Binair | Verwijd om de stap "Erode" om te keren.
   17. Klik op Analyseren | Deeltjes analyseren | Ok om alle druppels te meten.
   18. Kopieer en plak de tabel "Samenvatting" of "Resultaat" in een spreadsheetsoftware.
   19. Bereken het rekenkundig gemiddelde van de frettendiameter in px.
   20. Gebruik de PAR om de diameter in μm om te zetten: frettendiameter in px/PAR.
       OPMERKING: De grootte van de druppels gevormd door de μDG varieert afhankelijk van de geselecteerde lengte en duur van de stroompuls die op het piëzo-element⁷ wordt toegepast.

3. Voorbereiding van het monster

1. Bereid een ionische kalibratieoplossing van de analyt die moet worden gemeten in het concentratiebereik van 0,2 tot 20 μg/L in verdund zuur (bijv. HCl (0,5 v/v), HNO₃ (3,5 v/v)).
2. Bereid een ionische oplossing voor de eenpuntskalibratie in het concentratiebereik tussen 1 en 10 μg/l in verdund zuur.
3. Bereid de NP-standaardsuspensies voor volgens de instructies van de fabrikant of interne protocollen.
   OPMERKING: In de stappen 3.3.1 – 3.3.4 wordt de voorbereiding van de NP-standaardsuspensies uitgelegd, waarbij Ag, Au,_{CeO 2} NP's als voorbeeld worden genomen.
   1. Bereid 10 ml 0,05 μg/L AuNP-oplossing voor de PN en 1 μg/L AuNP-oplossing in ultrapuur water voor μDG. Vortex voor 20-60s voor gebruik.
   2. Bereid 0,05 μg/l AgNP-oplossing voor de PN en 2 μg/l AgNP-oplossing, beide in ultrapuur water, voor μDG. Schud goed gedurende 20-60 seconden voordat u¹⁵ gebruikt.
   3. Bereid CeO₂ NP-oplossingen voor gebruik zoals eerder beschreven voor metaaloxiden^16,17.
   4. Bereid 0,05 μg/l CeO₂ NP-oplossing voor de PN en 1 μg/l-oplossing voor μDG.
      1. Weeg 25,6 mg/ml CeO₂ NP af in een glazen vat van 15 ml – 20 ml in totaal en voeg 10 ml 0,05 (v/v) BSA-oplossing toe, bereid in ultrapuur water.
      2. Gebruik een vingertopsonicator met een vermogen van 7.35 W om de deeltjesoplossing gedurende 309 s te homogeniseren.

4. Instrumentale stemming en parameters

1. Zorg ervoor dat de MDG-generator is uitgeschakeld en sluit de in stap 1 gebouwde sample-introductieopstelling met dubbele inlaat aan op de injector van het ICP-MS-instrument met een klem. Spoel het inlaatsysteem 5 – 10 minuten door met het vernevelingsgas (Ar) en het druppeltransportgas (He).
   OPMERKING: Het ICP-MS-instrument moet worden beschermd tegen het binnendringen van hoge zuurstofniveaus in de plasmakamer.
2. Sluit het druppeltransportgas (He) af en start het ICP-MS-systeem
3. Stem het instrument af in de meetmodus die men wil gebruiken met behulp van de standaard stemoplossing van het instrument die is gespecificeerd door de fabrikant van het ICP-MS-systeem.
   OPMERKING: Een standaard tuningoplossing bestaat uit bijvoorbeeld barium, cerium, indium, uranium, bismut, kobalt, lithium (alle 1 μg/L) in een mengsel van 2,5% (v/v) salpeterzuur en 0,5% (v/v) zoutzuur.
4. Bepaling van de opnamesnelheid van de PN door het monster.
   1. Vul een vat met 15 ml water.
   2. Weeg het vat.
   3. Sluit het vat aan op de slang van de PN.
   4. Start de peristaltische pomp door in de instrumentsoftware op de startknop van de peristaltische pomp te klikken.
   5. Start een timer van 5 minuten.
   6. Verwijder de opnameleiding precies na 5 minuten van het vat. Weeg het vat opnieuw.
   7. Bereken de monsteropnamesnelheid (ml/min) met behulp van de formule: vatgewicht vóór - vatgewicht na / tijdsduur.
5. Optimaliseer instrumentele parameters om de gevoeligheid van de analyt indien nodig te verbeteren, bijv. gasdebiet van de vernevelaar, bemonsteringsdiepte, plasmavermogen.
   OPMERKING: Zie Tabel 2 als een voorbeeld van instrumentele parameters die kunnen worden geoptimaliseerd in een ICP-MS-systeem.
6. Pas de He-gasstroom aan totdat een constante signaalsnelheid kan worden gedetecteerd als functie van de druppelvormingssnelheid.

Parameter	Waarde
ICP – lidstaten:
Plasma vermogen (W)	1600
Bemonstering diepte (mm)	4
Debieten (L min-1):
Hulpgas	0.65
Koelgas	14
Tijden (en)
Gegevensverkrijging(en)	1200
Verblijftijd(en)	0.01
Interface:
PN Opnamesnelheid van het monster (ml min-1)	0.21
Vernevelaar Gas (L min-1)	0.92
μDG:
Capillaire diameter (μm)	75
Dalingspercentage (Hz)	10
Hij make-up gas (L min-1)	0.27
Werking	Drievoudige puls
	Reeks 1	Reeks 2	Reeks 3
Spanning (V)	53	51	47
Puls breedte (μs)	20	25	12
Pulsvertraging (μs)	4	2	1

Tabel 2: Waarden van de gebruikte instrumentele parameters.

5. Multi-mode meting van nanodeeltjesmonsters

1. Bereid de μDG-besturingseenheid voor
   1. Zet de voedingsschakelaar van de μDG-besturingseenheid aan.
   2. Klik op Start op het eerste scherm om de besturingseenheid op te starten.
   3. Klik op Algemene instellingen om de pulsmodus te kiezen die u wilt gebruiken.
   4. Klik op de rechter grafische knop in de pulsmodus om de drievoudige pulsmodus te kiezen.
      OPMERKING: De instellingen voor de drievoudige pulsmodus worden gegeven in Tabel 2.
2. Bereid de μDG-eenheid voor
   1. Klik op Aan/Uit om de μDG te starten.
   2. Vul het monstervat met de te meten monsteroplossing.
   3. Sluit het monstervat aan op de μDG-eenheid.
   4. Gebruik een spuit van 10 ml om lucht door het vat en de μDG-eenheid te spoelen.
   5. Sluit de spuit aan op de spuitpoort op het monstercontainervat.
   6. Druk op de zuiger van de spuit totdat er een constante vloeistofstroom uit de μDG-kop komt.
   7. Houd de druk 10 s aan.
   8. Verwijder de spuit.
   9. Plaats de μDG-eenheid in de focuszone van de CCD-camera om de gevormde druppels te observeren.
   10. Sluit de CCD-camera aan op een pc of laptop.
   11. Start de CCD-camerasoftware om de gevormde druppels te observeren
   12. Klik op Start om een liveweergave van de druppels te krijgen.
   13. Observeer de constante druppelvorming.
   14. Plaats de μDG-kop op de omgekeerde toorts op het monsterinvoersysteem met dubbele inlaat.
3. Valideer zowel de μDG-eenheid als de PN voor elk element van belang door herhaalde meerpuntskalibraties te meten.
   OPMERKING: Gebruik voor ICP-MS-gegevensverzameling de software die bij het instrument hoort.
4. Bepaal het lineaire bereik van de meerpuntskalibratie door de experimentele gegevens te importeren in een spreadsheetsoftware.
   1. Bereken het rekenkundig gemiddelde van elk kalibratiepunt.
   2. Bepaal de snijpunt-, hellings- en correlatiecoëfficiënt.
      OPMERKING: Voor sp-ICP-MS moet de correlatiecoëfficiënt >0,99¹⁸ zijn.
5. Kies een concentratie binnen het lineaire bereik van de kalibratiecurves voor latere eenpuntskalibraties.
6. Volg de onderstaande stappen voor meting en validatie (door gebruik te maken van referentiematerialen zoals NIST 8012, NIST 8013 of NIST 8017 of vergelijkbaar) van de multi-mode nanomateriaalkwantificering (Figuur 2).
   1. Selecteer een nanodeeltje en een ionische standaard op basis van de analyt van interesse.
   2. Bereid de μDG-eenheid voor volgens 5.2 met een ionische standaardoplossing.
   3. Voeg een verdunde zuuroplossing (bijv. 0,5% v/v HCl) toe via de PN.
   4. Start de meting van het ICP-MS-systeem in de tijdopgeloste modus.
   5. Klik na 120 s op Aan/Uit om de μDG te stoppen en vervang de verdunde zuuroplossing bij de PN met de ionische standaard.
   6. Vervang na 330 s nogmaals de ionische standaard bij de PN door een verdunde zure oplossing.
   7. Verwijder ondertussen de μDG-eenheid uit de opstelling.
   8. Vervang het monstervat (glazen injectieflacon) van de μDG-eenheid door een vat met een verdunde zuuroplossing (bijv. 3,5% HNO₃) om de μDG-eenheid te reinigen.
      1. Vul een spuit van 10 ml met lucht.
      2. Sluit de spuit aan op de injectiepoort van de μDG-eenheid en leeg de spuit totdat er een vloeistofstraal uit de μDG-kop komt en houd de druk gedurende 30 s aan.
      3. Bereid de μDG voor zoals gespecificeerd in stap 5.2 met het NP-monster en bevestig de μDG-eenheid terug aan de opstelling op 510 s.
   9. Klik op Aan/Uit na 810 s om de μDG te stoppen.
   10. Vervang de verdunde zure oplossing bij de PN met het NP-monster en meet nog 300 s.
   11. Stop de meting na ca. 1.200 s.
   12. Reinig de μDG-eenheid zoals gespecificeerd in stap 5.5.8.

Figuur 2: Meetstrategie voor de kwantificering van multi-mode nanomaterialen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Gegevensanalyse

OPMERKING: Om alle berekeningsstappen te vereenvoudigen, is een bijbehorende spreadsheet opgesteld (zie aanvullend bestand).

1. Gebruik een spreadsheet of software die dataframes kan verwerken om de gegevens te verwerken en de gemeten gegevens te importeren. Plak de intensiteitswaarden van de gehele meting in de spreadsheetsoftware (opgenomen in het elektronische supplement) in kolom A, de gegevens worden gevisualiseerd. Voer alle benodigde experimentele parameters voor de berekening in de tabel "Invoerparameter" in.
2. Definieer de interessegebieden (ROI) voor μDG ionisch (I), PN ionisch (II), μDG NP (III) en PN NP (IV) door de juiste spreadsheetcellen te selecteren. Gebruik de grafiek in het voorbereide blad om de grenzen van de ROI's te definiëren en voer de waarden in de tabel 'Bepaling van het interessegebied' in (cellen C1:E7).
3. Kopieer en plak de gegevensset in een afzonderlijke kolom. Druk op de knop ROI kopiëren in het voorbereide blad om de meting op te splitsen in de vier ROI's (kolom M:P).
4. Bereken het rekenkundig gemiddelde van I en II.
5. Pas de iteratieve benadering toe op afzonderlijke deeltjes- of druppelsignalen en achtergrond voor III en IV.
   1. Bereken het rekenkundig gemiddelde en de standaarddeviatie van alle gemeten waarden.
   2. Bereken een limiet of afkapwaarde op basis van de gemiddelde waarde + 5*standaarddeviatie.
   3. Verwijder alle signalen die kleiner zijn dan de grenswaarde van III en IV met behulp van het commando Snijden op de geïdentificeerde deeltjessignalen. Gebruik Plakken om ze in een aparte kolom te plakken.
   4. Herhaal stap 1-3 totdat de gemiddelde waarde en standaarddeviatie constant zijn.
      OPMERKING: In de kolommen Q tot en met BD van het voorbereide blad wordt de iteratieve benadering van het scheiden van achtergrond- en deeltjessignalen vijf keer uitgevoerd.
6. Bereken het rekenkundig gemiddelde van de geïdentificeerde deeltjessignalen van III en IV.
7. Bereken de minimale detecteerbare deeltjesgrootte (_LOD-grootte - nm) voor μDG NP en PN NP aan de hand van de instrumentele detectielimiet van de analyt (LOD-tellingen), de analytgevoeligheid (S_C,ionisch – tellingen/(μg/L)), de opnamesnelheid van het monster (q_s – ml/min), de transportefficiëntie (η – relatieve eenheid) en de dichtheid van het bulkmateriaal (ρ – g/cm³):
   1. 
   2. 
8. Bereken de massa (m_a,p) en deeltjesgrootte (d - nm, ervan uitgaande dat de deeltjes bolvormig zijn) van geïdentificeerde deeltjessignalen voor μDG NP en PN NP volgens de drie toegepaste analysemodi door rekening te houden met de ionische metaalconcentratie van een standaardoplossing (c_a - μg/L) en de ionenflux in het plasma (tellingen/s):
   1. Massa:
   2. Grootte:
9. Bereken de specifieke transportefficiëntie van de analysemodi aan de hand van het aantal gedetecteerde deeltjes (q_p), de deeltjesconcentratie van het monster (c_{p, gebruikt} - 1/ml), de analytgevoeligheid van de PN en MDG (S_m,ionisch,PN, S_{m,ionisch,MDG} – tellingen/(μg/L)), het volume van de druppel (_V-druppel – pL), de verblijftijd (t_d – ms), de transportefficiëntie van de PN (η_PN), de transportefficiëntie van de μDG (η_μDG), de intensiteit van de ionische oplossingen gemeten door de PN en μDG ( I_{ionc, PN, I ionische, μDG} – tellingen) en de concentratie van de ionische oplossing die voor beide injectiesystemen wordt gebruikt (c_{ionisch, PN}, _μDG - μg/L):
   1. Modus I:
   2. Modus II:
   3. 
   4. 
   5. 
   6. 
10. Stel dat de transportefficiëntie van μDG gelijk is aan 1:¹⁹
    1. 
11. Bereken de deeltjesconcentratie van de geanalyseerde NP-oplossing door rekening te houden met het geïnjecteerde monstervolume tijdens de meting (_{geïnjecteerd} V):
    
    OPMERKING: In het voorbereide blad worden alle berekeningen automatisch uitgevoerd na het splitsen. De resultaten worden weergegeven in de tabel "Uitvoerparameters" (cellen BH7:BR35) en bevatten de hierboven beschreven formules, inclusief afzonderlijke berekeningsstappen.

Results

Figuur 3: Bepaling van de druppelgrootte met de CCD-camera. Kalibratie van de CCD-camera met een 150 μm koperdraad (A) en bepaling van de druppelgrootte na het omzetten van de verkregen druppelfoto's naar een binair kleurenbeeld (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Validatie van de dubbele inlaat-opstelling. Meerpuntskalibratie van het μDG (A) en PN (B) inlaatsysteem voor goud (Au), zilver (Ag) en cerium (Ce). De gebruikte concentratie in het bereik van 0,2 – 20 μg ^ml-1 wordt omgerekend, afhankelijk van de gebruikte experimentele omstandigheden, in massa per gedetecteerde gebeurtenis. De gepresenteerde gegevens zijn de gemiddelde waarden van drie onafhankelijke replicaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Afbeelding 5: Weergave van de meting voor de opstelling met dubbele inlaat. De kwantificering van CeO₂ NP met gekleurde balken zoals gedaan in figuur 2 voor de verschillende injectiestappen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Monster	Analyse modus /	Inlaat voor NP-monster	Inlaat voor kalibratiestandaarden	η	Ma, p	NP maat (d)	#NPs		Herstel (%)
	ηPN-bepaling			(%)	(f octies)	(NM)	(ml-1 x103)
Au 56 nm	Modus-I /	PN	PN: Au ionische en AuNP-standaarden	1.8 (0.1)	1.9 (0.5)	57.2 (4.3)	28.1 (0)		100
NIST 8013	Telmethode
	Modus-II /	PN	PN/μDG:	1.9 (0.1)	2 (0.4)	58 (3.6)	25.6 (1.6)		91
	Gevoeligheid Verhouding		Authentieke normen
	Modus-III /	μDG	μDG:	100	1.7 (0.2)	55 (2.4)	394.4 (29.3)		70
	ημDG = 1		Autonome standaard
Verwachte grootte (nm)						56.0 (0.5)
Ag 75 nm	Modus-I /	PN	PN: Agionische en AgNP-normen	2.3 (0.2)	1.9 (0.2)	70.2 (2.3)	21.6 (0)		100
NIST 8017	Telmethode
	Modus-II /	PN	PN/μDG:	2.5 (0.2)	2 (0.2)	71.5 (2.1)	20.5 (1.9)		95
	Gevoeligheid Verhouding		Agionische normen
	Modus-III /	μDG	μDG:	100	2.5 (0.2)	76.7 (2.3)	757.1 (68.7)		88
	ημDG = 1		Agionische standaard
Verwachte grootte (nm)						74.6 (3.8)
CeO2 JRC NM212	Modus-I /	PN	PN: Ce ionische & AuNP normen	1.7 (0)	0.90 (0.09)	61.9 (2.0)	7.59 (0.32)		-
10-100 nm	Telmethode
	Modus-II /	PN	PN/μDG:	4.9 (1.4)	1.36 (0.35)	70.6 (5.9)	5.42 (1.7)		-
	Gevoeligheid Verhouding		Ce ionische normen
	Modus-III /	μDG	μDG:	100	1.63 (0.62)	74.4 (9.2)	590 (168)		-
	ημDG = 1		Ce ionische standaard

Tabel 3: Resultaten van de opstelling met dubbele inlaat. Transportefficiëntie, metaalmassafractie, diameter en NP-nummerconcentratie voor Au NIST 8013, Ag NIST 8017 en CeO₂ JRC NM 212 (n=3) NP-materialen met behulp van drie analysemodi en drie methoden voor het bepalen van de transportefficiëntie. Het % herstel wordt gedefinieerd als de verhouding tussen de vastgestelde #NPs en de verwachte #NPs. De tabel is herdrukt met toestemming van referentie¹⁴.

Het hier gepresenteerde protocol maakt het mogelijk om de deeltjesmassa en -concentratie te bepalen. De μDG-druppelvorming, inclusief de druppelgrootte (Figuur 3) werd vooraf gekarakteriseerd (Tabel 3).

Nadat de opstelling was samengesteld (Figuur 1) en de druppelgrootte was bepaald, werden beide injectiesystemen gevalideerd met ionische standaarden (Figuur 4). Een nauwkeurigheid van r² > 0,99 kon met beide injectiesystemen voor alle onderzochte elementen worden bereikt. Er zijn echter verschillen in beide systemen vanwege de hoeveelheid analyt die wordt geïntroduceerd en getransporteerd. Aangezien de μDG een zeer hoge transportefficiëntie heeft (tot 100%), worden tegelijkertijd hogere analytgevoeligheden waargenomen in vergelijking met de PN met een lage massa-input. De gemeten concentraties die door de μDG worden geïntroduceerd, moeten echter worden gescheiden in twee lineaire bereiken. Voor Ag kan het eerste lineaire bereik worden waargenomen tussen 0 en 0,5 fg ^event-1 en het tweede tussen 0,5 en fg ^event-1. Daarentegen ligt het eerste lineaire bereik voor Ce tussen 0 en 0,25 fg ^event-1 en het tweede tussen 0,25 en 3 fg ^event-1. Het lineaire bereik voor PN voor de gemeten concentraties lijkt hoger te zijn. Dit heeft hoogstwaarschijnlijk te maken met het verschil in de geïntroduceerde massa in de ICP-MS per detectiegebeurtenis. De μDG injecteert een constante absolute hoeveelheid in een laag volume per druppel en detectiegebeurtenis, wat resulteert in een lagere gedetecteerde massa in vergelijking met de introductie van monsters met de PN.

Na de succesvolle validatie kunnen experimenten worden uitgevoerd zoals beschreven in Figuur 2. Een resultaat van dergelijke experimenten wordt geïllustreerd in figuur 5 voor de bepaling van de deeltjesgrootte en de aantalconcentratie van CeO₂ NP. Hier kunnen de signalen voor de geïntroduceerde ionische en NP-oplossingen via μDG en PN worden geïdentificeerd. Voor alle onderzochte deeltjes werd een drievoudige bepaling uitgevoerd.

De evaluatie van de verkregen gegevens werd uitgevoerd zoals hierboven beschreven en is samengevat in Tabel 3. Voor de Au en Ag NP die werden gebruikt voor de validatie van de duel-inlaatopstelling en de drie analysemodi, kon de gecertificeerde deeltjesgrootte en aantalconcentratie worden bereikt met alle uitgevoerde analysemodi. De gemiddelde deeltjesgroottes voor CeO₂ liggen tussen 10 en 100 nm, het bereik dat door de fabrikant is opgegeven.

Afbeelding 1: Ontwerp van de opstelling van de dual-inlet-interface. Deel 1 - connectoreenheid, Deel 2 - conventioneel introductiesysteem, Deel 3 - transporteenheid voor microdruppels, Deel 4 - eenheid voor het genereren van microdruppels, Deel 5 - controle-eenheid voor microdruppels en open configuratie voor het meten van de druppelgrootte, inclusief een stroboscooplamp en een CCD-camera. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Het doel van de ontwikkelde opstelling met dubbele inlaat is het zo nauwkeurig mogelijk karakteriseren en kwantificeren van NP met betrekking tot hun grootte en aantalconcentratie door gebruik te maken van verschillende analysemodi, onafhankelijk van de te onderzoeken analyt. Door een laag volume (pL) en hoog massatransport (tot 100%) introductiesysteem (μDG) te combineren met een conventioneel introductiesysteem (PN) is dit haalbaar. Door gebruik te maken van de opstelling die in dit werk wordt gepresenteerd, kan de elementspecifieke transportefficiëntie die nodig is voor de kwantificering van de deeltjesmassa worden bepaald op basis van ionische standaarden en onafhankelijk van NP-referentiematerialen. Bovendien hebben de NP's die met de μDG in de ICP-MS worden geïntroduceerd een smallere (AuNP) of vergelijkbare (AgNP) deeltjesgrootteverdeling. Anders werd voor CeO₂ een bredere grootteverdeling voor de μDG waargenomen en kan deze worden toegeschreven aan de hogere polydispersiteit van het geanalyseerde monster. Door de introductie van een laag volume kunnen twee NP's afzonderlijk van elkaar worden gedetecteerd, die anders in de conventionele opstelling als één NP zouden worden geïnterpreteerd¹⁴.

De voordelen van de μDG-transporteenheid zijn de hoge mate van flexibiliteit dankzij de flexibele siliconenslang, die de uitlijning van de opstelling vereenvoudigt. De toorts met de injector kan ook tijdens de installatie worden aangepast terwijl deze nog op de ICP-MS is aangesloten. De extra toegepaste He-gasstroom voorkomt een botsing van de druppels gevormd door de μDG-kop met de slangwanden²⁰. Bovendien maakt het He-gas het mogelijk om de μDG-kop te verwijderen tijdens de monsteruitwisseling, zelfs wanneer ICP-MS nog in werking is. Het in een operationele staat houden van de ICP is cruciaal voor stabiele en robuuste metingen. Aangezien de μDG-kop bij elk nieuw monster of elke nieuwe standaard moet worden gereinigd en gespoeld, is de He-stroom van vitaal belang voor de werking van het inlaatsysteem dat in dit werk wordt geïntroduceerd. Bovendien moeten alle onderdelen van de dubbele inlaatopstelling correct zijn aangesloten om het binnendringen van zuurstof in het systeem te voorkomen. Om de zuurstof in de gepresenteerde opstelling te verminderen, wordt het systeem gedurende ten minste 5 tot 10 minuten gespoeld met de vernevelaar en het druppeltransportgas voordat het plasma wordt ontstoken.

Wanneer de gevormde druppeltjes de connectoreenheid bereiken, worden ze in het plasma getransporteerd door een vernevelde vloeistofstroom, ook wel een natte plasmatoestand genoemd. In vergelijking met het gebruik van droge plasmacondities leidt dit tot een verhoogd vloeistofgehalte van het plasma. Bijgevolg neemt de signaalintensiteit af, evenals de fluctuatie van de signaaltoename, d.w.z. een hogere standaarddeviatie van het gemiddelde meetsignaal¹³. Door gebruik te maken van de μDG en concentraties in het bereik van 0,2 μg/L kunnen echter signalen boven de achtergrond worden gedetecteerd. De overeenkomstige geïnjecteerde massa per druppel heeft een laag metaalgehalte, wat dicht bij de detectielimieten voor sommige elementen ligt (d.w.z. Au, Ag, Ce). Als langs deze limiet verschillende concentraties voor kalibratie worden gebruikt, kunnen twee lineaire gebieden worden waargenomen met een overlapping van ongeveer 0,05 μg/L voor Ce en 2 μg/L voor Ag. Onder het overlappende gebied liggen de waargenomen signalen dicht bij de elementspecifieke achtergrond²¹. Boven deze limieten kan het lineaire werkbereik van de μDG worden geïdentificeerd. Zelfs met de mogelijkheid om lage concentraties te meten, is het onmogelijk om onderscheid te maken tussen ionen en NP van dezelfde analyt in een druppel als ze tegelijkertijd aanwezig zijn. Anders kan met behulp van het conventionele introductiesysteem de gemiddelde ionische achtergrond worden bepaald en van alle signalen worden afgetrokken om alleen de deeltjessignalen te krijgen.

Op MDG gebaseerde systemen hebben ook verschillende beperkingen die gedeeltelijk kunnen worden omzeild door de toepassing van het voorgestelde dubbele inlaatsysteem. Als de druppelfrequentie van μDG echter hoger is dan 50 Hz, is het niet mogelijk om een consistent druppelpatroon te creëren. De gevormde druppeltjes kunnen botsen en daardoor vindt er uitwisseling van de analyt plaats. De juiste afstelling van de gasdebieten is ook belangrijk voor een betrouwbaar transport van de druppel in het ICP-MS-systeem en voor een correcte werking van de PN. Het voorgestelde dubbele inlaatsysteem ondersteunt momenteel geen automatisering van de meetprocedure, aangezien de monsteroplossingen handmatig moeten worden gewijzigd.

In de toekomst kan μDG worden gebruikt voor het karakteriseren en kwantificeren van NP's in complexe matrices en milieumonsters. Om verstopping van μDG te voorkomen vanwege de hogere viscositeit, complexiteit en oppervlaktespanning van de oplossing, moet een geschikt kopontwerp worden gebruikt. Afhankelijk van het ontwerp van de μDG-kop en de werking van de voeding, is het mogelijk om druppels te genereren die deeltjesachtige systemen bevatten, zoals cellen, micellen of lipidendragers waarvoor helemaal geen standaard referentiematerialen beschikbaar zijn.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Au ionisch (1000 mg L-1 stock)	VWR, UK	85550.18E
Ag ionisch (1000 mg L-1 stock)	Ultra Scientific, RI, USA	ICM-103
Ag NP (75nm, NIST 8017)	NIST, Gaithersburg, MD, USA		niet langer beschikbaar
Au NP (60nm, NIST 8013)	NIST, Gaithersburg, MD, USA		niet langer beschikbaar
Ce ionisch (1000 mg L-1 stock)	VWR, UK	85557.18E
CeO2 (10-100nm, NM212)	EU Joint Research Centre	NM212
Excel 2016	Microsoft
Fiji	ImageJ
Glas vrouwelijke bolvormige bal + Glas mannelijke bal	Fisher Scientific	12499016
HCl (emprove bio)	Merck, Duitsland	100317
ICP-MS spuitkamer met ipact kraal	LabKings	LK6-45013 (OEM 3600170)
Metaalklemmen voor bolvormige glazen verbinding	Fisher Scientific	11322015
Metaal T-stuk	Swagelok	SS-4-VCR-T
Microdrop Dispenserkop, niet verwarmd	microdrop Technologies	944
Microdrop Dispensing Systeem MD-E-3000	microdrop Technologies
MilliQ water (MilliPore gradiënt)	Merck MilliPore, Darmstadt, Duitsland
O-ring vrije kwarts fakkel	Analytical West	450-301
PFA-ST concentrische nevelmaker	Elemental Scientific	ES-2042
Siliconen rubber slang - 60° Shore - Platina uitgehard - Zwart	Silex
XIMEA Cam Tool	XIMEA