Methodenartikel

Kwantificeren van de Brain Gemetastatische Tumor Micro-Environment met behulp van een Organ-On-A Chip 3D Model, Machine Learning en Confocal Tomography

DOI:

10.3791/61654

⸱

16 augustus 2020

 ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, University of Michigan Ann Arbor, 2Rogel Cancer Center, University of Michigan Ann Arbor, 3Department of Neurosurgery, University of Michigan Ann Arbor, 4Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan Ann Arbor

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol voor het voorbereiden en kweken van een bloed-hersenbarrière gemetastaseerde tumor micro-omgeving en vervolgens kwantificeren van de toestand met behulp van confocale beeldvorming en kunstmatige intelligentie (machine learning).

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hersenmetastasen zijn de meest dodelijke kankerletsels; 10-30% van alle kankers metastaseren naar de hersenen, met een mediane overleving van slechts ~ 5-20 maanden, afhankelijk van het type kanker. Om de hersenstastatische tumorlast te verminderen, moeten hiaten in basis- en translationele kennis worden aangepakt. Grote uitdagingen zijn een gebrek aan reproduceerbare preklinische modellen en bijbehorende instrumenten. Driedimensionale modellen van metastase van de hersenen kunnen de relevante moleculaire en fenotypische gegevens opleveren die worden gebruikt om aan deze behoeften te voldoen in combinatie met speciale analysetools. Bovendien, in vergelijking met murine modellen, orgaan-op-een-chip modellen van patiënt tumorcellen dwars door de bloed-hersenbarrière in de hersenen micro-omgeving genereren snel resultaten en zijn meer interpreteerbaar met kwantitatieve methoden, dus vatbaar voor een hoge doorvoer testen. Hier beschrijven en demonstreren we het gebruik van een nieuw 3D-microfluïde bloedhersenniche (μmBBN) platform waar meerdere elementen van de niche gedurende een langere periode (enkele dagen) kunnen worden gekweekt, fluorescerend worden afgebeeld door confocale microscopie, en de beelden gereconstrueerd met behulp van een innovatieve confocale tomografietechniek; alle gericht op de ontwikkeling van micro-metastase en veranderingen in de tumor micro-omgeving (TME) te begrijpen in een herhaalbare en kwantitatieve manier. We laten zien hoe je de kankercellen en TME cellulaire en humorale componenten fabriceren, zaaien, beeld, en analyseren, met behulp van dit platform. Bovendien laten we zien hoe kunstmatige intelligentie (AI) wordt gebruikt om de intrinsieke fenotypische verschillen van kankercellen te identificeren die door een model μmBBN kunnen worden doorgevoerd en om ze een objectieve index van hersenuitzaaiend potentieel toe te wijzen. De gegevenssets die door deze methode worden gegenereerd, kunnen worden gebruikt om fundamentele en translationele vragen over metastase, de werkzaamheid van therapeutische strategieën en de rol van de TME in beide te beantwoorden.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hersenmetastasen zijn de meest dodelijke kankerletsels; 10-30% van alle kankers metastaseren naar de hersenen, met een mediane overleving van slechts ~ 5-20 maanden, afhankelijk van het type kanker1,,2. Een belangrijke vraag die ontstaat bij het bestuderen van kankermetastase is hoe subklonen migreren van de humorale omgeving van de bloedbaan in een orgaan zoals de hersenen3,4. Deze vraag heeft geleid tot vele variaties van migratie, invasie, en extravasation testen. Al deze methoden delen de kritieke stap van het tellen of meten van eigenschappen van cellen die van de ene locatie naar de andere gaan in reactie op een stimulus. De meeste migratietesten die direct beschikbaar zijn, worden gebruikt om tweedimensionale (2D) migratie van kankercellen te bestuderen. Deze hebben een schat aan kennis opgehelderd; zij vatten echter niet het driedimensionale karakter samen van het in vivo-systeem dat andere methoden kunnen leveren5. Daarom is het noodzakelijk om de tumormicro-omgeving (TME) te bestuderen in driedimensionale (3D)-systemen, maar de analysebenaderingen die beschikbaar zijn voor 3D-structuren zijn beperkt en vaak inconsistent.

Een van de meest populaire 3D-tools is een Boyden kamer die bestaat uit een membraan opgehangen aan de onderkant van een put, het scheiden van twee verschillende regio's. Boyden introduceerde de test om leukocyte chemotaxis4te bestuderen. De onderste gebieden kunnen worden gevarieerd door chemie of andere middelen6,7 om cellen in het bovenste gebied te induceren om te migreren naar het lagere gebied. De meest voorkomende benadering voor het kwantificeren van het aantal cellen dat is gemigreerd is om de cellen vrij te geven van de bodem van het membraan met behulp van een buffer oplossing, lyse ze, en vervolgens tellen ze op basis van de hoeveelheid DNA-inhoud in de oplossing7. Deze indirecte benadering is gevoelig voor fouten van de operator als gevolg van techniek variabiliteit en de procedure vernietigt informatie over het kankerfenotype en de micro-omgeving. Variaties van de Boyden kamertest omvatten fixatie van trekkende cellen die op het membraan blijven, maar alleen een aantal cellen biedt die niet langer levensvatbaar zijn voor voortgezet onderzoek6,8,9.

Als gevolg van beperkingen van de Boyden kamer en de groei van innovaties in de microfluïde gemeenschap, migratie test chips zijn ontwikkeld die de beweging van cellen in reactie op een stimulus in een richting in plaats van drie10,11,12observeren . Deze migratietesten vergemakkelijken de controle over factoren zoals stroom of eencellige scheiding13,14 die een betere interpretatie van de resultaten mogelijk maken; echter, hun 2D-formaat onvermijdelijk verliest wat dynamische informatie. Recente studies hebben zich gericht op extravasatie (d.w.z. de beweging van cellen uit het verkeer naar een weefsel, zoals de bloedhersenbarrière) in een 3D-omgeving14,15. De extravasatie afstand in weefsel en indringend gedrag dat optreedt bij de cellulaire barrière / membraan is verfijnder dan metingen opgedaan met behulp van ofwel de Boyden kamer of een 2D microfluïde migratie apparaat16. Zo zijn apparaten die de juiste beeldvorming en analyse van 3D-extravasatie mogelijk maken van cruciaal belang om deze geavanceerde metingen vast te leggen, maar ontbreken ze in de literatuur.

Onafhankelijk van migratietesten zijn robuuste beeldvormingstechnieken ontwikkeld voor magnetic resonance imaging (MRI) en tomografie die weefsel in 3D-ruimte17,18nauwkeurig kunnen identificeren en nauwkeurig reconstrueren. Deze technieken verwerven beelden in z-stacks en segmentgedeelten van het beeld op basis van de eigenschappen van het weefsel en zetten vervolgens de gesegmenteerde afbeeldingen om in driedimensionale mazen19,20,21. Dit stelt artsen in staat om te visualiseren in 3D individuele organen, botten en bloedvaten om te helpen bij chirurgische planning of hulp bij de diagnose van kanker of hart-en vaatziekten22,23. Hier zullen we laten zien dat deze benaderingen kunnen worden aangepast voor gebruik op microscopische exemplaren en 3D-extravasatie-apparaten.

Hiertoe ontwikkelden we de innovatieve confocale tomografietechniek, die hierin wordt gepresenteerd, die flexibiliteit biedt om de extravasatie van tumorcellen over een membraan te bestuderen door bestaande tomografietools aan te passen. Deze aanpak maakt het mogelijk om het volledige gamma van kankercelgedrag te bestuderen terwijl ze interageren met een cellulaire barrière, zoals een endotheelcellaag. Kankercellen vertonen indringend gedrag; sommigen kunnen binnenvallen, maar blijven dicht bij het membraan, terwijl anderen gemakkelijk door de barrière gaan. Deze techniek kan informatie opleveren over het fenotype van de cel in alle dimensies24. Met behulp van deze aanpak om de TME te bestuderen is zowel relatief goedkoop, gemakkelijk te interpreteren, en reproduceerbaar, in vergelijking met meer complexe in vivo murine modellen. De gepresenteerde methodologie moet een sterke basis bieden voor de studie van vele soorten tumoren en micro-omgevingen door de stromale regio aan te passen.

We beschrijven en demonstreren het gebruik van een 3D microfluïde bloedhersenniche (μmBBN) platform (Figuur 1) waar kritische elementen van de barrière en niche (microvasculaire endotheliale cellen en astrocyten) gedurende een langere periode (ongeveer tot 9 dagen) kunnen worden gekweekt, fluorescerend afgebeeld door confocale microscopie, en de beelden gereconstrueerd met behulp van onze confocale tomografietechniek (figuur 2); alle gericht op de ontwikkeling van micro-metastase en veranderingen in de tumor micro-omgeving te begrijpen in een herhaalbare en kwantitatieve manier. De bloed-hersenbarrière interface met de hersenen niche is samengesteld uit de hersenen microvasculaire endotheelcellen die worden versterkt door kelder membraan, astrocyten voeten, en pericyten25. We hebben ons selectief gericht op de astrocyten en endotheelcomponenten gezien hun belang in de vorming en regulatie van de bloedhersenbarrière. We laten zien hoe je de kankercellen en tumormicro-omgevingscomponenten en humorale componenten fabriceren, zaaien, beeld, en analyseren, met behulp van dit platform. Ten slotte laten we zien hoe machine learning kan worden gebruikt om de intrinsieke fenotypische verschillen van kankercellen te identificeren die in staat zijn om door een model μmBBN te worden doorgevoerd en om ze een objectieve index van hersenuitzaaiend potentieel toe te wijzen24. De gegevenssets die door deze methode worden gegenereerd, kunnen worden gebruikt om fundamentele en translationele vragen over metastase, therapeutische strategieën en de rol van de TME in beide te beantwoorden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereid de bloed-hersenbarrière niche schimmel

OPMERKING: Het kweekapparaat dat in dit platform wordt gebruikt, is een PDMS-gebaseerde steiger waarop we een cellulaire bloedhersenbarrièreniche bouwen. Het is gemaakt van twee delen gescheiden door een poreus membraan. Voor de voorbereiding van de bloed-hersenbarrière niche twee SU-8 mallen gemaakt met behulp van fotolithografie zijn noodzakelijk26,27. Het protocol zal worden beschreven voor de 100 μm dikke mal eerste en dan notities zullen worden gegeven voor de 200 μm dikke mal.

  1. Om de mal voor te bereiden, reinig een 4" silicium wafer met aceton met een knijpfles en droog deze vervolgens met een stikstofpistool.
    1. Bak de siliciumwafer 10 min op een kookplaat bij 200 °C om alle restoplosmiddel te verwijderen.
    2. Op zijn beurt centreren de silicium wafer op de chuck van een spin coater en afzien van 1 mL van SU8-2075 voor de bovenste mal. Draai voor 5 s bij 500 rpm (acceleratie 300 rpm/s) om de fotoresist te verspreiden en vervolgens 30 s bij 2200 rpm (acceleratie 300 rpm/s) om een 100 μm dikke SU-8 coating te verkrijgen. Optimalisatie kan nodig zijn om de opgegeven dikte te bereiken.
  2. Bak de wafer zacht op een kookplaat op 65 °C gedurende 2 min en dan onmiddellijk op 98 °C gedurende 20 min.
  3. Plaats de wafer in een fotolithografie lamp en plaats het masker gecentreerd op de wafer volgens de standaard procedures. Ontmasker de SU-8 gecoate wafers met een uitstraling van 230 mJ/cm2 UVB (360 nm ± 10 nm). Een blootstelling matrix experiment kan worden uitgevoerd om de optimale dosering te bepalen. Maskerontwerpen zijn beschikbaar in supplementa 1.
  4. Breng een bak na blootstelling op 65 °C gedurende 2 min en dan onmiddellijk op 98 °C gedurende 10 minuten om de hechting te verbeteren. Koel de wafer af tot 50 °C.
  5. Verwijder de niet-blootgestelde weerstaan met behulp van SU-8 foto-ontwikkelaar. Spoel de wafer in ontwikkelaar voor 5 min in een bad en gebruik dan een spuitfles gevuld met SU-8 ontwikkelaar in een chemische kap te ageren en te verwijderen resterende ongezende SU-8. Een 4x microscoop kan worden gebruikt om te observeren of alle ongecureerde SU-8 is verwijderd. Een witte lijn aan de randen van de fotoresist functies geeft aan dat de SU-8 niet volledig is verwijderd.
  6. Voer een laatste harde bak in een oven op 110 °C gedurende 60 minuten.
  7. Volg dezelfde procedure voor de 200 μm dikke mal met BEHULP van SU-8 2075, maar pas het protocol aan de volgende:
    1. Spin coater instellingen: Spin voor 5 s bij 500 rpm (versnelling 300 rpm / s) om de fotoresist te verspreiden en vervolgens 30 s bij 1300 RPM (acceleratie 300 rpm / s) om een 200 μm dikke coating te verkrijgen.
    2. Bak 2 min op 65 °C en daarna 40 minuten bij 98 °C.
    3. Belichtingstijd van 340 mJ/cm2.
    4. Post blootstelling bakken: 2 min bij 65 °C, en vervolgens 98 °C gedurende 15 min.
  8. Ten slotte silanize elke wafer door ze te plaatsen in een vacuüm kamer binnenkant van een chemische kap met een plastic container waarin 3 druppels (~ 150 μL) van silanizing oplossing (Trichloro perfluoro octyl silane) zijn geplaatst. Trek een vacuüm en laat 's nachts om de damp om de wafer jas. Deze stap vermindert de hechting tussen de SU-8 en PDMS, waardoor de levensduur van de mal wordt verhoogd.
    LET OP: Trichloro perfluoroctyl silane moet altijd worden behandeld in de rookkap en uit de buurt van waterbronnen worden gehouden.
  9. Plaats individuele wafermallen in 150 mm petrischaaltjes met twee stroken dubbelzijdige tape. Zorg ervoor dat de wafers vlak zijn. Een alternatief is het fabriceren van een aluminium mal waarbinnen de wafer kan worden geplaatst. Omdat de aluminium mal is ingesloten zal produceren werpt met een uniforme dikte, terwijl de Petri schotel methode is gevoelig voor de kanteling van het oppervlak is het geplaatst op. De verbeterde vlakheid van de PDMS-afgietselen vermindert de stroomafwaartse confocale beeldtijd.

2. Vorm en monteer het PDMS-bloedhersenbarrière (BBB) apparaat

  1. Meng 75 g PDMS bij een verhouding van 1:10 (Crosslinker:Base) in gewicht in een plastic beker.
  2. Giet de PDMS over de mallen (1 mm dik voor de 200 μm dikke mal en 4 mm voor de 100 μm dikke mal) en ontgassen in een vacuüm desiccator gedurende een uur of totdat alle bubbels zijn verwijderd. Plaats in een oven van 65 °C 's nachts. De dikte van 1 mm kan worden aangepast op basis van de werkafstand van de 10x-doelstelling in de confocale microscoop.
  3. Nadat de PDMS is uitgehard gebruik maken van een mes om voorzichtig te snijden tegen de wafer door de PDMS rond de randen. Pel de PDMS af en gebruik een mes om langs de rechthoekige geleiders en een 1,5 mm biopsie punch te snijden om de inhammen en uitlaten op het apparaat te openen. Bedek de ONDERDELEN van het PDMS-apparaat met een 48 mm brede verpakkingstape om het schoon te houden van stof en vuil.
  4. Gebruik vervolgens een schaar van 5 mm x 50 mm om een rechthoek van polycarbonaat met 5 μm poriën te snijden en deze in een petrischaal op te slaan voor later gebruik.
  5. Verzamel het volgende: 200 μL pipettip, 2 mL van 1:10 PDMS gemengd met tolueen bij een verhouding van 2:3 in gewicht in een glazen flacon, een Pasteur pipet met een knijplamp, de bereide PDMS boven- en onderdelen, het membraan, drie 50 mm x 75 mm glazen glijbanen en transporteren het allemaal naar een spincoater. De volgende stappen voor het monteren en inzaaien van cellen van het apparaat zijn afgebeeld in figuur 1.
  6. Gebruik de Pasteur pipet om 1 mL PDMS:tolueenlijmoplossing over te brengen in een 50 mm x 75 mm glazen schuif op de klem van de spincoater. Spin gedurende 5 seconden bij 100 rpm (acceleratie 300 rpm/s) en 30 seconden bij 2000 rpm (acceleratie 300 rpm/s).
  7. Plaats de dia op een tafel en bedek deze met een PDMS bovenkamer en een onderste kamer, zodat de PDMS gezichten met functies gegoten in het contact met de dia en de lijm wordt overgebracht naar de PDMS gezicht, waarin de omtrek van alle functies.
  8. Draai de PDMS bovenkamer op een andere dia met de lijm coating naar boven en zorgvuldig plaats het membraan over het apparaat tussen de inhammen en uitlaten. Plaats de 200 μL tip in de PDMS:tolueen lijm oplossing totdat het heeft goddeloze sommige in de tip. Raak de punt tussen elke inlaat en uitlaat aan om een kleine druppel in de buurt van de rand van het membraan te plaatsen waar het contact opneemt met de PDMS.
  9. Verwijder de andere helft van het apparaat en plaats het op met de lijm coating naar beneden, terwijl het uitlijnen van de inhammen en uitlaten op de twee delen.
  10. Plaats het gemonteerde apparaat 's nachts in een oven op 37 °C om de lijm te genezen. Breng over op een vacuümbellenpot met droogmiddel en laat twee dagen uitdrogen. Dit is een cruciale stap om het Tolueen te laten verdampen en de consistentie van het zaaien van het apparaat te verbeteren door de geabsorbeerde waterdamp in de laboratoriumlucht te reguleren.

3. Zaad de hersenen micro-omgeving in het apparaat

  1. Celcultuur en reagentia: Voordat u met dit protocol begint, verkrijgen u de volgende reagentia en cellen. Cultiveren alle cellijnen in een incubator ingesteld op 37 °C in 5% CO2.
    1. Behoud menselijke drievoudig negatieve borstkankercellijn MDA-MB-231 (ATCC HTB-26) en MDA-MB-231-BR-GFP cellen (verkregen uit Patricia Steeg, PhD) in DMEM met 4,5 g/L glucose, aangevuld met 2 mM L-glutamine, 10% FBS en 1x antibioticum-antimycotische. Maak MDA-MB-231-GFP fluorescerende cellen door MDA-MB-231 cel te transduceren met lege vector pLL-EV-GFP lentivirus. Sorteer de getransduceerde GFP+ populatie met fluorescentie-geactiveerde celsorde (FACS) voorafgaand aan het experimenteren.
    2. Onderhoud menselijke hersenen microvasculaire endotheelcellen hCMEC/D3 in EGM-2 medium. Maak hCMEC/D3-DsRed fluorescerende cellen door hCMEC/D3 te transduceren met lege vector pLL-3.7-dsRed lentivirus. Verwijder alle niet-doorgezette, niet-fluorescerende cellen uit de cultuur met behulp van FACS voorafgaand aan experimenteel gebruik.
    3. Behoud normale menselijke astrocyten (NHA) in DMEM aangevuld met 4,5 g/L glucose, 10% FBS, 2 mM Glutamax, 1 mM natrium pyruvaat, 1x N-2 groeisupplement en 1x antibioticum-antimycoticum. Vereeuwig de astrocyten door pLOX-TERT-iresTK lentiviral vector (Addgene 12245) te transduceren. Maak de vector met behulp van plasmid psPAX2 en envelop plasmid pMD2.G (Addgene 12260 en 12259).
  2. Verwijder een μmBBN-apparaat uit de vacuümdesiccator en plaats het op een metalen of papieroppervlak (d.w.z. tape) met de inhammen naar beneden gericht en zet het in een plasmakamer. Plaats ook een 50 mm x 75 mm glazen schuif in de plasmakamer. Trek een vacuüm en vervolgens te behandelen met plasma op 80 W voor 30 s.
  3. Verwijder snel de glazen schuif en het apparaat uit de plasmakamer en plaats het apparaat met de inlaten naar boven op de glazen schuif uitgelijnd met behulp van eengeleider (Supplemental File 2). Hierdoor ontstaat een permanente band tussen de PDMS en de glazen schuif en kan deze niet opnieuw worden geplaatst.
  4. Knip vervolgens de uiteinden af 16, 200 μL pipet tips, 2 mm van de tip. Plaats de pipettips in alle inhammen en uitlaten. Het apparaat kan op dit punt weer in de vacuümdesiccator worden geplaatst als het niet klaar is om de cellen te zaaien.
  5. Plaats het apparaat terug in de plasmakamer en behandel met plasma gedurende 8 min op 200 W. Nadat het apparaat is afgekoeld (5 min) van de plasmabehandeling plaats het in een steriele secundaire container, zoals een transparante pipettipbox. Voer de volgende stap binnen ~ 15 min of de effectiviteit van de plasmabehandeling kan worden verminderd leidt tot verstopping.
  6. Enkele dagen voor de experimentcultuur petrischaaltjes van 1 x 106 endotheelcellen (hCMEC/D3-DsRed) en 1 x 106 astrocyten (NHA). Terwijl het apparaat de 8 min plasmabehandeling ondergaat, bereidt u een collageenoplossing voor die bestaat uit 0,5 mL van 3 mg/mL PureCol type I rundercollageen met 64 μL van 0,8 M NaHCO3 en 20 μL 10x hoge glucose (250 mM) MEM. Onderschors 5,0 x 105 NHA-cellen in de collageenoplossing. Houd de oplossing op ijs terwijl u niet in gebruik is.
  7. Breng 120 μL van de collageen/astrocyten/microglia-oplossing via de pipettepunt voor de onderste kamer over in het apparaat (Figuur 1 Rode pijlen). Laat de oplossing over de kamer wieken in de tegenoverliggende pipetpunt. Nadat alle vier de kanalen van het apparaat zijn gevuld, plaatst u de chip in de CO2-incubator op 37 °C en 5% CO2 gedurende 1 uur of totdat het collageen is ingesteld.
  8. Vul na de collageensets alle pipettips die de onderste kamer voeden met een mengsel van complete media. Voor chips met endotheelcellen en astrocyten wordt een mix van 50:50-50-media gebruikt.
  9. Bedek de bovenste kamer met 2% groeifactor verminderde Matrigel in complete endotheelmedia met behulp van de bovenste kamer pipettip (Figuur 1 Blauwe pijlen) en plaats in de couveuse voor 1 uur.
  10. Spoel de bovenste kamer met de aangegeven media mengsel en afwisselend welke tip is gezaaid met endotheelcellen (Figuur 1 Groene pijlen). Schors 1 x 106 endotheelcellen in 1 mL endotheelmedia en zaad 30 μL om de 15 minuten in afwisselende bovenkamertips voor gelijkmatige dekking. Zaad endotheelcellen in elke bovenste kamer tip tweemaal, voor een totaal van 4 keer per kamer.
  11. Na het laatste zaaien van endotheelcellen, vul alle tips met het mediamengsel en plaats het apparaat in de couveuse op 37 °C en 5% CO2,wisselende media in beide kamers om de 12 uur.

4. Monitor de progressie van de endotheellaagvorming

  1. Volledige dekking van het kanaal door de endotheellaag wordt waargenomen na 3 dagen. Gebruik een van de twee methoden om de dekking van de endotheelbarrière te controleren: Fluorescentie of TEER. de hCMEC/D3-DsRed fluorescentie en naar % dekking over het kanaalgebied kan worden gekwantificeerd met ImageJ.
    1. Open het TIFF-bestand in ImageJ dat representatief is voor de hCMEC/D3-DsRed-barrière. Klik in de ImageJ-software op Bestand > Openen om het bestand te selecteren.
    2. Alle Z-lagen van de afbeelding samenvoegen met de maximale intensiteit volgens deze hoofdopdrachten en -opties: Afbeelding > Stapels > Z-project > Alle Z-segmenten, Maximale intensiteit.
    3. Voer een kleurdrempel uit die hetzelfde is voor alle microfluïde chips die met deze methode worden beoordeeld. Voor de gepresenteerde studie hadden we een drempel van 450. Gebruik het drempelmenu in ImageJ op: Afbeelding > Aanpassen > Drempelwaarde.
    4. Stel de metingen in die moeten worden geregistreerd met behulp van de volgende opdrachten en opties: Analyseren > Metingen instellen > Beperken tot drempelwaarde, Gebiedsfractie.
    5. Selecteer een representatief gebied van het microfluïde kanaal om te meten door een vak te tekenen. Het vakgereedschap bevindt zich in het hoofdmenu van ImageJ. Meet 3 technische replicaties die aan het begin, midden en uiteinde van elk microfluïdisch kanaal zijn geplaatst met dezelfde doosgrootte.
    6. Analyseer elk kanaal en noteer de gebiedsfractie, die de % endotheeldekking vertegenwoordigt. Exporteer deze metingen als spreadsheetbestanden om de gegevens te plotten en te visualiseren met behulp van de volgende opdrachten: Analyseren > Meten.
  2. Als alternatief gebruikt u Impedan-spectroscopie-gebaseerde TEER om endotheeldichte kruispunten per gebied te meten. Kwantificering van de endotheelbarrière met BEHULP VAN TEER is een proxy voor de integriteit van de endotheellaag als barrière.
    1. Plaats twee elektroden in de inlaat en uitlaat van de bovenste en onderste kamers.
    2. Kwantificeer de impedantie van de endotheelmonolaag als een combinatie van de weerstanden, inductie en capaciteitsbeloningen in de chip volgens een door Srinivasan et al.28,29voorgesteld model .

5. Zaad kankercellen in het apparaat

  1. Nadat de endotheellaag is gerijpt, zaad kankercellen in het apparaat. Bereid een 1 mL-oplossing van 1 x 106 kankercellen in volledige kankercelmedia.
  2. Wissel de media in de chip om de celcultuur voedingsstoffen aan te vullen.
  3. Zaad elk bovenste kamerkanaal met 30 μL kankercellen in suspensie en plaats het apparaat vervolgens 15 minuten terug in de couveuse. Zaad altijd de kankercellen aan dezelfde kant van alle vier de bovenste kamerkanalen binnen een enkel apparaat.
  4. Wissel het apparaat in met nieuwe media en vul de tips elke 12 uur bij totdat het apparaat wordt afgebeeld voor uitgezaaid gedrag.

6. Beeld de tumor micro-omgeving door confocale beeldvorming

  1. Gebruik confocale beeldvorming op het gewenste experimentele timepoint (1, 2 of 9 dagen) om een 3D-beeld van het kanaal vast te leggen. We voeren deze stap op een Nikon A1 met behulp van de hier beschreven instellingen. Deze stap is geautomatiseerd en elk kanaal vereist 20-40 min tot beeld, afhankelijk van het aantal tl-kanalen en de Z-diepte die nodig is om de posities van alle cellen te dekken.
  2. Zet de microscoop aan, open de software en plaats de incubator cover op de microscoop.
  3. Stel de microscoop podiumverwarming in op 37 °C en CO2 tot 5% indien beschikbaar.
  4. Nadat de microscoop incubator is gestabiliseerd, plaats het apparaat in de microscoop stadium met behulp van de 50 mm x 75 mm mount.
  5. Focus op de ene kant van het apparaat (links als te worden gebruikt met de meegeleverde analyse software) met een 10x doelstelling en stel de Z-hoogte als nul. Voeg onder z-stack-instellingen een bereik van 100 μm boven en 200 μm onder het focusvlak. Gebruik vervolgens de stikselsinstelling om het aantal X- en Y-velden in te stellen op respectievelijk 1 en 9 met overlap van 15%. Stel het gaatje op het aanbevolen minimum en de z-laaghoogte op 9 μm. Pas de blootstelling aan het heldere veld zo aan dat het poreuze membraan zichtbaar is. Schakel de excitatielasers in voor de kanalen dsRed (561 nm) en GFP (488 nm) en pas de fluorescerende laserkrachten en cutoffs aan, zodat elk kanaal zichtbaar is zonder de pixels te overbelichten.
  6. Controleer of alle velden scherp zijn wanneer u overstapt. Voer in dat plaats een uitvoerbestandsnaam (001.nd2) in voor de afbeelding en start het experiment om automatisch de 3D-confocale afbeelding vast te leggen.

7. Meet de tumormicro-omgeving via confocale tomografie

  1. Gebruik confocale tomografie een benadering om een reeks statistieken en metingen te schatten die de individuele cellen en de tumormicro-omgeving in het apparaat beschrijven. Confocale tomografische analyse (Figuur 2) zet een confocale z-stack om in een driedimensionale weergave van de cellen. Met behulp van een aangepaste python script binnen de Jupyter notebook / lab omgeving, een vlak wordt vervolgens afgestemd op de laag van cellen die de bloed-hersenbarrière vormen, zoals membraan30. Tot slot, maak fenotypische metingen van de kankercelpopulaties(tabel 1).
    1. Voer deze analyse uit aan het einde van een experiment of over een tijdscursus. Installeer python en de juiste bibliotheken volgens de genoemde softwaregids en open vervolgens de software van Windows Command Prompt door de opdracht "conda activate" uit te voeren, gevolgd door "jupyter lab". De Jupyter-omgeving wordt geladen in de standaardbrowser.
    2. Klik vanuit de Jupyter file explorer dubbel op de Jupyter notebook "contom.ipynb" om het te openen. Voer de cel onder de titel Bibliotheken, aangepaste klassen/functies importeren en het notitieblok instellen door op de notitieblokcel te klikken en vervolgens op de afspeelknop te klikken. Alle onderstaande notitieblokcellen worden uitgevoerd met dezelfde aanpak. Merk op dat hier notebook "cel" verwijst naar een blok python-code in de Jupyter notebook.
  2. Bereid de gegevens voor. Dit algoritme maakt gebruik van de visualisatietoolkit (VTK) om de z-stack en driedimensionale gegevens17te manipuleren en weer te geven.
    1. Plaats de meegeleverde . XLSX-bestand ("Experiment Tracker.xlsx") in dezelfde windows-map als het Jupyter-notitieblok. Het bestand volgt experimenten en interfaces met het Jupyter-notitieblok. Plaats het ND2-bestand van sectie 6 in een submap genaamd "\Experiment_XXX\Confocal\" onder de locatie van het Jupyter-notitieblok. Extra experimentmappen kunnen binnenin worden toegevoegd door de "XXX" aan te passen aan de numerieke id die aan nieuwe mappen is toegewezen.
    2. Label de eerste experimentmap "Experiment_001" en het ND2-bestand "001.nd2". Zet eerst het ND2-beeldbestand om in een gestikt TIFF-bestand met meerdere afbeeldingen, gescheiden door kleurkanaal. Doe dit door de notebookcel uit te voeren onder de titel "Lees de confocale z-stack in het geheugen" met de functie Save_tiff_from_ND2 () zonder begeleiding30. Het ND2-bestand is een eigen beeldformaat van Nikon, dus het is noodzakelijk om het om te zetten naar een formaat waarmee open source-software compatibel is.
      OPMERKING: De TIFF (Tag Image File Format) wordt gebruikt omdat het alomtegenwoordig, 16-bits compatibel is, gemakkelijk kan worden geïmporteerd in VTK en meerdere afbeeldingen kunnen worden opgeslagen in één bestand, wat geschikt is voor z-stack-afbeeldingen. Als u de notitieblokcel uitvoert, wordt deze in een afbeelding uit het ND2-bestand gelezen, wordt informatie over de kleur en XYZ-posities extraheren en wordt die afbeelding op een numpy-array op te slaan volgens een vooraf bepaalde structuur. Vervolgens wordt de array opgeslagen als een TIFF-bestand met behulp van de python-bibliotheek tifffile.
  3. Imaging-gegevens omzetten in 3D-model
    1. Importeer het TIFF-bestand in VTK (vtkTIFFReader) met behulp van een 3D-rendering om de cellen te visualiseren(figuur 2). Selecteer een drempelwaarde op basis van de kleur van de cellen in de afbeelding. Ter verduidelijking, het VTK-object vertegenwoordigt een blok pixels (X, Y, Z) in de ruimte (volume), maar alleen bepaalde pixels (groen of rood) vertegenwoordigt cellen, de rest is achtergrond of ruis (zwart).
    2. Daarom, stel een dekking filter op het volume dat de achtergrond verwijdert bevestigen dat wat fluorescentie blijft is alleen de cellen. Doe dit met behulp van de Jupyter notebook cel getiteld, Wijzigen dekking waarden voor elke microscoop kanaal door het aanpassen van de Channel_alpha waarde variabelen (dwz, GFP_alpha). Visualiseer het effect met behulp van de notebookcel met de titel Bekijk een 3D-rendering om te controleren of de drempelwaarde correct is ingesteld.
    3. Sla de dekkingswaarden in de spreadsheet op die u in de volgende stap wilt gebruiken. Zet de volumegegevens om in afzonderlijke 3D-objecten, die elk een cel in de afbeelding vertegenwoordigen met behulp van een techniek die marchingkubussen31wordt genoemd. Dit algoritme haalt een veelhoekig gaas van een isosurface uit driedimensionale discrete scalaire velden van voxels.
    4. Gebruik de dekkingswaarde in het algoritme voor marcherende kubussen om elke cel van de achtergrond te scheiden. Voltooi deze stap voor alle fluorescerende cellen die in elk microscoopkanaal zijn geïdentificeerd door voxel-afbeelding omzetten in een driehoekig gaas uit te voeren en op te slaan als een VTK-bestand in de notebook.
  4. Het plaatsen van een vlak aan het membraan
    1. Plaats een vlak op de endotheliale barrière door eerst de celcentroids te lokaliseren (notebookcel: Analyseer het RFP-kanaal (endotheelbarrière)). Doorschrijding van de lijstmazen in het volume en haal de regio's eruit die niet zijn verbonden met behulp van een PolyDataConnectivityFilter uit VTK. Bereken de centroid van elk net en voeg de meting toe aan een lijst met centroids die filteren op te grote of te kleine mazen (<50, >1000000 voxels).
    2. Plaats een vlak in de lijst van centroids voor de endotheelcellen met behulp van een minimalisering van de foutmethode (notebookcel: Pas een vlak aan op de RFP-centroids (endotheliale barrière)( Figuur2, figuur 3)32. Inspecteer de pasvorm van het vliegtuig door het plotten van het vliegtuig en centroids en handmatig aan te passen indien nodig (met behulp van theta, beta en z) door het uitvoeren van de notebook cel getiteld Visualize RFP centroids en vlak passen.
    3. Nadat het vliegtuig goed is gemonteerd, bewaart u het normale van het vliegtuig in het Experiment Tracker File. XLSX-bestand voor toekomstig gebruik.
  5. Analyseer de beschrijvende kenmerken van individuele kankercellen voor de volgende beschrijvingen(tabel 1).
    OPMERKING: Als de computer die de analyse uitvoert achterloopt, is een hoge doorvoeranalyse via high performance computing een optie. Dit algoritme is handig op standaard laptops voor de analyse van kleine aantallen cellen, maar VTK is niet goed geschikt voor een groot aantal afzonderlijke objecten (>1000). Daarom is het optioneel om het aangepaste algoritme te gebruiken om te functioneren op een high-performance computing cluster. Dit maakt een snelle analyse van experimenten met veel cellen mogelijk(figuur 2). Alle van 7.5 wordt bereikt door het uitvoeren van de notebook cellen getiteld Analyseer de resterende microscoop kanalen voor fenotypic descriptoren en Lees in de Experiment_tracker informatie en analyseren van de kanalen die bestaan.
    1. Meet de extravasatie van de kankercellen: Na het karakteriseren van de endotheellaag met een vlak, meet het volume van elke kankercel die door het membraan is gemigreerd. Knip elke cel (Booleaans) zo vast dat het gaas onder het membraan wordt bewaard en het gedeelte boven het membraan wordt verwijderd33. Sluit vervolgens het open gaas (vtkFillHoles).
      1. Bereken de normale en de nieuwe centroid van het geknipte gaas opnieuw. Meet het volume en de positie van elke afgeknipte kankercel voor analyse. Het volume is gelijk aan het aantal voxels dat de mesh-vullingen van elke enkele cel vullen. Bereken de afstand tussen het endotheelvlak en de positie van elke kankercel.
    2. Meet het cellulaire fenotype: Bereken de morfologie van elke kankercel door rekening te houden met de vorm, het volume en de positie.
  6. Valideer de metingen en sla op in een spreadsheet of plot. Voer de notebook cel getiteld Controleer of centroids nauwkeurig werden gemeten en een render zal pop-up met de centroids geïdentificeerd op de top van de afgebeelde volume door celtype. Nadat alle experimenten zijn gedaan exporteren van de volledige gegevensset als een spreadsheet bestand door het typen van de experimenten worden opgenomen door ID in het notitieblok cel getiteld Export de gegevens als een gegevens.XLSX bestand voor de variabelen experimenten ter vervanging van de gegeven experiment-id's. Als u de voltooide gegevensset verifieert, u deze plotten met de notitieblokcel met de titel Afstand extravasated stripplot. De plot wordt weergegeven in de notebookomgeving en wordt opgeslagen in het bestand.

8. Analyseer de gerelateerde kenmerken met behulp van kunstmatige intelligentie

OPMERKING: Identificeer gemetastaseerd fenotypische functies met behulp van kunstmatige intelligentie algoritmen.

  1. Binaire classificatie uitvoeren met Orange volgens het schema in figuur 5 en supplementair bestand 3. Start Orange vanaf een tweede Windows Command Prompt door "conda activate" te typen, gevolgd door "python -m Orange.canvas" en klik op Nieuw van de prompt. Oranje is een op slepen en neerzetten gebaseerde software, dus schik de functies door elk item uit het linkermenu naar het canvas te slepen om het aanvullende bestand 3 te evenaren. Klik daarna op het bestandspictogram en selecteer het bestand Gegevens.XLSX.
  2. Filter de gegevens om slechte metingen te verwijderen, gedefinieerd als metingen die een Booleaanse bewerking niet hebben uitgevoerd of die parametrische variabele waarden geven buiten bekende grenzen met het pictogram Rijen selecteren. Dubbelklik op het pictogram en stel voorwaarden in die overeenkomen met het filter, zoals 'Sfericiteit ligt tussen 0 en 1'. Maak voorwaarden voor 8.2.1, 8.2.2 en 8.2.3.
    1. Filterafstand extravasated metingen te variëren van -100-200 μm.
    2. Filterfericiteitsmetingen van celvorm tot 0-1.
    3. Filter kankercel volume metingen te variëren van 0-2000 voxels.
    4. Gebruik alle parametrische variabelen(tabel 1) om hersenstatische MDA-MB-231-BR-GFP en niet-hersenmetastaat MDA-MB-231-GFP te classificeren. Dubbelklik op pictogram Kolommen selecteren in het canvas. Met de knop > worden beschikbare variabelen verplaatst naar functies, doelvariabelenof Meta-kenmerken. De enige variabele die een doelvariabele moet zijn, is een gemetastaseerte dat bepaalt of cellen in de gegevensset als uitgezaaid (1) worden beschouwd of niet (0). Experimentvariabelen kunnen worden geplaatst in de sectie Meta-kenmerken.
  3. Bemonster de gegevens in een training (80%) en testset (20%). Dubbelklik op het pictogram Gegevenssamppleer en selecteer een steekproeftype vaste gegevens: stel in op 80% en selecteer repliceerbaar en stratificatievakjes. Stratify en cross-valideren van de trainingsset met behulp van 10 plooien ten opzichte van elk model / classifier. Dubbelklik op Testen en score en selecteer Cross validatie met Aantal plooien: ingesteld op 10 en Stratified aangevinkt. Stel de doelklasse in op 1.
  4. Gebruik in deze methode Neural Networks en Random Forest-leeralgoritmen omdat ze robuust zijn voor de gegevens. Kies in het pictogram Willekeurig bos het aantal bomen dat 50 moet zijn en selecteer geen andere opties. Binnen het neurale netwerk icoon kiezen Neuronen per verborgen layer: 100, Activering: ReLu, Solver: Adam, Alpha: 0,0001, en Max Iterations: 200. Echter, deze instellingen zullen aanzienlijk variëren per studie en moet goed worden begrepen voordat de toepassing.
  5. Klik na het instellen van het canvas dubbel op elk pictogram van Bestand naar Voorbeeldgegevens en druk op Toepassen of Gegevens verzenden. Dubbelklik op Testen en score en de trainingsgegevens worden gebruikt om een model te ontwikkelen met behulp van de algoritmen. Na het trainen van het machine learning-model opent u Test & Score opnieuw en selecteert u Testen op testgegevens en sluit u het pop-upvenster om de prestaties van het model te scoren door de cellen in de chip te classificeren op basis van de waarschijnlijkheid dat ze hersenuitzaaibaar zijn van 0 naar 1.
  6. Sla de prestaties van het machine learning-model op in een bestand(tabel 2). Neem het gebied onder de curve (AUC) van de ROC, de nauwkeurigheid en de F1-score. Sla een tweede bestand op dat de afzonderlijke uitgezaaide indexen en classificatiekanen bevat. Dubbelklik op het pictogram Opslaan en klik op Opslaan als om te schrijven om de classificatiekansen in te dienen. Op dezelfde manier kan de ROC-curve worden bekeken door te dubbelklikken op het ROC-analysepictogram en kunnen de modelprestaties worden berekend door te dubbelklikken op het pictogram Verwarringsmatrix.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van deze techniek analyseerden we celtypen gelabeld met verschillende fluorescerende eiwitten of kleurstoffen. We demonstreren het gebruik van deze aanpak met een μmBBN-chip geformuleerd met hCMEC/D3-DsRed en niet-fluorescerende astrocyten. De microvasculaire endotheelcellen van de hersenen werden op een poreus membraan (5 μm spoor geëtst poriën) gezaaid en in een couveusegeplaatst 34 bij 37 °C onder 5% CO2. Na drie dagen werd de samenvloeiing van de endotheellaag bevestigd v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben een nieuwe methode ontwikkeld en gepresenteerd die tools aanpast die vaak worden gebruikt in klinische beeldanalyses voor het meten van extravasatie en migratie van kankercellen via een endotheelbarrière in hersenweefsel. We stellen dat deze aanpak nuttig kan zijn voor zowel in vivo als in vitro metingen; we hebben aangetoond dat het gebruik ervan op een 3D-microfluïdisch systeem recapituleren hersenen vasculatuur. Kankercelmetingen inclusief extradatieafstand, percentage extravasated door volume, sfericiteit e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er zijn geen onthullingen te verklaren.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken het Steeg Lab, bij het Nationaal Kankerinstituut voor de gulle donatie van MDA-MB-231-BR-GFP cellen. Confocale microscopie werd uitgevoerd aan de Universiteit van Michigan Biointerfaces Institute (BI). Flow cytometrie werd uitgevoerd aan de Universiteit van Michigan Flow Cytometry Core. Virale vectoren zijn gemaakt door de Universiteit van Michigan Vector Core. We danken Kelley Kidwell ook voor de begeleiding bij de statistische analyse van deze gegevens.

Financiering:

C.R.O. werd gedeeltelijk ondersteund door een NIH T-32 Training Fellowship (T32CA009676) en 1R21CA245597-01. T.M.W. werd gedeeltelijk ondersteund door 1R21CA245597-01 en het National Center for Advancing Translational Sciences van de National Institutes of Health onder Award Number UL1TR002240. Financiering voor materialen en karakterisering werd verstrekt door National Cancer Institute of the National Institutes of Health onder award nummer 1R21CA245597-01, P30CA046592, 5T32CA009676-23, CA196018, AI116482, METAvivor Foundation, en de Breast Cancer Research Foundation. De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële opvattingen van de National Institutes of Health

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.25% Trypsin-EDTA met fenol roodThermo Fisher Scientific25200056
1.5 mm biopsie puncher met plunjerIntegra LifeSciences Corporation33-31A-P/25
10x MEMThermo Fisher Scientific11430030
150 mm petrischalenFisher ScientificFB0875714
1x DPBS, zonder Ca en MgThermo Fisher Scientific14190144
200uL pipettipFisher Scientific02-707-411
4 inch silicium waferUniversity Wafer452
48 mm breed verpakkingstapeFisher Scientific19-072-097
50 x 75 mm glazen plaatjeFisher Scientific12-550C
A1 confocale microscoopNikon
acetonFisher ScientificA9-20
antibioticum/antimyoticum (penicilline/streptomycine/amfotericine)Gibco15240062
box cutter mesFisher ScientificNC1721575
dissectieschaartjesFisher Scientific08-951-5
DMEM met 4.5 g/L glucoseThermo Fisher Scientific11960-044
dubbelzijdige tapeFisher ScientificNC0879005
EGM-2LonzaCC-3162
Fetaal bovien serum, hitte geïnactiveerdCorningMT35011CV
Fiji softwareImageJ
glazen flesjeFisher Scientific03-341-25D
glutamaxThermo Fisher Scientific35050061
hCMEC/D3EMD MilliporeSCC066
Jupyter notitieblokAnaconda
L-glutamineThermo Fisher Scientific25030081
Matrigel - groeifactor gereduceerd met fenol roodCorningCB-40230A
MDA-MB-231ATCCHTB-26
MDA-MB-231-BR-GFPDr. Patricia Steeg, NIH
N-2 groeisupplementThermo Fisher Scientific17502048
normale humane astrocyten (NHA)LonzaCC-2565
Orange softwareUniversity of Ljubljana
Pasteur pipetteFisher Scientific13-711-9AM
Fotolitografie maskersPhotosciences Incorporated
pLL3.7-dsRedUniversity of Michigan Vector Core
pLL-EV-GFPUniversity of Michigan Vector Core
pLOX-TERT-iresTKAddgene12245
pMD2.GAddgene12259
polycarbonaat membraan, 5um poriegrootteMilliporeTMTP04700
psPAX2Addgene12260
PureCol, 3 mg/mLAdvanced Biomatrix5005Type I bovien collageen
natriumbicarbonaatThermo Fisher Scientific25080094
natriumpyruvaatThermo Fisher Scientific11360070
Solo bekerFisher ScientificNC1416545
SU-8 2075MicroChem CorporationY111074 0500L1GL
SU8 ontwikkelaarMicroChem CorporationY020100 4000L1PE
Sylgard 184Ellsworth Adhesive CompanyNC0162601
TolueenSigma-Aldrich179965-1L
Trichlor perfluoro octyl silaaneSigma-Aldrich448931-10G

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rastogi, K., et al. Palliation of Brain Metastases: Analysis of Prognostic Factors Affecting Overall Survival. Indian Journal of Palliative Care. 24 (3), 308-312 (2018).
  2. Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091(2019).
  3. Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
  4. Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).
  5. Brekhman, V., Neufeld, G. A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion. BMC Cancer. 9, 415(2009).
  6. Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology. 294, 15-22 (2005).
  7. Poissonnier, A., Legembre, P. Boyden Chamber Assay to Study of Cell Migration Induced by Metalloprotease Cleaved-CD95L. Methods in Molecular Biology. 1557, 117-123 (2017).
  8. Li, X., Yang, H., Huang, H., Zhu, T. CELLCOUNTER: novel open-source software for counting cell migration and invasion in vitro. BioMed Research International. 2014, 863564(2014).
  9. Little, A. C., et al. IL-4/IL-13 Stimulated Macrophages Enhance Breast Cancer Invasion Via Rho-GTPase Regulation of Synergistic VEGF/CCL-18 Signaling. Frontiers in Oncology. 9, 456(2019).
  10. Allen, S. G., et al. Macrophages Enhance Migration in Inflammatory Breast Cancer Cells via RhoC GTPase Signaling. Scientific Reports. 6, 39190(2016).
  11. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
  12. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  13. Chen, Y. C., et al. Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations. Scientific Reports. 5, 9980(2015).
  14. Choi, Y. P., et al. Cancer-associated fibroblast promote transmigration through endothelial brain cells in three-dimensional in vitro models. International Journal of Cancer. 135 (9), 2024-2033 (2014).
  15. Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. Journal of Neuroscience Methods. 232, 165-172 (2014).
  16. Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
  17. Schroeder, W., Martin, K., Lorenson, B. The Visualization Toolkit. 4th edn. , Kitware. (2006).
  18. Wells, W. M., Grimson, W. L., Kikinis, R., Jolesz, F. A. Adaptive segmentation of MRI data. IEEE Transactions on Medical Imaging. 15 (4), 429-442 (1996).
  19. Agarwal, S. K., Singh, S., Ghuman, S. S., Sharma, S., Lahiri, A. K. Radiological assessment of the Indian children with congenital sensorineural hearing loss. International Journal of Otolaryngology. 2014, 808759(2014).
  20. Mansfield, P., Maudsley, A. A. Medical imaging by NMR. The British Journal of Radiology. 50 (591), 188-194 (1977).
  21. Plewes, D. B., Kucharczyk, W. Physics of MRI: a primer. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 35 (5), 1038-1054 (2012).
  22. Batteux, C., Haidar, M. A., Bonnet, D. 3D-Printed Models for Surgical Planning in Complex Congenital Heart Diseases: A Systematic Review. Frontiers in Pediatrics. 7, 23(2019).
  23. Thibault, F., et al. MRI for surgical planning in patients with breast cancer who undergo preoperative chemotherapy. American Journal of Roentgenology. 183 (4), 1159-1168 (2004).
  24. Oliver, C. R., et al. A platform for artificial intelligence based identification of the extravasation potential of cancer cells into the brain metastatic niche. Lab on a Chip. 19 (7), 1162-1173 (2019).
  25. Gril, B., et al. Reactive astrocytic S1P3 signaling modulates the blood-tumor barrier in brain metastases. Nature Communications. 9 (1), 2705(2018).
  26. Badilescu, S., Packirisamy, M. BioMEMS: Science And Engineering Perspectives. , Taylor & Francis/CRC Press. (2011).
  27. Liu, C. Foundations of MEMS. 2nd edn. , Prentice Hall. (2012).
  28. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab on a Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
  29. Lockman, P. R., et al. Heterogeneous blood-tumor barrier permeability determines drug efficacy in experimental brain metastases of breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (23), 5664-5678 (2010).
  30. Ryan Oliver, C., W, T. M. Con-tom: A Jupyter Notebook for Analyzing the tumor micro-environment in confocal images. Zenodo. , Version 0.8, 3825719 (2020).
  31. Lorensen, W. E., Johnson, C., Kasik, D., Whitton, M. C. History of the Marching Cubes Algorithm. IEEE Computer Graphics and Applications. 40 (2), 8-15 (2020).
  32. Kleinbaum, D. G., Kupper, L. L. Applied regression analysis and other multivariable methods. , Duxbury Press. (1978).
  33. Berg, M. d Computational geometry : algorithms and applications, 2nd rev. edn. , Springer. (2000).
  34. Esch, M. B., Post, D. J., Shuler, M. L., Stokol, T. Characterization of in vitro endothelial linings grown within microfluidic channels. Tissue Engineering Part A. 17 (23-24), 2965-2971 (2011).
  35. Brinkley, B. R., et al. Variations in cell form and cytoskeleton in human breast carcinoma cells in vitro. Cancer Research. 40 (9), 3118-3129 (1980).
  36. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 33(2013).
  37. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  38. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 16(2013).
  39. Dello Russo, C., et al. The human microglial HMC3 cell line: where do we stand? A systematic literature review. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 259(2018).
  40. Dun, M. D., et al. Proteotranscriptomic Profiling of 231-BR Breast Cancer Cells: Identification of Potential Biomarkers and Therapeutic Targets for Brain Metastasis. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (9), 2316-2330 (2015).
  41. Xing, F., et al. Reactive astrocytes promote the metastatic growth of breast cancer stem-like cells by activating Notch signalling in brain. EMBO Molecular Medicine. 5 (3), 384-396 (2013).
  42. Zhang, B., Radisic, M. Organ-on-a-chip devices advance to market. Lab on a Chip. 17 (14), 2395-2420 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Hersenmetastasenmicrofluidisch BBNextravasatie van kankercellenendotheelbarri refluorescentie imagingfenotypische analyse

Gerelateerde artikelen