Methodenartikel

Eencellige elektroporatie over verschillende organotypische slicecultuur van hippocampale excitatory en klassespecifieke remmende neuronen

DOI:

10.3791/61662

⸱

6 oktober 2020

 ,  , 
1Brudnick Neuropsychiatric Research Institute, Department of Neurobiology, University of Massachusetts Medical School, 2Interdisciplinary Graduate Program, University of Massachusetts Medical School, 3UMMS MD/PhD Program, University of Massachusetts Medical School

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor eencellige elektroporatie dat genen kan leveren in zowel excitatory als remmende neuronen in een reeks in vitro hippocampale slice-cultuurleeftijden. Onze aanpak zorgt voor een nauwkeurige en efficiënte expressie van genen in individuele cellen, die kunnen worden gebruikt om cel-autonome en intercellulaire functies te onderzoeken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektroporatie heeft zich gevestigd als een kritische methode voor het overbrengen van specifieke genen in cellen om hun functie te begrijpen. Hier beschrijven we een eencellige elektroporatietechniek die de efficiëntie (~ 80%) van in vitro gentransfectie in excitatory en klassespecifieke remmende neuronen in muis organotypische hippocampale slice-cultuur maximaliseert. Met behulp van grote glaselektroden, tetrodotoxine-bevattende kunstmatige cerebrospinale vloeistof en milde elektrische pulsen, leverden we een gen van belang in gekweekte hippocampale CA1-piramidale neuronen en remmende interneurons. Bovendien kon elektroporatie worden uitgevoerd in gekweekte hippocampale slices tot 21 dagen in vitro zonder vermindering van de transfectie-efficiëntie, waardoor de ontwikkelingsstadia van de segmentcultuur konden worden bestudeerd. Met de interesse om de moleculaire functies van genen in een breed scala van celtypen te onderzoeken, toont onze methode een betrouwbare en eenvoudige benadering van in vitro gentransfectie in muishersenweefsel die kan worden uitgevoerd met bestaande elektrofysiologische apparatuur en technieken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de moleculaire biologie is een van de belangrijkste overwegingen voor een onderzoeker hoe een gen van belang in een cel of populatie cellen kan worden afgeleverd om zijn functie op te helderen. De verschillende leveringsmethoden kunnen worden gecategoriseerd als biologisch (bv. een virale vector), chemisch (bv. calciumfosfaat of lipide) of fysisch (bv. elektroporatie, micro-injectie of biolistica)1,2. Biologische methoden zijn zeer efficiënt en kunnen celtypespecifiek zijn, maar worden beperkt door de ontwikkeling van specifieke genetische hulpmiddelen. Chemische benaderingen zijn zeer krachtig in vitro, maar transfecties zijn over het algemeen willekeurig; verder zijn deze benaderingen meestal alleen voorbehouden aan primaire cellen. Van de fysieke benaderingen is biolistics technisch gezien het eenvoudigst en gemakkelijkst, maar produceert opnieuw willekeurige transfectieresultaten met een relatief laag rendement. Voor toepassingen die overdracht naar specifieke cellen vereisen zonder dat we genetische hulpmiddelen hoeven te ontwikkelen, kijken we naar eencellige elektroporatie3,4.

Terwijl elektroporatie in de afgelopen twintig jaar alleen betrekking had op veldelektroporatie, zijn er in de afgelopen twintig jaar meerdere in vitro en in vivo eencellige elektroporatieprotocollen ontwikkeld om specificiteit en efficiëntie5,6,7te verbeteren , wat aantoont dat elektroporatie kan worden gebruikt om genen over te dragen naar individuele cellen en daarom uiterst nauwkeurig kan zijn. De procedures zijn echter technisch veeleisend, tijdrovend en relatief inefficiënt. Recentere artikelen hebben inderdaad de haalbaarheid onderzocht van gemechaniseerde elektroporatieplatforms8,9, die kunnen helpen om verschillende van deze barrières weg te nemen voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het installeren van dergelijke robotica. Maar voor degenen die op zoek zijn naar eenvoudigere middelen, blijven de problemen met elektroporatie, namelijk celdood, transfectiefalen en pipetverstopping, een zorg.

We hebben onlangs een elektroporatiemethode ontwikkeld die gebruik maakt van glazen pipetten met grotere punt, mildere elektrische pulsparameters en een unieke drukcyclile stap, die een veel hogere transfectie-efficiëntie in excitatory neuronen genereerde dan eerdere methoden, en ons voor het eerst in staat stelde om genen in remmende interneurons te transfecteren, waaronder somatostatine-uitdrukkende remmende interneurons in het hippocampale CA1-gebied van muisorganotypische plakcultuur10. De betrouwbaarheid van deze elektroporatiemethode in verschillende remmende interneurontypen en neuronale ontwikkelingsstadia is echter niet aangepakt. Hier hebben we aangetoond dat deze elektroporatietechniek in staat is om genen over te zetten in zowel excitatory neuronen als verschillende klassen van interneurons. Belangrijk is dat de transfectie-efficiëntie hoog was, ongeacht de dagen in vitro (DIV) slice culture age getest. Deze gevestigde en gebruiksvriendelijke techniek wordt ten zeerste aanbevolen aan elke onderzoeker die geïnteresseerd is in het gebruik van eencellige elektroporatie voor verschillende celtypen in de context van in vitro muishersenweefsel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierprotocollen werden beoordeeld en goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de University of Massachusetts Medical School. Slice culture preparation, plasmidevoorbereiding en elektroporatie worden ook beschreven in onze eerder gepubliceerde methoden en kunnen worden verwezen voor aanvullende informatie10.

1. Snijd cultuurbereiding

  1. Bereid muis organotypische hippocampale plakculturen voor zoals eerder beschreven11, met behulp van postnatale 6- tot 7-daagse oude muizen van beide geslachten.
    1. Bereid dissectiemedia voor organotypische plakcultuur bestaande uit (in mM): 238 sucrose, 2,5 KCl, 1 CaCl2,4 MgCl2,26 NaHCO3,1 NaH2PO4en 11 glucose in gedeïoniseerd water, vervolgens gas met 5% CO2/95% O2 tot een pH van 7,4.
    2. Bereid organotypische plakcultuurmedia bestaande uit: 78,8% (v/v) Minimum Essential Medium Eagle, 20% (v/v) paardenserum, 17,9 mM NaHCO3, 26,6 mM glucose, 2 M CaCl 2 , 2 M MgSO4, 30 mM HEPES, insuline (1 μg/ml) en 0,06 mM ascorbinezuur. Stel de osmolariteit in op 310-330 osmol met behulp van een osmometer.
    3. Ontleed hippocampi uit de hele hersenen met behulp van twee spatels en snijd (400 μm) met behulp van een tissue chopper. Afzonderlijke segmenten met behulp van twee tangen en breng over op 30 mm celkweekinzetstukken in een 6-putplaat gevuld met kweekmedia (950 μL) onder de inzetstukken.
  2. Bewaar organotypische plakculturen in een weefselkweek-incubator (35°C, 5% CO2)en verander de plakkweekmedia om de twee dagen.

2. Plasmide voorbereiding

  1. Bereid de plasmide voor op het gen van belang.
    1. Subklonen verbeterd groen fluorescerend eiwit (EGFP) gen in een pCAG vector.
    2. Zuiver pCAG-EGFP plasmide met een endotoxinevrije zuiveringskit en los op in een interne oplossing die bestaat uit met diethylpyrocarbonaat behandeld water met 140 mM K-methaansulfaat, 0,2 mM EGTA, 2 mM MgCl2en 10 mM HEPES, aangepast aan pH 7,3 met KOH (plasmideconcentratie: 0,1 μg/μL).

3. Glazen pipet voorbereiding

  1. Trek borosilicaat glazen pipetten (4,5 – 8 MΩ) op een micropipettrekker (figuur 1A).
    OPMERKING: De glazen pipetten die worden gebruikt voor patchklemopnamen met hele cellen zijn ideaal voor elektroporatie.
  2. Bak glazen pipetten 's nachts op 200°C om te steriliseren.
  3. Controleer de grootte van de pipetpunt onder een dissectiemicroscoop om de elektrische weerstand te benaderen.
    1. Optioneel: Controleer de pipetweerstand door de pipet aan de elektroporatieelektrode te bevestigen en gebruik de micromanipulator om de pipettip in de met filter gesteriliseerde kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) te manoeuvreren die (in mM) bevat: 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5CaCl2,5 MgCl2, 26NaHCO3,1 NaH2 PO 4 en 1 glucose Bevestig de werkelijke weerstand met behulp van de uitlezing op de elektroporator.
      OPMERKING: Hoe scherper de pipetpunt, hoe groter de elektrische weerstand. De pipetweerstand moet lager zijn dan 10 MΩ. Glazen pipetten met een hoge pipetweerstand (figuur 1B) verstoppen vaak aan de punt tijdens herhaalde elektroporatie.

4. Elektroporation installatieopstelling

  1. Installeer de elektroporator op een standaard elektrofysiologie-installatie voor hele cellen, uitgerust met een rechtopstaande microscoop gemonteerd op een schakeltafel met een micromanipulator en peristaltische pomp.
  2. Installeer de kop van de elektroporator op een micromanipulator en sluit een paar luidsprekers aan op de elektroporator. Sluit de elektroporator aan op een voetpedaal dat kan worden gebruikt om een puls te verzenden wanneer deze klaar is.
    OPMERKING: De luidsprekers geven een toon af wanneer ze worden ingeschakeld, wat een indicator is van de elektrische weerstand bij de elektrode. Dit maakt het mogelijk om relatieve veranderingen in weerstand te bepalen zonder de aandacht van de procedure af te trekken.

5. Elektroporatievoorbereiding

  1. Breng plak kweekinzetstukken over van 6 putplaten naar 3 cm Petrischalen geladen met 900 μL kweekmedia en bewaar in een tafelblad CO2 incubator tot ze klaar zijn om elektroporatie uit te voeren.
    1. Pre-incubate verse kweekinzetstukken met plak cultuur media (1 ml) gedurende ten minste 30 minuten in een petrischaal van 3,5 cm tot kweekschijfjes na elektroporatie.
  2. Reinig en bereid het booreiland voor op elektroporatie.
    1. Doordrenk de lijnen gedurende 5 minuten met 10% bleekmiddel om de slang en kamer te steriliseren voordat u het experiment voor de dag begint.
    2. Doordrenk de lijnen met gedeioneerd autoclaafwater gedurende ten minste 30 minuten om volledig te spoelen.
    3. Doordrenkt de lijnen met met filter gesteriliseerde aCSF die 0,001 mM tetrodotoxine (TTX) bevat.
      OPMERKING: TTX minimaliseert cellulaire toxiciteit en overlijden als gevolg van overexcitatie van interneurons10.
  3. Stel de pulsparameters van de elektroporator in: amplitude van –5 V, vierkante puls, trein van 500 ms, frequentie van 50 Hz en een pulsbreedte van 500 μs.
  4. Vul de glazen pipet met 5 μL plasmidehoudende interne oplossing.
    1. Verwijder eventuele vastzittende luchtbellen van de pipettip door meerdere keren te tikken en zachtjes op de punt te tikken.
    2. Controleer de punt op beschadigingen door deze te visualiseren onder een dissectiemicroscoop of door stap 3.3.1 te herhalen om de pipetweerstand te controleren.
      OPMERKING: Als de punt beschadigd is, moet de glazen pipet worden weggegooid en deze stap moet worden herhaald met een nieuwe glazen pipet die eerder in stap 3 is voorbereid.
  5. Bevestig de pipettip stevig aan de elektrode en zet de luidsprekers aan. Noteer de uitlezing (de weerstand van de pipet) van de elektroporator wanneer de tip contact heeft gemaakt met het aCSF-medium.
  6. Snijd het kweekinzetmembraan met een scherp mes en isoleer één plakcultuur. Breng de plakcultuur voorzichtig over naar de elektroporatiekamer met behulp van een scherpe hoekige tang en bevestig de positie met een plakanker.
    1. Houd de plakcultuur niet langer dan 30 minuten per keer buiten de incubator om bijwerkingen zoals veranderingen in neuronale gezondheid of functie12te voorkomen.

6. Elektroporaatcellen van belang

  1. Oefen positieve druk uit op de pipet met de mond of met behulp van een spuit van 1 ml (druk van 0,2 - 0,5 ml) die aan de slang is bevestigd.
  2. Gebruik de 3-dimensionale knopbediening van de micromanipulator om de pipetpunt in de buurt van het oppervlak van de plakcultuur te manoeuvreren.
  3. Kies een doelcel en benader deze, houd de positieve druk toegepast totdat er een kuiltje op het celoppervlak ontstaat, zichtbaar op de microscoop.
  4. Drukcycli uitvoeren.
    1. Oefen snel milde negatieve druk uit via de mond, zodat er een losse afdichting ontstaat tussen de pipetpunt en het plasmamembraan, visueel aangegeven door het membraan dat enigszins in de pipetpunt omhoog gaat. Let op een toename (~2,5x de beginweerstand) in pipetweerstand door te luisteren naar een toename van de toon die uit de luidsprekers komt. Breng snel weer positieve druk aan zodat het kuiltje zich opnieuw vormt.
    2. Voltooi onmiddellijk nog minstens twee drukcycli zonder te pauzeren en houd vervolgens de negatieve druk 1 s vast.
      OPMERKING: Pauzeren tussen cycli, te veel druk uitoefenen of de negatieve druk te lang vasthouden, kan aanzienlijke celschade veroorzaken en mogelijk de cel laten afsterven tijdens elektroporatie.
  5. Pulseer de elektroporator snel eenmaal met behulp van het voetpedaal wanneer de toon van de luidsprekers een stabiele top in toonhoogte bereikt, wat wijst op een piek elektrische weerstand. Wacht niet langer dan 1 s bij de piekweerstand voordat u de puls verzendt.
    OPMERKING: We hebben geen off-target elektroporatie waargenomen bij het gebruik van dit protocol10. Alleen de cellen die tijdens drukcycli in contact kwamen met de glazen pipet werden getransfecteerd. Het plaatsen van de pipet in de buurt van andere neuronen leidt niet tot gentransfectie.
  6. Trek de pipet voorzichtig ongeveer 100 μm uit de cel zonder druk uit te oefenen.
  7. Breng opnieuw positieve druk aan, controleer of de weerstand vergelijkbaar is met de geregistreerde uitlezing in stap 5.5 en benader vervolgens de volgende cel.
    1. Verwijder potentiële klompen, visueel aangegeven of door een significant verhoogde (>15% hogere) pipetweerstand na elektroporatie, door positieve druk uit te oefenen.
      OPMERKING: Als er geen zichtbare verstopping is en de weerstand nog steeds aanzienlijk hoger is, gooi dan de pipet weg en gebruik een nieuwe. Gemiddeld kan een pipet worden gebruikt voor maximaal 20 elektroporatiegebeurtenissen als de gebruiker voorzichtig is10.
  8. Breng na elektroporatie de plakcultuur over op een verse kweekinzet en incubeer maximaal 3 dagen bij 35°C in de incubator.

7. Fixatie, kleuring en beeldvorming van organotypische hippocampale plakculturen

  1. Fix elektroporated organotypic slice culturen 2 – 3 dagen na transfectie met 4% paraformaldehyde en 4% sucrose in 0,01 M fosfaat gebufferde zoutoplossing (1x PBS) gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur.
  2. Verwijder fixatieve en incubeer plakjes in 30% sacharose in 0,1 M fosfaatbuffer (1x PB) gedurende 2 uur.
  3. Leg plakjes op een glijbaanglas en vries ze in door het schuifglas op gemalen droogijs te leggen. Ontdooi de plakjes op kamertemperatuur en breng ze over op een 6-putplaat gevuld met 1x PBS.
  4. Bevlek de plakjes met muis anti-GFP en konijn anti-RFP antilichamen in GDB buffer (0,1% gelatine, 0,3% Triton X-100, 450 mM NaCl, en 32% 1x PB, pH 7,4) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
  5. Was plakjes met 1x PBS drie keer op kamertemperatuur gedurende 10 minuten per wasbeurt.
  6. Incubeer plakjes met antimuis Alexa 488-geconjugeerd secundair antilichaam en anti-konijn Alexa 594-geconjugeerd secundair antilichaam in GDB-buffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Incubeer plakjes met DAPI (4 μg/ml) in 1x PBS gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
  7. Was plakjes met 1x PBS drie keer op kamertemperatuur gedurende 3 minuten per wasbeurt.
  8. Monteer plakjes op glazen dia's met behulp van montagemedium en voer fluorescentiebeeldvorming uit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onze eencellige elektroporatie is in staat om genen nauwkeurig af te leveren in visueel geïdentificeerde excitatory en remmende neuronen. We elektroporated drie verschillende neuronale celtypes op drie verschillende tijdstippen. Parvalbumine (Pv) of vesiculaire glutamaat type 3 (VGT3) die neuronen uitdrukt, werden gevisualiseerd door Pvcre (JAX #008069) of VGT3cre (JAX #018147) lijnen te kruisen met TdTomato (een variant van rode fluorescerende eiwit) reporter lijn (Jax #007905), respectievelijk gen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven hier een elektroporatiemethode die zowel excitatory als remmende neuronen met hoge efficiëntie en precisie transfecteert. Ons geoptimaliseerde elektroporatieprotocol heeft drie innovatieve doorbraken om een zeer efficiënte gentransfectie te bereiken. Onze eerste wijziging was om de pipetgrootte te vergroten in vergelijking met eerder gepubliceerde protocollen3,5,6. Deze verandering stelde ons in staat om veel neur...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health Grants (R01NS085215 to K.F., T32 GM107000 en F30MH122146 to A.C.). De auteurs danken mevrouw Naoe Watanabe voor vakkundige technische bijstand.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Plasmidvoorbereiding
PlasmidzuiveringsetQiagen12362
Organotypische plakjescultuurvoorbereiding
6 Wel PlatenGREINER BIO-ONE657160
Dumont #5/45 ForcepsFST#5/45Gebogen dissectiepincet voor organotypische plakjescultuurvoorbereiding
Flask Filter UnitMilliporeSCHVU02REFiltratie en opslag van kweekmedia
IncubatorBinderBD C150-UL
McIlwain Tissue ChopperTED PELLA, INC.10180Weefselknipmachine voor organotypische plakjescultuurvoorbereiding
Millicell Cell Culture Insert, 30 mmMilliporePIHP03050Organotypische plakjescultuur inserts
OsmometerPrecision SystemsOSMETTE II
PTFE gecoate spatelsCole-ParmerSK-06369-11
SchaarFST14958-09
Stereo MicroscoopOlympusSZ61
Steriele vacuüm filtratie systeemMilliporeSCGPT01REFiltratie en opslag van aCSF
Elektrode voorbereiding
Kapillare glazenWarner Instruments640796
MicropipettrekkerSutter InstrumentP-1000Puller
OvenBinderBD (E2)
Puller FilamentSutter InstrumentFB330BPuller
Single-cell elektroporatie en fluorescentie beeldvorming #1
3,5 mm Falcon Petri DishesBD Falcon353001
AirtableTMC63-7512E
CCD cameraQ ImagingRetiga-2000DCCamera
Elektroporatie systeemMolecular DevicesAxoporator 800AElektroporator
Fluorescentie verlichtingssysteemPriorLumen 200
ManipulatorSutter InstrumentMPC-385Manipulator
Metamorph softwareMolecular DevicesBeeldverwerving
Peristaltiek PompRaininDynamax, RP-2Perfusie pomp
Verschuifbare TafelLuigs & Neuman240 XY
LuidsprekerOnbekendLuidsprekers aangesloten op de elektroporation
Stereo MicroscoopOlympusSZ30
IncubatorThermo ScientificMIDI 40
Staande MicroscoopOlympusBX61WI
Fluorescentie beeldvorming #2
All-in-One Fluorescentie MicroscoopKeyenceBZ-X710

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Washbourne, P., McAllister, A. K. Techniques for gene transfer into neurons. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 566-573 (2002).
  2. Capecchi, M. R. High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells. Cell. 22 (2), Pt 2 479-488 (1980).
  3. Rae, J. L., Levis, R. A. Single-cell electroporation. Pflugers Archives: European Journal of Physiology. 443 (4), 664-670 (2002).
  4. Teruel, M. N., Blanpied, T. A., Shen, K., Augustine, G. J., Meyer, T. A versatile microporation technique for the transfection of cultured CNS neurons. Journal of Neuroscience Methods. 93 (1), 37-48 (1999).
  5. Rathenberg, J., Nevian, T., Witzemann, V. High-efficiency transfection of individual neurons using modified electrophysiology techniques. Journal of Neuroscience Methods. 126 (1), 91-98 (2003).
  6. Tanaka, M., Yanagawa, Y., Hirashima, N. Transfer of small interfering RNA by single-cell electroporation in cerebellar cell cultures. Journal of Neuroscience Methods. 178 (1), 80-86 (2009).
  7. Wiegert, J. S., Gee, C. E., Oertner, T. G. Single-Cell Electroporation of Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (2), 094904(2017).
  8. Li, L., et al. A robot for high yield electrophysiology and morphology of single neurons in vivo. Nature Communication. 8, 15604(2017).
  9. Steinmeyer, J. D., Yanik, M. F. High-throughput single-cell manipulation in brain tissue. PLoS One. 7 (4), 35603(2012).
  10. Keener, D. G., Cheung, A., Futai, K. A highly efficient method for single-cell electroporation in mouse organotypic hippocampal slice culture. Journal of Neuroscience Methods. 337, 108632(2020).
  11. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
  12. Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing. Neuron. 57 (6), 819-826 (2008).
  13. Li, Y., et al. Electroporation on microchips: the harmful effects of pH changes and scaling down. Science Reports. 5, 17817(2015).
  14. Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
  15. Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue. Nature Neurosciences. 15 (2), 329-337 (2011).
  16. Zhang, Y., Yu, L. C. Single-cell microinjection technology in cell biology. Bioessays. 30 (6), 606-610 (2008).
  17. De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. Journal of Physiology. 550, Pt 1 135-147 (2003).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Hippocampale neuronen van muizengen transfectieexcitatoire inhibitoire neuronenglaselektrodetechniektetrodotoxine ACSFelectroporatiekamerpressure cycling methodeCA1 piramidale neuronen

Gerelateerde artikelen