Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Bovine Ovarian Cortex Weefselkweek

5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61668

⸱

14 januari 2021

 ,  ,  , 
1Department of Animal Science, University of Nebraska-Lincoln, 2Department of Animal Production, School of Agriculture, University of Jordan

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

In vitro cultuur van runder ovarium cortex en het effect van nutritionele trap-stap dieet op ovariële micro-omgeving wordt gepresenteerd. Ovariële cortexstukken werden gedurende zeven dagen gekweekt en steroïden, cytokines en follikelstadia werden geëvalueerd. De Stair-Step dieetbehandeling had een verhoogde steroidogenese, wat resulteerde in follikelprogressie in cultuur.

Samenvatting

Follikelontwikkeling van het primordiale tot antrale stadium is een dynamisch proces in de ovariële cortex, dat endocriene en paracriene factoren van somatische cellen en cumulus cel-oöcytcommunicatie omvat. Er is weinig bekend over de ovariële micro-omgeving en hoe de cytokines en steroïden die in het omringende milieu worden geproduceerd, de follikelprogressie of -arrestatie beïnvloeden. In vitro cultuur van de ovariële cortex maakt het mogelijk om follikels te ontwikkelen in een genormaliseerde omgeving die ondersteund blijft door aangrenzend stroma. Ons doel was om het effect van het nutritionele Stair-Step dieet op de ovariële micro-omgeving (follikelontwikkeling, steroïde en cytokineproductie) te bepalen door middel van in vitro cultuur van de boviene ovariumschors. Om dit te bereiken, werden ovariële corticale stukjes verwijderd van vaarzen die voorafgaand aan de puberteit twee verschillende nutritioneel ontwikkelde schema's ondergingen: Control (traditionele voedingsontwikkeling) en Stair-Step (voeding en beperking tijdens de ontwikkeling) die in ongeveer 0,5-1 mm3-stukken werden gesneden. Deze stukken werden vervolgens door een reeks wasbeurten geleid en op een weefselkweekinzet geplaatst die in een put met het kweekmedium van Waymouth wordt geplaatst. De ovariële cortex werd gedurende 7 dagen gekweekt met dagelijkse veranderingen in de cultuurmedia. Histologische sectie werd uitgevoerd om follikelstadiumveranderingen voor en na de kweek te bepalen om de effecten van voeding en de impact van cultuur te bepalen zonder aanvullende behandeling. Cortex cultuur medium werd gepoold over dagen om steroïden, steroïde metabolieten en cytokines te meten. Er waren tendensen voor verhoogde steroïde hormonen in de ovariële micro-omgeving die follikelprogressie mogelijk maakten in de Stair-Step versus Control ovariële cortexculturen. De ovariële cortexcultuurtechniek zorgt voor een beter begrip van de ovariële micro-omgeving en hoe veranderingen in endocriene secretie de follikelprogressie en -groei van zowel in vivo als in vitro behandelingen kunnen beïnvloeden. Deze kweekmethode kan ook gunstig zijn voor het testen van potentiële therapieën die de follikelprogressie bij vrouwen kunnen verbeteren om de vruchtbaarheid te bevorderen.

Inleiding

De ovariële cortex vertegenwoordigt de buitenste laag van de eierstok waar follikelontwikkeling optreedt1. Primordiale follikels, aanvankelijk gestopt in ontwikkeling, zullen worden geactiveerd om primaire, secundaire en vervolgens antrale of tertiaire follikels te worden op basis van paracriene en gonadotrofine-ingangen1,2,3,4. Om fysiologische processen in de eierstok beter te begrijpen, kan weefselkweek worden gebruikt als een in vitro model, waardoor een gecontroleerde omgeving mogelijk is om experimenten uit te voeren. Veel studies hebben gebruik gemaakt van eierstokweefselkweek voor onderzoek naar geassisteerde voortplantingstechnologie, vruchtbaarheidsbehoud en eierstokkanker5,6,7. Ovariële weefselkweek heeft ook gediend als een model voor het onderzoeken van reproductieve toxines die de gezondheid van de eierstokken en de etiologie van reproductieve aandoeningen zoals polycysteus ovariumsyndroom (PCOS)8,9,10,11schaden. Dit cultuursysteem is dus toepasbaar op een breed scala aan specialiteiten.

Bij knaagdieren zijn hele foetale of perinatale geslachtsklieren gebruikt in experimenten met reproductieve biologie12,13,14,15. Gonaden van grotere huisdieren kunnen echter niet als hele organen worden gekweekt vanwege hun grote omvang en potentiële degeneratie. Daarom wordt de ovariële cortex van runderen en niet-menselijke primaten in kleinere stukken gesneden16,17,18. Veel studies hebben kleine ovariële cortexstukken gekweekt om verschillende groeifactor (en) te bestuderen in primordiale follikelinitiatie bij gedomesticeerd vee en niet-menselijke primaten1,17,18,19. Het gebruik van ovariële cortexcultuur heeft ook primordiale follikelinitiatie aangetoond in afwezigheid van serum voor corticale stukjes van runderen en primaten gekweekt gedurende 7 dagen20. Yang en Fortune behandelden in 2006 foetale ovariële cortexcultuurmedium met een reeks testosterondoses gedurende 10 dagen en merkten op dat de 10-7 M-concentratie van testosteron de follikelrekrutering, overleving en verhoogde progressie van follikels in een vroeg stadiumverhoogde 19. In 2007 rapporteerden Yang en Fortune met behulp van ovariële cortexculturen van runderfoetussen (5-8 maanden zwangerschap) een rol voor vasculaire endotheliale groeifactor A (VEGFA) in de primaire naar secundaire follikelovergang21. Bovendien heeft ons laboratorium ovariële cortexculturen gebruikt om aan te tonen hoe VEGFA-isovormen (angiogene, antiangiogene en een combinatie) verschillende signaaltransductieroutes kunnen reguleren via de Kinase-domeinreceptor (KDR), de belangrijkste signaaltransductiereceptor die VEGFA bindt16. Deze informatie zorgde voor een beter begrip van hoe verschillende VEGFA-isovormen signaalroutes beïnvloeden om follikelprogressie of -arrestatie uit te lokken. Alles bij elkaar genomen kan het kweken van stukken van de ovariële cortex in vitro met verschillende steroïden of groeifactoren een waardevolle test zijn om effecten te bepalen op mechanismen die folliculogenese reguleren. Evenzo kunnen dieren die zijn ontwikkeld op verschillende voedingsregimes veranderde ovariële micro-omgevingen hebben, die folliculogenese kunnen bevorderen of remmen die de vrouwelijke reproductieve volwassenheid beïnvloedt. Ons doel in het huidige manuscript is dus om de boviene cortexcultuurtechniek te rapporteren en te bepalen of er verschillen zijn in ovariële micro-omgevingen na in vitro cultuur van runderschors van vaarzen die ofwel Control- of Stair-Step-diëten kregen verzameld op de leeftijd van 13 maanden zoals eerder beschreven16.

Daarom was onze volgende stap om de ovariële micro-omgeving te bepalen in deze vaarzen die werden ontwikkeld met verschillende voedingsdiëten. We evalueerden de ovariële cortex van vaarzen die werden gevoed met een Stair-Step- of Control-dieet. Controle vaarzen kregen gedurende 84 dagen een onderhoudsdieet aangeboden van 97,9 g/kg0,75. Het Stair-Step dieet werd gestart na 8 maanden met een beperkt gevoed dieet van 67,4 g/kg0,75 gedurende 84 dagen. Na de eerste 84 dagen, terwijl controle vaarzen 97,9 g / kg0,75 blevenontvangen, kregen de Stair-Step runder vaarzen nog 68 dagen 118,9 g / kg0,75 aangeboden, waarna ze op de leeftijd van 13 maanden16 werden geïnvariectomie voor het bestuderen van veranderingen in folliculaire stadia en morfologie voor en na de kweek. We hebben ook getest op verschillen in steroïden, steroïde metabolieten, chemokines en cytokines die worden uitgescheiden in cortexmedia. Steroïden en andere metabolieten werden gemeten om te bepalen of er directe effecten waren van behandelingen die in vivo en/of in vitro werden uitgevoerd op de levensvatbaarheid en productiviteit van weefsel. Veranderingen in de ovariële micro-omgeving voorafgaand aan en na de kweek zorgden voor een momentopname van het endocriene milieu en folliculogenese voorafgaand aan de kweek en hoe cultuur of behandeling tijdens de kweek de follikelprogressie of -arrestatie beïnvloedt.

Eierstokken werden verzameld nadat ovariectomie werd uitgevoerd in het U.S. Meat Animal Research Center (USMARC) volgens hun IACUC-procedures van Control en Stair-Step vaarzen op de leeftijd van 13 maanden op de leeftijd van16, gereinigd met steriele fosfaatbufferzoutoplossing (PBS) wasbeurten met 0,1% antibioticum om bloed en andere verontreinigingen te verwijderen, overtollig weefsel bijgesneden en vervoerd naar het reproductieve fysiologielaboratorium van de Universiteit van Nebraska-Lincoln (UNL) UNL bij 37 ° C23 . Bij UNL werden stukjes ovariële cortex in kleine vierkante stukjes gesneden (~ 0,5-1 mm3; Figuur 1) en gedurende 7 dagen gekweekt(figuur 2). Histologie werd uitgevoerd op de cortexkweekdia's voor en na de kweek om follikelsstadia16,24 (figuur 3 en figuur 4) en extracellulaire matrixeiwitten te bepalen die kunnen wijzen op fibrose (Picro-Sirus Red, PSR; Figuur 5). Dit maakte het mogelijk om het effect van in vivo voedingsregimes op follikelstadia te bepalen en maakte vergelijking van 7 dagen ovariële cortex op follikelstadia en follikelprogressie mogelijk. Gedurende de kweek werd het medium dagelijks verzameld en verschoond (ongeveer 70% van de media werd elke dag verzameld; 250 μL / put) zodat dagelijkse hormonen / cytokines / chemokines kunnen worden beoordeeld of samengevoegd gedurende dagen om gemiddelde concentraties te verkrijgen. Steroïden zoals androstenedione (A4) en oestrogeen (E2) kunnen gedurende 3 dagen worden samengevoegd en beoordeeld via radioimmunoassay (RIA; Figuur 6) en gepoold over 4 dagen per dier en getest via High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (HPLC-MS)24,25 ( Tabel1). Cytokine-arrays werden gebruikt om cytokine- en chemokineconcentraties in ovariumschorscultuurmedium26 te beoordelen(tabel 2). Real-time polymerasekettingreactie (RT-PCR) testplaten werden uitgevoerd om genexpressie te bepalen voor specifieke signaaltransductieroutes zoals eerder aangetoond16. Alle steroïde, cytokine, follikelstadium en histologische markers bieden een momentopname van de ovariële micro-omgeving en aanwijzingen over het vermogen van die micro-omgeving om "normale" of "abnormale" folliculogenese te bevorderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De eierstokken werden verkregen van U. S. Meat Animal Research Center16. Zoals eerder vermeld16, werden alle procedures goedgekeurd door het U.S. Meat Animal Research Center (USMARC) Animal Care and Use Committee in overeenstemming met de gids voor zorg en gebruik van landbouwdieren in landbouwkundig onderzoek en onderwijs. De eierstokken werden naar het Voortplantingslaboratorium van de Universiteit van Nebraska-Lincoln gebracht, waar ze werden verwerkt en gekweekt.

1. Voorbereiding van de benodigde media

  1. Waymouth MB 752/1 medium
    1. Vul een 1 L weefselkweekfles met 900 ml steriel water. Terwijl het water zachtjes op een roerplaat roert, voegt u geleidelijk het medium in poedervorm toe. Zodra het medium in poedervorm is opgelost, voegt u 2,24 g natriumbicarbonaat toe, gevolgd door 1,25 g runderserumalbumine (BSA). Gebruik een pH-meter en stel de pH in op 7,25-7,35. Voeg extra steriel water toe om het uiteindelijke volume op 1 L te brengen.
    2. Ga naar een biologische veiligheidskast en voeg penicilline-streptomycinesulfaat toe in een concentratie van 0,1% v / v van het medium. Filtreer het medium met een 0,22 μm porie 33,2 cm2 500 ml fles top filter.
    3. Giet het gefilterde medium af in verschillende conische buizen van 50 ml. Voeg 0,5 ml insuline-transferrine-selenium toe per 50 ml gealiquoteerd medium.
    4. Wikkel de conische buizen en voorraadfles van het medium in aluminiumfolie en bewaar bij 4 °C. Dit medium is lichtgevoelig.
      OPMERKING: Waymouth medium kan tot 1 maand worden bewaard.
  2. Leibovitz's L-15 (LB-15) medium
    OPMERKING: LB-15 medium wordt gebruikt om weefsel te reinigen ter voorbereiding op kweek.
    1. Vul een 1 L weefselkweekfles met 900 ml steriel water. Terwijl het steriele water zachtjes op een roerplaat roert, voegt u geleidelijk het bereide medium in poedervorm toe. Gebruik een pH-meter en stel de pH in op 7,25-7,35. Voeg extra steriel water toe om het uiteindelijke volume op 1 L te brengen.
    2. Ga naar biologische veiligheidskast. Maak 1 L LB-15 met 0,1% antibioticum (zie Tabel met materialen). Filtreer het medium in twee 500 ml weefselkweekflessen met behulp van een 0,22 μm porie 33,2 cm2 500 ml flesdekselfilter. Wikkel flessen in aluminiumfolie als LB-15 medium is lichtgevoelig en bewaar bij 4 °C.
      OPMERKING: LB-15 medium kan maximaal 1 maand worden bewaard.
  3. Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)
    1. Maak PBS in het laboratorium of koop steriele PBS zonder calcium of magnesium(Tabel met materialen). Om PBS in het laboratorium te maken, begint u met 800 ml gedestilleerd water en voegt u er 8 g natriumchloride (NaCl) aan toe. Voeg vervolgens 0,2 g kaliumchloride (KCl), 1,44 g natriumfosfaatdibasisch (Na2HPO4) en 0,24 g kaliumfosfaat dibasis (KH2PO4) toe. Stel de pH in op ~7,4 en stel het totale volume in op 1 L. Steriliseer de oplossing door autoclaveren.
    2. Maak 1 L PBS met 0,1% antibioticum (zie Tabel met materialen) in een biologische veiligheidskast.

2. Ovariële corticale cultuur protocol

OPMERKING: Eierstokken werden verkregen van in de lente geboren USMARC vaarzen op de leeftijd van 13 maanden. Eierstokken werden grondig gespoeld en al het bloed en andere vloeistof werden verwijderd met PBS met antibioticum (0,1%) en vervoerd bij 37 °C23 naar de University of Nebraska-Lincoln Reproduction Laboratory UNL (1,5 uur afstand). (Voor opmerkingen over de temperatuur van de eierstokken tijdens het transport, zie Discussie)

  1. Bereid het eierstokweefsel voor op een schone bank (figuur 1).
    1. Desinfecteer de schone bank met 70% ethanol. Plaats een fris absorberend kussen op het bankje. Zorg ervoor dat de schone bankblower een half uur voor de dissectie samen met UV-licht wordt ingeschakeld om alles in de schone bank te steriliseren, inclusief absorberend kussen en zorg ervoor dat de juiste PBM's worden gebruikt.
    2. Schik de petrischaaltjes (60 x 15 mm) voor weefselwassingen. Drie petrischalen zijn nodig voor PBS-was, drie voor PBS met antibioticum en drie voor LB-15-wasbeurten. Een extra LB-15-bevattende petrischaal met bijbehorend deksel zal worden gebruikt voor de definitieve plaatsing van stukken na het wassen.
    3. Vul elke petrischaal met ongeveer 10 ml geschikte vloeistoffen, PBS of LB-15.

figure-protocol-1
Figuur 1: Lay-out van platen voor het wassen van de eierstok en cortexstukken in de schone bank. (A) PBS gebruikt voor het wassen van de eierstokken als delen van de cortex worden verwijderd. (B) PBS met antibiotica wassingen waar cortex stukjes doorheen worden bewogen. (C)Ovariële cortexstukken worden vier keer gewassen in LB-15 voordat ze naar de bioveiligheidskast gaan voor de laatste wasbeurt in LB-15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Haal de bereide Waymouth en LB-15 medium uit de koelkast en verwarm tot kamertemperatuur.
  2. Autoclaaf alle gereedschappen om sterilisatie te garanderen voorafgaand aan gebruik.
  3. Houd de eierstokken op 37 °C totdat de ovariële cortex klaar is om te worden verzameld.
  4. Gebruik een tang met gekartelde kaken, pak de eierstok op en was grondig in de eerste pbs-gevulde petrischaal. Breng de eierstok over naar de tweede PBS-was en reinig nogmaals grondig.
    OPMERKING: De eierstok blijft in de tweede PBS-wassing terwijl de corticale strips van de eierstokken worden verwijderd.
  5. Gebruik gekartelde kaaktang, zet de eierstok vast en snijd in tweeën. Op dit moment zal de ovariële cortex wegsnijden van de medulla. Zorg er met behulp van een liniaal voor dat niet meer dan 1-2 mm diepte van het oppervlak van de eierstok wordt verwijderd van de medulla16. Verwijder dwarsdoorsneden van de ovariële cortex uit medulla, snijd 3-4 dunne stroken ovariële cortex(figuur 2)met een scalpel (# 11 scalpelmes; # 3 handvat) en plaats de strips in de derde PBS-gevulde petrischaal.
    OPMERKING: Op dit moment kan extra ovarium corticale weefsel worden verzameld voor RNA-extractie of worden gefixeerd en verzameld voor histologie van initiële niet-gekweekte cortexstukken. Vermijd bij het verwijderen van stroken van de ovariële cortex gebieden met zichtbare antrale follikels of corpora lutea. Vermijd bovendien het verzamelen van medullair weefsel. De histologie van de medulla is heel anders zoals eerder getoond16. Als de ovariële cortex niet tot meer dan een diepte van 1-2 mm wordt gesneden, mag de medulla niet worden verkregen. Verschillende histologie zorgt voor oriëntatiepunten tussen de cortex en het medulla.
  6. Snijd de ovariële cortex strips in de derde PBS-was in kleine, vierkante stukjes (~ 0,5-1 mm3) met een # 21 scalpelmes. Gebruik een liniaal onder de petrischalen om ervoor te zorgen dat de stukken van vergelijkbare grootte en dikte zijn om consistente stukken van de ovariële cortex te maken. Gebruik een tang om de strips vast te zetten terwijl je de stukken snijdt met een scalpel.
    OPMERKING: Het aantal gesneden weefselstukken is afhankelijk van het experiment. Vier stukjes ovariële cortex is de minimale hoeveelheid weefsel die nodig is voor kweek. Andere methoden om de juiste lengte en diepte te garanderen, zijn onder meer het gebruik van speciale snijmachines26 of voorgesneden plastic stukken als sjablonen27.
  7. Was ovariële corticale stukjes door alle drie PBS met met antibiotica gevulde petrischalen. Gebruik een gebogen tiptang om stukken tussen wasbeurten te verplaatsen.
  8. Beweeg cortexstukken door de reeks LB-15-wasbeurten en plaats ze in de laatste met LB-15 gevulde petrischaal. Label het deksel met dier-ID en eierstokzijde (links of rechts).
    OPMERKING: Dompel de stukken van de ovariële cortex volledig onder in elke wasbeurt voor grondige reiniging.
  9. Verzamel vier stukjes ovariële cortex per eierstok en fixeer voor dag nul histologie. Extra stukjes kunnen ook worden ingevroren voor RNA. De resterende weefselstukken zullen worden gebruikt voor kweek. Veeg ontleedgereedschappen af met 70% ethanol na elke weefselverzameling.
  10. Bereid een biologische veiligheidskast voor voor de laatste weefselwas en kweekvoorbereiding. Ontsmet benodigdheden met 70% ethanol voordat u ze in de biologische veiligheidskast plaatst. Gebruik de aseptische techniek bij het werken in de biologische veiligheidskast.
  11. Verplaats alle ovariële cortex bedoeld voor kweek naar de biologische veiligheidskast en was nogmaals in een met LB-15 gevulde petrischaal.
  12. Pipetteer in een 24-well tissuekweekplaat 350 μL Waymouth medium per put.
  13. Plaats ongecoate kweekputten in elke put met behulp van een tang. Zorg ervoor dat er geen bubbels worden gevormd onder de basis van de insert, omdat dit zou resulteren in het uitdrogen van het weefsel. Het medium moet de inserts aanraken om het medium te kunnen absorberen en de stukken van de eierstokschors te omringen.
  14. Plaats zorgvuldig vier stukken van de ovariële cortex op het gaas van elke insert(figuur 2). De tang kan het gaas doorboren als de weefselstukken niet subtiel worden geplaatst. De weefselstukken mogen elkaar of de zijkant van de insert niet raken.
  15. Incubeer het weefsel bij 37 °C met 5% CO216.
    OPMERKING: Anderen hebben 38,8 °C28gebruikt. Er is echter geen verschil waargenomen in de integriteit van het weefsel noch in het vermogen van follikels om vooruitgang te boeken in 37 °C-weefsel, noch hebben anderen39,30. Op dit punt zou elk van deze temperaturen dus bevorderlijk moeten zijn voor het succes van het experiment. Anderen hebben 400 μL medium gebruikt. Beide hoeveelheden zijn prima zolang men consistent is en het weefsel gedeeltelijk ondergedompeld is, waardoor voldoende oppervlaktespanning mogelijk is om hydratatie van weefsel mogelijk te maken (media rond stukjes ovariumschors). Vul lege putten met 500 μL steriel water om verdamping uit andere putten te verminderen.

figure-protocol-2
Figuur 2: Stukken ovariële cortex en kweekplaat. (A) Een ovariële strip die uit de cortex van de eierstok wordt gesneden. (B) Liniaal en cortex stuk naast elkaar weergegeven. (C) Vier cortexstukken (~ 0,5-1 mm3) rustend op de insert in het kweekmedium in de plaat. D)Het optillen van het inzetstuk om het kweekmedium uit de put te halen. Verzamel en vervang dagelijks alle kweekmedium (250 μL) om de juiste pH te behouden.Ongeveer 250 μL wordt elke dag uit elke put verkregen (ongeveer 70% van het initiële kweekmedium). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Media collectie

  1. Verander de ovariële cortex cultuur medium dagelijks gedurende 7 dagen. Medium veranderingen moeten zo dicht mogelijk bij 24 uur uit elkaar liggen om grote pH- en kleurveranderingen in medium te voorkomen. Warm Waymouth medium tot 37 °C voordat het medium wordt vervangen. Ongeveer 250 μL wordt elke dag uit elke put verkregen (ongeveer 70% van het initiële kweekmedium).
  2. Gebruik tijdens mediumwissels een tang om het inzetstuk voorzichtig uit de put te tillen. Verzamel het gekweekte Waymouth medium in buizen van 0,5 ml (ongeveer 250 μL /dag). Plaats de insert goed terug en voeg 350 μL vers kweekmedium toe door het medium tussen de zijkant van het inzetstuk en goed af te geven.
    OPMERKING: Verander de meeste media dagelijks om voldoende media te verkrijgen om alle steroïden, cytokines en chemokines te meten die nodig zijn om de ovariële micro-omgeving te bepalen. Ook zijn dagelijkse mediumveranderingen belangrijk om grote pH-veranderingen (aangegeven door kleurverandering) in het medium te voorkomen. Druppels medium werden rond de stukken van de ovariële cortex bewaard om ervoor te zorgen dat de stukken nat bleven. Er werden geen problemen waargenomen met gekweekt weefsel als gevolg van het veranderen van 70% van de media.
  3. Bewaar het verzamelde medium uit weefselkweek bij -20 °C.

4. Beeldvorming en downstream verwerking

  1. Na 7 dagen kweek bij 37 °C met 5% CO2, beeld de ovariële cortexstukken in met behulp van een dissectiemicroscoop met een aangesloten camera en een computerbeeldbewerkingssoftwareprogramma.
    OPMERKING: Een donkere kamer is meestal het beste voor het bereiken van de beste beeldkwaliteit voor beeldvorming.
  2. Na beeldvorming, fixeer twee ovariële cortex stukken per put in Bouins voor histologie en flash bevries twee ovariële cortex stukken in vloeibare stikstof om RNA voor cDNA te verkrijgen. Herhaal deze stap voor alle putjes met weefsel. Verzamel het medium vanaf dag 7 en bewaar bij -20 °C.
  3. Laat de stukjes ovariumschors gedurende ongeveer 1,5 uur ondergedompeld blijven in Bouins (picrinezuur 750 ml, ijsazijn 50 ml en 37% -40% formaline 250 ml) voordat ze drie keer worden gewassen met 70% ethanol. Het weefsel blijft in 70% ethanol en wordt dagelijks opgeruimd totdat de oplossing niet langer geel is.
    OPMERKING: Andere fixatieven dan Bouins en paraformaldehyde kunnen worden gebruikt. In deze ervaring wordt Bouins gebruikt omdat het het fixatief is om optimale morfologie te bereiken. Als er meer weefsel nodig is voor andere analyse, kunnen extra bronnen van media en stukjes ovariële cortex van elk dier worden verkregen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Deze boviene cortex kweekprocedure kan worden gebruikt om een breed scala aan hormoon-, cytokine- en histologische gegevens uit kleine stukjes van de eierstok te bepalen. Kleuring, zoals hematoxyline en eosine (H & E), kan worden gebruikt om de ovariële morfologie te bepalen door middel van follikelstadiëring16,23,31 (figuur 3). Kortom, follikels werden geclassificeerd als primordiaal, wat een eicel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het voordeel van in vitro ovariële cortexcultuur, zoals beschreven in dit manuscript, is dat de follikels zich ontwikkelen in een genormaliseerde omgeving met aangrenzend stroma rond de follikels. De somatische cellen en eicellen blijven intact en er is geschikte cel-tot-cel communicatie als een in vivo model. Ons laboratorium heeft ontdekt dat een 7-daags kweeksysteem representatieve folliculogenese- en steroidogenesegegevens biedt voor de behandeling van de ovariële cortex. Andere ovariële weefselkweekprotocollen hebbe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd ondersteund door het National Institute of Food and Agriculture 2013-67015-20965 aan ASC, University of Nebraska Food for Health Competitive Grants aan ASC. United States Department of Agriculture Hatch grant NEB26-202/W3112 Accession #1011127 to ASC, Hatch–NEB ANHL Accession #1002234 to ASC. Quantitative Life Sciences Initiative Summer Postdoctoral Scholar Support - COVID-19 Award voor zomerfinanciering voor CMS.

De auteurs willen graag hun waardering uitspreken voor Dr. Robert Cushman, U.S. Meat Animal Research Center, Clay Center, NE om hem te bedanken voor het verstrekken van de eierstokken in een eerdere publicatie, die vervolgens in het huidige artikel werden gebruikt als een proof of concept bij het valideren van deze techniek.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
#11 Scapel BladeSwann-Morton 303Scaple Blade
#21 Scapel BladeSwann-Morton 307Scaple Blade
500mL Bottle Top FilterCorning430514Bottle Top Filter 0.22 µm pore voor het filteren van medium
AbsoluteIDQ Sterol17 AssayBiocratesSterol17 KitSteekproeven worden naar Biocrates gestuurd en steroïdepanels worden uitgevoerd en resultaten worden teruggestuurd 
Androstenedione Double Antibody RIA KitMPBio7109202RIA om androstenedione uit cultuurmedium te bepalen
Belgium A4 Assay Kit DIA Source KIP0451RIA om androstenedione uit cultuurmedium te bepalen
Bovine Cytokine Array Q3RayBiotechQAB-CYT-3-1Cytokine kit om cytokinen uit cultuurmedium te bepalen
cellSens Software Standard 1.3Olympus7790Beeldvormingssoftware
Insulin-Transferrin-Selenium-XGibco ThermoFisher Scientific5150056Additief voor het cultuurmedium
Leibovitz's L-15 MediumGibco ThermoFisher Scientific4130039Gebruikt voor weefselwassing op schone bank en in de bioveiligheidskast 
Microscope OlympusSZX16Dissectiemicroscoop gebruikt voor beeldvorming van weefselcultuurstukken 
Microscope Camera OlympusDP71Microscoopcamera gebruikt voor beeldvorming van weefselcultuurstukken 
Millicell Cell Culture Inserts 0.4µm, 12,mm DiameterMillipore SigmaPICM01250Inserts die het weefsel tegen het medium laten rusten zonder erin te worden ondergedompeld
Multiwell 24 well plateFalcon353047Plaat gebruikt om medium, inserts en weefsels vast te houden
Petri dish 60 x 15 mmFalcon351007Petrischaal gebruikt voor wasstappen vóór cultuur
Phosphate-Buffered Saline (PBS 1X)Corning21-040-CVGebruikt voor weefselwassing
SAS Version 9.3SAS Institute 9.3 TS1M2Statistische analysesoftware 
Thomas Stadie-Riggs Tissue SlicerThomas Scientific6727C10Weefselsnijder voor bereiding van dunne uniforme secties van vers weefsel
Waymouth MB 752/1 MediumSigma-AldrichW1625Medium gebruikt voor weefselculturen

Referenties

  1. Braw-Tal, R., Yossefi, S. Studies in vivo and in vitro on the initiation of follicle growth in the bovine ovary. Journal of Reproduction and Fertility. 109, 165-171 (1997).
  2. Nilsson anEdson, M. A., Nagaraja, A. K., Matzuk, M. M. The mammalian ovary from genesis to revelation. Endocrine Reviews. 30 (6), 624-712 (2009).
  3. Fortune, J. E., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Kito, S. The primordial to primary follicle transition. Molecular and Cellular Endocrinology. 163, 53-60 (2000).
  4. Ireland, J. J. Control of follicular growth and development. Journal of Reproduction and Fertility. 34, 39-54 (1987).
  5. Higuchi, C. M., Maeda, Y., Horiuchi, T., Yamazaki, Y. A simplified method for three-dimensional (3-D) ovarian tissue culture yielding oocytes competent to produce full-term offspring in mice. PLoS One. 10 (11), e0143114(2015).
  6. Ramezani, M., Salehnia, M., Jafarabadi, M. Short term culture of vitrified human ovarian cortical tissue to assess the cryopreservation outcome: molecular and morphological analysis. Journal of Reproduction & Infertility. 18 (1), 162-171 (2017).
  7. McLaughlin, M., Telfer, E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
  8. Stefansdottir, A., Fowler, P. A., Powles-Glover, N., Anderson, R. A., Spears, N. Use of ovary culture techniques in reproductive toxicology. Reproductive Toxicology. 49, 117-135 (2014).
  9. Bromfield, J. J., Sheldon, I. M. Lipopolysaccharide reduces the primordial follicle pool in the bovine ovarian cortex ex vivo and in the murine ovary in vivo. Biology of Reproduction. 88 (4), 1-9 (2013).
  10. Franks, S., Stark, J., Hardy, K. Follicle dynamics and anovulation in polycystic ovary syndrome. Humane Reproduction Update. 14 (4), 367-378 (2008).
  11. Desmeules, P., Devine, P. J. Characterizing the ovotoxicity of cyclophosphamide metabolites on cultured mouse ovaries. Toxicological Sciences. 90 (2), 500-509 (2006).
  12. Bott, R. C., McFee, R. M., Clopton, D. T., Toombs, C., Cupp, A. S. Vascular endothelial growth factor and kinase domain region receptor are involved in both seminiferous cord formation and vascular development during testis morphogenesis in the rat. Biology of Reproduction. 75, 56-67 (2006).
  13. Baltes-Breitwisch, M. M., et al. Neutralization of vascular endothelial growth factor antiangiogenic isoforms or administration of proangiogenic isoforms stimulates vascular development in the rat testis. Reproduction. 140 (2), 319-329 (2010).
  14. McFee, R. M., et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signal transduction blocks follicle progression but does not necessarily disrupt vascular development in perinatal rat ovaries. Biology of Reproduction. 81, 966-977 (2009).
  15. Artac, R. A., et al. Neutralization of vascular endothelial growth factor antiangiogenic isoforms is more effective than treatment with proangiogenic isoforms in stimulating vascular development and follicle progression in the perinatal rat ovary. Biology of Reproduction. 81, 978-988 (2009).
  16. Abedal-Majed, M. A., et al. Vascular endothelial growth factor A isoforms modulate follicle development in peripbertal heifers independent of diet through diverse signal transduction pathways. Biology of Reproduction. 102 (3), 680-692 (2020).
  17. Wandji, S. A., Srsen, V., Voss, A. K., Eppig, J. J., Fortune, J. E. Initiation in vitro of bovine primordial follicles. Biology of Reproduction. 55, 942-948 (1996).
  18. Wandji, S. A., Srsen, V., Nathanielsz, P. W., Eppig, J. J., Fortune, J. E. Initiation of growth of baboon primordial follicles in vitro. Human Reproduction. 12 (9), 1993-2001 (1993).
  19. Yang, M. Y., Fortune, J. E. Testosterone stimulates the primary to secondary follicle transition in bovine follicles in vitro. Biology of Reproduction. 75, 924-932 (2006).
  20. Fortune, J. E., Kito, S., Wandji, S. A., Srsen, V. Activation of bovine and baboon primordial follicles in vitro. Theriogenology. 49, 441-449 (1998).
  21. Yang, M. Y., Fortune, J. E. Vascular endothelial growth factor stimulates the primary to secondary follicle transition in bovine follicles in vitro. Molecular Reproduction and Development. 74, 1095-1104 (2007).
  22. Barberino, R. S., Silva, J. R. V., Figueiredo, J. R., Matos, M. H. T. Transport of domestic and wild animal ovaries: a review of the effects of medium, temperature, and periods of storage on follicular viability. Biopreservation and Biobanking. 17 (1), 84-90 (2019).
  23. Summers, A. F., et al. Altered theca and cumulus oocyte complex gene expression, follicular arrest and reduced fertility in cows with dominant follicle follicular fluid androgen excess. PLoS One. 9 (10), e110683(2014).
  24. Koal, T., Schmiederer, D., Pham-Tuan, H., Rohring, C., Rauh, M. Standardized LC-MS/MS based steroid hormone profile analysis. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 129, 129-138 (2012).
  25. Poole, R. K., Brown, A. R., Pore, M. H., Pickworth, C. L., Poole, D. H. Effects of endophyte-infected tall fescue seed and protein supplementation on stocker steers: II. Adaptive and innate immune function. Journal of Animal Science. 97 (10), 4160-4170 (2019).
  26. Laronda, M., et al. Alginate encapsulation supports the growth and differentiation of human primordial follicles within ovarian cortical tissue. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (8), 1013-1028 (2014).
  27. Silber, S. J., et al. A series of monozygotic twins discordant for ovarian failure: ovary transplantation (cortical versus microvascular) and cryopreservation. Human Reproduction. 23 (7), 1531-1537 (2008).
  28. Wiedemann, C., Zahmel, J., Jewgenow, K. Short-term culture of ovarian cortex pieces to assess the cryopreservation outcome in wild fields for genome conservation. BMC Veterinary Research. 9 (37), (2013).
  29. Baufeld, A., Vanselow, J. Increasing cell plating density mimics an early post-LH stage in cultured bovine granulosa cells. Cell and Tissue Research. 354 (3), 869-880 (2013).
  30. Shimizu, T., Miyamoto, A. Progesterone induces the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) 120 and Flk-1, its receptor, in bovine granulosa cells. Animal Reproduction Science. 102 (3-4), 228-237 (2007).
  31. Tepekoy, F., Akkoyunlu, G. The effect of FSH and activin A on Akt and MAPK1/3 phosphorylation in cultured bovine ovarian cortical strips. Journal of Ovarian Research. 9 (13), 1-9 (2016).
  32. Beck, K., Singh, J., Arshud Dar, M., Anzar, M. Short-term culture of adult bovine ovarian tissues: chorioallantoic membrane (CAM) vs. traditional in vitro culture systems. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 21(2018).
  33. Eppig, J. J. Oocyte control of ovarian follicular development and function in mammals. Reproduction. 122 (6), 829-838 (2001).
  34. Paczkowski, M., Silva, E., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Comparative importance of fatty acid beta-oxidation to nuclear maturation, gene expression, and glucose metabolism in mouse, bovine, and porcine cumulus oocyte complexes. Biology of Reproduction. 88 (5), 1-11 (2013).
  35. Raffel, N., et al. Is ovarian tissue transport at supra-zero temperatures compared to body temperature optimal for follicle survival? In Vivo. 34 (2), 533-541 (2020).
  36. Duncan, F., et al. Ovarian tissue transport to expand access to fertility preservation: from animals to clinical practice. Reproduction (Cambridge, England). 152 (6), R201-R210 (2016).
  37. Liebenthron, J., et al. Overnight ovarian tissue transportation for centralized cryobanking: a feasible option. Reproductive BioMedicine Online. 38 (5), 740-749 (2019).
  38. Mohammed, B. T., Donadeu, F. X. Bovine granulosa cell culture. Epithelial Cell Culture: Methods and Protocols. , 79-87 (2018).
  39. Langbeen, A., et al. Effects of neutral red assisted viability assessment on the cryotolerance of isolated bovine preantral follicles. Journal of Assisted Reproduction Genetics. 31, 1727-1736 (2014).
  40. Higuchi, C. M., Maeda, Y., Horiuchi, T., Yamazaki, Y. A simplified method for three-dimensional (3-D) ovarian tissue culture yielding oocytes competent to produce full-term offspring in mice. PLoS One. 10 (11), e0143114(2015).
  41. Yang, M. Y., Fortune, J. E. Changes in the transcriptome of bovine ovarian cortex during follicle activation in vitro. Physiological Genomics. 47, 600-611 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Cultuur van de eierstokkencortexfolliculaire ontwikkelinganalyse van stero dhormonenmeting van cytokineproductieweefselkweekinzetWaymouth mediumhistologische doorsnedenradioimmunoassayfolliculair stadiumbepalingovari le micro omgeving
Bovine Ovarian Cortex Weefselkweek
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.