Het hier gepresenteerde protocol is bedoeld om het optreden van heterologe interacties tussen Golgi-residente type III membraaneiwitten met cytoplasmatisch blootgestelde N- en/of C-termini in levende zoogdiercellen aan te tonen met behulp van de meest recente variant van de split luciferase complementatie assay.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Demonstratie van heterologe complexen gevormd door Golgi-Resident Type III membraaneiwitten met behulp van Split Luciferase Complementation Assay
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het doel van dit protocol is om de toepasbaarheid te onderzoeken van de meest recente variant van split luciferase complementatie voor het aantonen van heterologe complexen gevormd door nucleotide suikertransporters (NST's). Deze ER- en Golgi-residente multitransmembraaneiwitten dragen de cytoplasmatisch gesynthetiseerde nucleotidesuikers over organelmembranen om enzymen te leveren die glycosylering bemiddelen met hun substraten. NST's bestaan als dimeren en/of hogere oligomeren. Heterologe interacties tussen verschillende NST's zijn ook gemeld. Om te verifiëren of de techniek geschikt is voor het bestuderen van het fenomeen van NST-heteromerisatie, hebben we het getest tegen een combinatie van de twee Golgi-residente NST's waarvan eerder is aangetoond dat ze op verschillende andere manieren associëren. De luciferase-complementatietest lijkt bijzonder geschikt te zijn voor het bestuderen van interacties tussen Golgi-residente membraaneiwitten, omdat het geen hoge expressieniveaus vereist, die vaak eiwitmislokalisatie veroorzaken en het risico op valse positieven verhogen.
Inleiding
Dit manuscript beschrijft een stap-voor-stap protocol om te controleren op de aanwezigheid van heterologe interacties tussen Golgi-residente type III membraaneiwitten in tijdelijk getransfecteerde menselijke cellen met behulp van de meest recente variant van de split luciferase complementatie assay. De procedure is het meest uitgebreid getest tegen nucleotide suikertransporters (NST's), maar we konden ook positieve resultaten behalen voor andere Golgi-residente type III-membraaneiwitten waarvan de N- en / of C-termini tegenover het cytoplasma staan.
Onze onderzoeksgroep onderzoekt de rol van NST's bij glycosylering van macromoleculen. NST's zijn Golgi- en/of ER-residente type III membraaneiwitten met N- en C-termini naar de cytoplasmatische kant van het organellaire membraan1. Van NST's wordt gedacht dat ze nucleotide-geactiveerde suikers over organelmembranen dragen om glycosyltransferasen van hun substraten te voorzien. NST's vormen dimeren en/of hogere oligomeren2,3,4,5,6,7,8,9,10. Bovendien zijn er ook heterologe interacties tussen verschillende NST's gemeld6,11. NST's bleken ook complexen te vormen met functioneel gerelateerde glycosylatie-enzymen12,13,14. We zochten naar een alternatief voor de momenteel gebruikte techniek, fluorescence lifetime imaging (FLIM)-gebaseerde FRET-benadering, voor het bestuderen van interacties van NST's en functioneel gerelateerde Golgi-residente eiwitten, dus besloten we om de split luciferase complementatie assay te testen. Het stelde ons in staat om een nieuwe interactie te identificeren tussen een NST en een functioneel gerelateerd glycosylatie-enzym9.
De meest recente wijziging van de split luciferase complementatie assay, NanoBiT, wordt gebruikt in het protocol dat hier wordt gepresenteerd15. Het is afhankelijk van de reconstitutie van het luciferase-enzym (bijv. NanoLuc) uit de twee fragmenten - de grote, aangeduid als grote BiT of LgBiT, een 17,6 kDa-eiwit, en de kleine, samengesteld uit slechts 11 aminozuren, aangeduid als kleine BiT of SmBiT. De twee eiwitten van belang zijn versmolten met de complementaire fragmenten en tijdelijk tot expressie gebracht in een menselijke cellijn. Als de twee fusie-eiwitten op elkaar inwerken, wordt in situ een luminescentie geproduceerd na toevoeging van een celdoorlatend substraat. Deze twee fragmenten zijn geoptimaliseerd zodat ze zich associëren met minimale affiniteit, tenzij ze worden samengebracht door een interactie tussen de eiwitten van belang waarmee ze zijn gefuseerd.
Over het algemeen hebben op bioluminescentie gebaseerde methoden enkele voordelen ten opzichte van methoden die gebaseerd zijn op fluorescentie. Bioluminescente signalen hebben een hogere signaal-ruisverhouding omdat de achtergrondlumescentie verwaarloosbaar is in vergelijking met het luciferase-afgeleide signaal16. Fluorescentie-gebaseerde benaderingen daarentegen lijden meestal aan een relatief hoge achtergrond veroorzaakt door het fenomeen van autofluorescentie. Bovendien is bioluminescentie minder schadelijk voor de geanalyseerde cellen dan fluorescentie, omdat het in het eerste geval niet nodig is om het monster te prikkelen. Om die redenen concurreren bioluminescente benaderingen voor het bestuderen van PPI's in vivo met de veelgebruikte fluorescerende methoden zoals Förster Resonance Energy Transfer (FRET) of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC).
Ons protocol is gebaseerd op verwijzende luminescentie verkregen voor de eiwitcombinatie die van belang is voor luminescentie verkregen voor de controlecombinatie. De laatste omvat een van de geteste eiwitten die is gefuseerd met een groter fragment en een controle-eiwit (bijv. HaloTag), gefuseerd met een kleiner fragment. De laatste is een eiwit van bacteriële oorsprong waarvan niet wordt verwacht dat het interageert met een van de eiwitten van zoogdieren. Het gebruik van dit eiwit als controle stelt beperkingen aan de topologie van de Golgi-residente paren van eiwitten die moeten worden geanalyseerd. Omdat in zoogdiercellen dit eiwit wordt gesynthetiseerd in het cytoplasma, moeten beide eiwitten van belang ten minste één cytoplasmatische staart hebben.
Deze aanpak kan met name nuttig zijn voor de eerste screening van PPI's. Het kan de voorkeursmethode worden wanneer de fusie-eiwitten van belang worden uitgedrukt op niveaus die eenvoudigweg onvoldoende zijn om andere benaderingen toe te passen. Evenzo kan de split luciferase-complementatietest de beste optie zijn als de eiwitten van belang op hoge niveaus tot expressie komen, maar dit heeft een negatieve invloed op hun subcellulaire lokalisatie of het is bekend dat het niet-specifieke interacties forceert. Omdat het kleinere fragment slechts 11 aminozuren bevat, kan de split luciferase complementatietest worden toegepast wanneer het gebruik van grotere tags onmogelijk is. Ten slotte kan het worden gebruikt om gegevens die zijn verkregen met behulp van andere technieken verder te bevestigen, zoals in het hier gepresenteerde geval.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Generatie van expressieplasmiden
- Onderzoek de membraantopologie van de eiwitten van belang met behulp van een topologie voorspellende tool.
- Ontwerp de kloonstrategie zo dat de grotere en kleinere fragmenten het cytoplasma onder ogen zien zodra de fusie-eiwitten in Golgi-membranen zijn ingebracht. Als, zoals in het hier gepresenteerde geval, zowel N- als C-termini van de betrokken eiwitten cytoplasmatisch georiënteerd zijn, tag de eiwitten dan op acht mogelijke manieren (zie figuur 1B). Als N- of C-terminus van een of beide eiwitten van belang luminaal georiënteerd is, sluit het dan uit van tagging.
- Subclone de genen van belang in geschikte expressievectoren (zie Tabel van materialen) door het volgen van standaard kloonprotocollen.
OPMERKING: Het testen van alle mogelijke oriëntaties wordt aanbevolen, omdat sommige taggingopties mogelijk niet werken vanwege onvoldoende nabijheid, suboptimale oriëntatie of ruimtelijke beperkingen.
2. Voorbijgaande transfectie van de expressieplasmiden in de cellen
- Oogst de aanhangende HEK293T-celcultuur door trypsinisatie en resuspend de cellen in een speciaal volledig groeimedium. Plaats de cellen (2 x 104/100 μL/put) op een heldere bodem, witte kant 96-well plaat. Pas het totale aantal putten aan om plaats te bieden aan alle geteste combinaties en controles, inclusief replicaties.
OPMERKING: Probeer alleen de binnenste 60 putten van de plaat te gebruiken om thermische verschuivingen te minimaliseren en nachtelijke verdamping te voorkomen. Het gebruik van met poly-D-lysine gecoate platen wordt ten zeerste aanbevolen, zoals aangegeven in de tabel met materialen, anders kunnen cellen losraken tijdens de volgende wasstappen. - Kweek de cellen 's nachts in standaardomstandigheden (37 °C, 5% CO2).
- Transfecteer de cellen de volgende dag met de gewenste combinaties van expressieplasmiden die zijn verkregen in punt 1.1.
- Verdun expressieplasmiden in een serumvrij medium (zie materiaaltabel) tot 6,25 ng/μL voor elk construct.
- Voeg het op lipiden gebaseerde transfectiereagens toe met een geschikte lipide-DNA-verhouding en incubeer volgens de instructies van de fabrikant.
- Voeg 8 μL lipide:DNA-mengsel toe aan aangewezen putjes. Meng de inhoud van de plaat door voorzichtig te draaien. Dit resulteert in transfectie van beide expressieconstructen bij 50 ng/put.
- Kweek de cellen gedurende 20-24 uur in standaardomstandigheden (37 °C, 5% CO2).
OPMERKING: Het kweken van de cellen voor een langere tijd kan resulteren in hogere niveaus van fusie-eiwitexpressie, wat een niet-specifieke associatie tussen de fragmenten kan bevorderen.
3. Middelgrote uitwisseling
- Vervang de volgende dag het geconditioneerde medium door 100 μL van een serumvrij medium in elke put. Zorg ervoor dat de cellen niet zijn losgekomen bij medium uitwisseling.
OPMERKING: Deze stap moet 2-3 uur vóór de toevoeging van de furimazine-werkoplossing worden uitgevoerd. Serumontwenning minimaliseert achtergrond veroorzaakt door autoluminescentie van furimazine.
4. Bereiding van furimazine werkoplossing
- Meng vlak voor de meting 1 volume furimazine met 19 volumes van een verdunningsbuffer (een 20-voudige verdunning).
OPMERKING: Het totale volume van de te bereiden furimazine-werkoplossing hangt af van het aantal individuele putjes dat moet worden geanalyseerd (de furimazine-werkoplossing wordt in een verhouding van 1:5 aan het celkweekmedium toegevoegd, daarom moet aan elke put die eerder is gevuld met 100 μL van een serumvrij medium 25 μL van de furimazine-werkoplossing worden toegevoegd). - Voeg de furimazine-werkoplossing toe aan aangewezen putten (25 μL/putje). Meng de plaat voorzichtig met de hand of met behulp van een orbitale shaker (bijvoorbeeld 15 s bij 300-500 tpm).
5. Luminescentie meten
- Plaats de plaat in een luminescentie microplaatlezer.
- Voor experimenten die moeten worden uitgevoerd bij 37 °C, houdt u de plaat gedurende 10-15 minuten in evenwicht bij de aangegeven temperatuur.
- Selecteer de putten die moeten worden geanalyseerd.
- Lees luminescentie met integratietijd van 0,3 s. Blijf luminescentie tot 2 uur controleren wanneer dat nodig is.
6. Data-analyse
- Bereken gemiddelde waarden en standaardafwijkingen voor alle geteste en controlecombinaties.
- Analyseer gegevens met behulp van eenrichtings-ANOVA met meerdere vergelijkingen.
- Bereken de waarden van de vouwverandering door een gemiddelde luminescentie die voor interessante combinaties wordt verkregen, te delen door een gemiddelde luminescentie die voor de overeenkomstige negatieve regelaars wordt verkregen. Evalueer de resultaten.
OPMERKING: De hier voorgestelde benadering van gegevensanalyse gaat ervan uit dat de interactie kan worden geclaimd als de luminescentie die voor de geteste combinatie wordt verkregen statistisch significant hoger is dan de luminescentie die wordt verkregen voor de overeenkomstige controlecombinatie en tegelijkertijd de verhouding van deze twee waarden groter is dan 10.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om de meest betrouwbare gegevens in deze benadering te verkrijgen, moeten alle mogelijke combinaties worden getest (zie figuur 1). Tegelijkertijd moeten positieve en negatieve controles worden opgenomen. De positieve controle moet bestaan uit de twee eiwitten waarvan bekend is dat ze interageren, waarvan de ene is gefuseerd met het grotere fragment en de andere is gefuseerd met het kleinere fragment. De negatieve controle zou idealiter moeten bestaan uit de twee niet-interagerende type III-m...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier bieden we een gedetailleerd protocol dat de demonstratie mogelijk maakt van heterologe complexen gevormd tussen Golgi-residente type III-membraaneiwitten, zoals NST's, met behulp van de split luciferase-complementatietest. De voorgestelde benadering van gegevensanalyse en -interpretatie omvat het relateren van de luminescentie verkregen voor de eiwitcombinatie van belang aan de luminescentie verkregen voor de overeenkomstige controlecombinatie, die is samengesteld uit een van de eiwitten van belang gefuseerd met het...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door subsidie nr. 2016/23/D/NZ3/01314 van het National Science Centre (NCN), Krakau, Polen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.25% trypsin-EDTA-oplossing | |||
| Adherente zoogdiercellijn | |||
| BioCoat Poly-D-Lysine 96-well Wit/Heldere Vlakke Bodem TC-behandelde Microplaat, met Deksel | Corning | 356651 | |
| Celcultuurcentrifuge | |||
| Celcultuursupplementen (hitte-geïnactiveerd foetaal bovien serum, L-glutamine, penicilline, streptomycine) | |||
| CO2 incubator | |||
| Expressieplasmiden die coderen voor eiwit(ten) van belang niet gemerkt met NanoBiT fragmenten | |||
| FuGENE HD Transfectie Reagens | Promega | E2311 | |
| GloMax Discover Microplaatlezer (of een andere luminescentie microplaatlezer) | Promega | GM3000 | |
| Groeimedium gewijd aan de gebruikte cellijn | |||
| Materialen en reagentia voor standaard moleculaire klonen (bacteriën, thermostabiele polymerase, restrictie-enzymen, DNA ligase, materialen en reagentia voor nucleïnezuurzuivering) | |||
| NanoBiT MCS Starter Systeem | Promega | N2014 | Deze kit bevat vectoren die het markeren van de eiwitten van belang met NanoBiT fragmenten in verschillende oriëntaties mogelijk maken, evenals de controleplasmide die HaloTag-eiwit codeert gefuseerd met SmBiT en een positieve controleplasmidepaar. |
| Nano-Glo Levende Cel Assay Systeem | Promega | N2011 | Deze kit bevat furimazine, dat een substraat is dat de detectie van de NanoLuc-activiteit in levende cellen mogelijk maakt, en een speciale verdunningsbuffer. |
| Opti-MEM I Gereduceerd Serum Medium, geen fenol rood | Gibco | 11058021 | |
| Oribitale shaker | |||
| Software voor data-analyse (bijv. GraphPad Prism) | |||
| Thermocycler |
Referenties
- Hadley, B., et al. Structure and function of nucleotide sugar transporters: Current progress. Computational and Structural Biotechnology Journal. 10 (16), 23-32 (2014).
- Puglielli, L., Hirschberg, C. B. Reconstitution, identification, and purification of the rat liver Golgi membrane GDP-fucose transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35596-35600 (1999).
- Puglielli, L., Mandon, E. C., Rancour, D. M., Menon, A. K., Hirschberg, C. B. Identification and purification of the rat liver Golgi membrane UDP-N-acetylgalactosamine transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (7), 4474-4479 (1999).
- Gao, X., Dean, N. Distinct protein domains of the yeast Golgi GDP-mannose transporter mediate oligomer assembly and export from the endoplasmic reticulum. Journal of Biological Chemistry. 275 (23), 17718-17727 (2000).
- Olczak, M., Guillen, E. Characterization of a mutation and an alternative splicing of UDP-galactose transporter in MDCK-RCAr cell line. Biochimica et Biophysica Acta. 1763 (1), 82-92 (2006).
- Maszczak-Seneczko, D., Sosicka, P., Majkowski, M., Olczak, T., Olczak, M. UDP-N-acetylglucosamine transporter and UDP-galactose transporter form heterologous complexes in the Golgi membrane. FEBS Letters. 586 (23), 4082-4087 (2012).
- Nji, E., Gulati, A., Qureshi, A. A., Coincon, M., Drew, D. Structural basis for the delivery of activated sialic acid into Golgi for sialyation. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (6), 415-423 (2019).
- Parker, J. L., Corey, R. A., Stansfeld, P. J., Newstead, S. Structural basis for substrate specificity and regulation of nucleotide sugar transporters in the lipid bilayer. Nature Communications. 10 (1), 4657(2019).
- Wiertelak, W., Sosicka, P., Olczak, M., Maszczak-Seneczko, D. Analysis of homologous and heterologous interactions between UDP-galactose transporter and beta-1,4-galactosyltransferase 1 using NanoBiT. Analytical Biochemistry. 593, 113599(2020).
- Hong, K., Ma, D., Beverley, S. M., Turco, S. J. The Leishmania GDP-mannose transporter is an autonomous, multi-specific, hexameric complex of LPG2 subunits. Biochemistry. 39 (8), 2013-2022 (2000).
- Sosicka, P., et al. An insight into the orphan nucleotide sugar transporter SLC35A4. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1864 (5), 825-838 (2017).
- Sprong, H., et al. Association of the Golgi UDP-galactose transporter with UDP-galactose:ceramide galactosyltransferase allows UDP-galactose import in the endoplasmic reticulum. Molecular Biology of the Cell. 14 (8), 3482-3493 (2003).
- Maszczak-Seneczko, D., et al. UDP-galactose (SLC35A2) and UDP-N-acetylglucosamine (SLC35A3) Transporters Form Glycosylation-related Complexes with Mannoside Acetylglucosaminyltransferases (Mgats). Journal of Biological Chemistry. 290 (25), 15475-15486 (2015).
- Khoder-Agha, F., et al. N-acetylglucosaminyltransferases and nucleotide sugar transporters form multi-enzyme-multi-transporter assemblies in golgi membranes in vivo. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (9), 1821-1832 (2019).
- Dixon, A. S., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. -A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. Bioluminescence imaging in live cells and animals. Neurophotonics. 3 (2), 025001(2016).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Molecular Cell. 9 (4), 789-798 (2002).
- Inoue, A., et al. Illuminating G-Protein-Coupling Selectivity of GPCRs. Cell. 177 (7), 1933-1947 (2019).
- White, C. W., Caspar, B., Vanyai, H. K., Pfleger, K. D. G., Hill, S. J. CRISPR-Mediated Protein Tagging with Nanoluciferase to Investigate Native Chemokine Receptor Function and Conformational Changes. Cell Chemical Biology. 27, 499-510 (2020).
- Akinjiyan, F. A., et al. A Novel Luminescence-Based High-Throuput Approach for Cellular Resolution of Protein Ubiquitination using Tandem Ubiquitin Binding Entities (TUBEs). SLAS Discovery. 25 (4), 350-360 (2020).
- Soave, M., Kellam, B., Woolard, J., Briddson, S. J., Hill, S. J. NanoBiT Complemetation to Monitor Agonist-Induced Adenosine A1 Receptor Internalization. SLAS Discovery. 25 (2), 186-194 (2020).
- Crowley, E., Leung, E., Reynisson, J., Richardson, A. Rapid changes in the ATG5-ATG16L1 complex following nutrient deprivation measured using NanoLuc Binary Technlology (NanoBiT). FEBS Journal. , 15275(2020).
- Shetty, S. K., Walzem, R. L., Davies, B. S. J. A novel NanoBiT-based assay monitors the interaction between lipoprotein lipase and GPIHBP1 in real time. Journal of Lipid Research. 61 (4), 546-559 (2020).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
