Methodenartikel

Live imaging van chemokinereceptoren bij zebravisneutrofielen tijdens wondreacties

3.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61679

⸱

4 december 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we protocollen voor het uitvoeren van live beeldvorming en kwantitatieve analyse van chemoattractante receptordynamiek bij zebravisneufielen

Samenvatting

Leukocytengeleiding door chemische gradiënten is essentieel voor immuunresponsen. Neutrofielen zijn de eerste cellen die worden gerekruteerd op plaatsen van weefselbeschadiging waar ze cruciale antimicrobiële functies uitvoeren. Hun handel naar deze loci wordt georkestreerd door verschillende inflammatoire chemoattractanten, waaronder chemokines. Op moleculair niveau wordt chemoattractant signalering gereguleerd door de intracellulaire handel van de overeenkomstige receptoren. Het blijft echter onduidelijk hoe subcellulaire veranderingen in chemokinereceptoren de migratiedynamiek van leukocyten op cel- en weefselniveau beïnvloeden. Hier beschrijven we een methodologie voor live beeldvorming en kwantitatieve analyse van chemokinereceptordynamica bij neutrofielen tijdens ontstekingsreacties op weefselschade. Deze hulpmiddelen hebben aangetoond dat differentiële chemokinereceptorhandel in zebravisneutrofielen neutrofielenclustering en verspreiding op plaatsen van weefselbeschadiging coördineert. Dit heeft implicaties voor ons begrip van hoe ontstekingsreacties zichzelf oplossen. De beschreven hulpmiddelen kunnen worden gebruikt om neutrofiele migratiepatronen in verschillende fysiologische en pathologische omgevingen te begrijpen en de methodologie kan worden uitgebreid naar andere signaalreceptoren.

Inleiding

Leukocytenmigratie is van het grootste belang voor immuunresponsen. Immuuncellen zijn prototypische migrerende cellen, die opmerkelijk goed in staat zijn om weefsels en bloedvaten te doorkruisen en een reeks chemische geleidingssignalen te detecteren om richtingsgewijs naar microben of andere gastheercellen van belang te migreren. Correcte begeleiding is afhankelijk van de herkenning van chemoattractanten, waaronder chemokines de meest prominente categorie1 vertegenwoordigen. Chemokines worden herkend door zeer specifieke zeven-transmembraan G-eiwit gekoppelde receptoren. Na chemokinebinding veranderen chemokinereceptoren de conformatie, wat leidt tot de activering van geassocieerde trimerische G-eiwitten en hun dissociatie in functionele signaalsubeenheden die cytoskeletale veranderingen en gerichte migratie bevorderen1. Ten tweede worden chemokinereceptoren gefosforyleerd en deze modificatie leidt tot desensibilisatie voor lokstof, die kan worden gevolgd door snelle hersensibilisatie / recycling of intracellulaire afbraak en downregulatie van het celoppervlak2. Deze receptordynamiek beïnvloedt de duur en dosis signalering die door de cellen wordt ontvangen, maar hoe ze het migratiegedrag van leukocyten beïnvloeden, is in vivo moeilijk op te helderen.

Het volgen van receptordynamiek in levende leukocyten in traditionele zoogdiersystemen staat voor verschillende uitdagingen. Voor levend onderzoek moeten receptorfusies met fluorescerende eiwitten in de cellen tot expressie worden gebracht. Dit is een uitdaging in primaire leukocyten, met name bij neutrofielen, en studies tot nu toe hebben surrogaat neutrofiele cellijnen gebruikt om chemokinereceptoren tot expressie te brengen 3,4. Het genereren van transgene muismodellen, waarbij leukocyten een fluorescerende receptor of mutante receptoren tot expressie brengen met informatieve smokkeldefecten 5,6, brengt een aanzienlijke investering van tijd en middelen met zich mee. Zelfs in deze gevallen kunnen de beeldvormingsresolutie en het contrast voor beeldvormingsreceptordynamiek in het levende dier beperkt zijn en studies hebben immunohistochemie gebruikt op secties5 van vast weefsel. Gezien deze technische uitdagingen is ons begrip van hoe de dynamiek van chemoattractante receptoren het celgedrag in een levende weefselomgeving beïnvloedt momenteel beperkt.

Hier bieden we een methodologie om receptorhandel in zebravis neutrofielen te monitoren. Zebravissen zijn genetisch handelbaar, net als muizen, maar transgenese is relatief eenvoudiger door het gebruik van efficiënte transposonsystemen en directe zygote-manipulatie7. De transparante larve is idealiter vatbaar voor beeldvorming. De chemokinereceptordynamiek is gevisualiseerd in primordiale geslachtscellen en het laterale lijn primordium door expressie van overeenkomstige fusies met fluorescerende reporters 8,9,10. Zebravislarven zijn uitgerust met volwassen neutrofielen die sterk geconserveerde genetische en cellulaire eigenschappen hebben ten opzichte van neutrofielen van zoogdieren. Subcellulaire signaaldynamica zoals cytoskeletale dynamica en polariteitsregulatoren zijn in deze cellen gevisualiseerd door het genereren van overeenkomstige transgene lijnen 11,12,13. Onlangs hebben we de chemokinereceptordynamiek bij neutrofielen gevisualiseerd en functioneel geanalyseerd in de loop van ontstekingsreacties op weefselschade14. Hier beschrijven we het genereren van transgene reporterlijnen voor chemokine-signalering bij neutrofielen, voorbereiding van embryo's voor live beeldvorming, een wondtest voor het bestuderen van neutrofielensignalering en het protocol voor het verkrijgen en analyseren van beelden. We bieden ook een zijprotocol om chemokinereceptorresponsen op kandidaat-liganden te testen, wat nuttig is bij het vaststellen van ligandherkenningspatronen in niet-gekarakteriseerde receptoren. Deze technieken kunnen worden gebruikt in combinatie met verdere genetische manipulaties, zoals remming van endogene chemokine-expressie of generatie van mutante receptoren met veranderde ligand-geïnduceerde handel, om te onderzoeken hoe specifieke signaaldynamiek het gedrag van leukocyten in vivo beïnvloedt. De transgene lijnen die fluorescerend gelabelde chemokinereceptoren tot expressie brengen, kunnen ook worden gebruikt als verslaggevers voor endogene chemokinegradiënten, die anders moeilijk te detecteren zijn door directe antilichaamkleuring. De beschreven methodologie biedt ruimte om het genereren van reporters uit te breiden naar andere immunosignalerende receptoren.

Protocol

OPMERKING: Alle zebravissen werden gehouden volgens de ARRIVE-richtlijnen en de voorschriften van het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken, UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986.

1. Generatie van transgene reporter zebravislarven voor beeldvorming receptorhandel in leukocyten

  1. Genereer tol2-gebaseerde constructie voor weefselspecifieke expressie van de fluorescerend gelabelde receptor van belang. Gebruik voor neutrofielen promotorsequenties van het lysozym C15 en myeloperoxidase-gen16. De constructie kan worden ontworpen als een fusie met een enkel fluorescerend eiwit (bijv. GFP), een tandem fluorescerende timer (bijv. een snelvouwende GFP en een langzamer rijpende tagRFP 8,14,17) of een bicistronische expressie van reporter GFP en een controlemembraanmarker9 (zie Discussie voor overwegingen bij het kiezen van de aanpak).
    OPMERKING: Dit construct vat geen endogene niveaus van receptorexpressie samen, maar is nuttig voor het verkrijgen van een hoog niveau van receptorexpressie in het celtype van interesse. Raadpleeg de literatuur over vergelijkbare receptoren 3,5,6,8,9,10,14 om de positie van de fluorescerende tag te bepalen.
  2. Zet een tank op met volwassen mannetjes en vrouwtjes van het wilde type volgens standaard houderijpraktijken18, gescheiden door een barrière de dag voor het uitzetten van eieren.
  3. Bereid op de dag van het uitzetten van eieren een transgenesemengsel voor micro-injectie met 12,5 ng / μL Tol2 DNA-construct en 17,5 ng / μL transposase mRNA7. Til barrières op uit vistanks kort nadat de lichten 's ochtends komen (dit kan variëren in verschillende visfaciliteiten) en verzamel eieren binnen 15 minuten voor mRNA-injectie.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de DNA-oplossing RNase-vrij is om afbraak van het transposase-mRNA in het mengsel te voorkomen. Een optie om dit te omzeilen is om eieren te injecteren met afzonderlijke oplossingen van Tol2 construct en transposase.
  4. Volg standaardprotocollen voor transgenese en micro-injectie van zebraviseieren19.
  5. Injecteer 1 nL van de oplossing in de cel van embryo's in eencellig stadium.
    OPMERKING: De expressieresultaten zijn consistenter bij het injecteren in de cel en het weggooien van de injecties die zich mogelijk niet duidelijk in de cel bevinden. Eencellige stadium embryo's zijn bedoeld vanwege de variabiliteit van volume-injectie per cel bij het injecteren van 2-16 celstadium embryo's. Een optie zou zijn om de eencellige injecties te scheiden van batches van latere injecties, voor het geval deze verschillende werkzaamheid hebben.
  6. Controleer de geïnjecteerde embryo's later op de dag en verwijder onbevruchte of dode eieren om het legsel gezond te houden.
  7. Op 3 dagen na de bevruchting (dpf), schermlarven onder een fluorescerende microscoop. De marker zal zichtbaar zijn bij neutrofielen, met name in het caudale hematopoietische weefsel (CHT), dat rijk is aan deze cellen.
    OPMERKING: Het percentage cellen dat wordt gelabeld varieert met verschillende constructen, maar meestal wordt verwacht dat 20-60% van de neutrofielen het construct tot expressie brengt. Lagere percentages voorspellen meestal meer screening in het volwassen stadium. Het is een goede gewoonte om ook de juiste lokalisatie van de receptor bij het membraan te verifiëren, met een beeldvormingsbenadering met een hogere resolutie, in een monster van deze embryo's voordat de vis wordt gekweekt.
  8. Kweek positieve larven volgens standaard houderijpraktijken20. Deze vertegenwoordigen de F0-generatie.
  9. Op de leeftijd van 3 maanden, scherm F0 vis voor oprichters. Kruis individuele vissen met een niet-transgeen wild type en screen hun nakomelingen met 3 dpf op de expressie van de receptor door te kijken onder de ontleedbare scope. Afhankelijk van het transgenesesucces, dat varieert met elk construct, observeer je een percentage positieve nakomelingen in een subset van de kruisingen.
    OPMERKING: Voor een goede transgenese zal ongeveer een derde tot de helft van de volwassenen positieve nakomelingen geven. Het percentage nakomelingen dat positief is in een koppeling varieert met het aantal ingebrachte transgenen en kan tussen de 10-60% liggen. Het is nuttig om de mendeliaanse verhoudingen in de leguwen bij te houden om transgenen met enkele insertie te identificeren (deze zijn gemakkelijker te identificeren in F2-koppelingen door te zoeken naar een verhouding van 50% positieve larven)20.
  10. Kweek de positieve nakomelingen, die de F1-generatie vertegenwoordigen.
  11. Op de leeftijd van 3 maanden screent u F1-volwassenen op dezelfde manier om een stabiele F2-transgene lijn tot stand te brengen.
  12. Voer experimenten uit op F2-larven na validatie van de neutrofiel-specifieke expressie van het transgen.
    OPMERKING: Tijdens de transgenese kan men verschillende niveaus van receptorexpressie waarnemen en het is raadzaam om verschillende transgene koppelingen te houden om het meest geschikte expressieniveau voor de biologische vragen te verkrijgen. De eerste resultaten kunnen worden verkregen in F0- of F1-larven.

2. Het verzamelen van zebravisembryo's voor het beoordelen van leukocyten wondreacties

  1. Nadat je een stabiele transgene reporterlijn hebt opgezet, zet je een kruising op tussen volwassen en vrouwelijke transgene vissen en verzamel je de volgende ochtend eieren.
  2. Kweek embryo's bij 28,5 °C in E3 medium (of ei water18).
  3. Optioneel, bij 24 hpf, incubeer embryo's in een centrifugebuis met 50 ml E3-medium aangevuld met 0,003% bleekmiddel gedurende 5 minuten. Spoel vervolgens 3 keer in E3 medium door de buis een paar minuten te laten staan om de embryo's in de bodem te laten bezinken en vervolgens het medium te decanteren en te vervangen.
    OPMERKING: Dit biedt een niveau van controle op de infectieblootstelling van de larven, die het gedrag van leukocyten tijdens het verwonden kunnen beïnvloeden.
  4. Houd embryo's na het bleken in E3-medium aangevuld met 0,003% 1-fenyl-2-thioureum om melaninesynthese te voorkomen. Methyleenblauw, dat vaak wordt gebruikt om schimmelinfecties te voorkomen, wordt hier niet toegevoegd om weefselautofluorescentie te minimaliseren.
  5. Laat larven op natuurlijke wijze uitkomen en gebruik met 3 dpf wanneer neutrofielen overvloedig aanwezig zijn21.

3. Ventrale vin verwonding van larven

  1. Bereid larven voor op verwonding. Gebruik larven met 2,5-3,5 dpf, wanneer overvloedige neutrofielen worden waargenomen. Breng larven over naar E3 medium aangevuld met 160-200 mg/L tricaine MS222.
    OPMERKING: Geconcentreerde oplossingen van tricaïne moeten van tevoren worden bereid en ingevroren in aliquots en op de dag zelf worden ontdooid.
  2. Laat de larven 15 minuten in E3+tricaine medium staan om ervoor te zorgen dat ze verdoofd worden. Controleer hun reacties door ze voorzichtig aan te raken met een kleine kwast of een soortgelijk hulpmiddel.
  3. Selecteer larven met transgene receptorexpressie onder een fluorescerend ontleedbereik.
  4. Breng larven over naar een petrischaaltje van 120 mm in E3 + tricaine voor verwonding. Snijd met behulp van een steriel scalpel de ventrale vin van de larve, terwijl u observeert onder de ontleedbare scope (figuur 1).
    OPMERKING: Het idee is om een voldoende diepe snede uit te voeren om substantiële neutrofielenrekrutering te veroorzaken, maar zonder de vaten van de CHT te snijden. De snede wordt loodrecht op de CHT-as gemaakt, zodat de incisie bijna de vaten van de CHT bereikt. Dit vergt enige oefening en moet eerst worden uitgevoerd met toezicht op larven die niet voor dit doel worden gegenereerd (bijvoorbeeld overtollige larven uit een ander experiment).

4. Voorbereiding van larven voor levende beeldvorming

  1. Los laag smeltpunt (LMP) agarose op in E3-medium door verhitting om een vloeibare 2% agarose-oplossing te verkrijgen.
  2. Laat deze oplossing afkoelen tot 60 °C.
    OPMERKING: Bewaar een kolf of buis met agarose in een incubator bij 60 °C om te voorkomen dat er agarose wordt ingesteld tussen de montage van verschillende larven.
  3. Pipetteer 0,5 ml van de vloeibare LMP + E3 in een glazen bodemschaal voor microscopie beeldvorming.
  4. Pipetteer een gewonde, verdoofde zebravislarve samen met 0,5 ml E3 + 2x Tricaine in de glazen bodemschaal.
  5. Meng de twee oplossingen voorzichtig om een 1% LMP/1x Tricaine agarose/E3 oplossing te verkrijgen, waardoor het ontstaan van bubbels wordt voorkomen. Richt het embryo zijdelings en duw zachtjes naar beneden zodat het caudale deel van de vis zo dicht mogelijk bij het glas ligt.
    OPMERKING: Het weefsel dat moet worden afgebeeld, moet zich zo dicht mogelijk bij de glazen bodem bevinden wanneer het wordt afgebeeld met een omgekeerde microscoop. De oriëntatie voor de larve moet snel zijn, zodat de agarose niet uitzet voordat de larve is gepositioneerd.
  6. Laat de agarose-oplossing afkoelen en stollen gedurende 5-10 minuten. Test of de agarose is ingesteld door de agarose-gel voorzichtig aan te raken met een kleine verfkwast of -punt.
  7. Zodra de agarose vast is, voegt u 2 ml E3 aangevuld met 0,2 mg / ml tricaïne toe aan de beeldvormingsplaat.

5. Live confocale beeldvorming

OPMERKING: Beeld embryo's af op een confocale microscoop van een draaiende schijf of gelijkwaardig (figuur 2). Een laserscanmicroscoop kan ook worden gebruikt, maar de temporele resolutie van de dynamiek zal meer beperkend zijn. Bereid de beeldvormingsinstellingen voor voordat u de gewonde larve brengt, zodat de reactie zo snel mogelijk na het verwonden in beeld kan worden gebracht. Neutrofielen komen binnen 5 minuten in de wond en receptoren in de eerste aankomende cellen kunnen zich binnen dit tijdsbestek internaliseren. Met oefening is het mogelijk om al 15 minuten na het verwonden in beeld te komen.

  1. Schakel de microscoop in: laser, camera en computer volgens de instructies van de fabrikant.
  2. Gebruik acquisitiesoftware om de beeldbewerkingsinstellingen in te stellen. Kies lasers voor de juiste fluoroforen en geschatte belichtingstijden op basis van eerdere experimenten (verkrijg GFP met 488 nm en tagRFP met 561 nm laser).
  3. Breng de plaat met het gemonteerde embryo, zo snel mogelijk nadat agarose is gezet, over op het confocale beeldvormingsplatform voor draaiende schijven.
  4. Gebruik het microscoopoogstuk om de vis in de schaal te vinden met behulp van de podiumjoystick.
  5. Focus op het wondgebied met behulp van de scherpstelknop.
    OPMERKING: Om het interessegebied te vinden, kan het gemakkelijker zijn om een luchtobjectief met lage vergroting (10x) te gebruiken.
  6. Selecteer het veld dat u rond de wond wilt weergeven. Gebruik een 30x/40x objectief met een hoog numeriek diafragma om voldoende resolutie te verkrijgen.
  7. Gebruik de softwareknoppen om de belichtingstijd aan te passen, zodat de fluorescerende marker met een goed contrast kan worden gezien, maar zonder het signaal te verzadigen.
    OPMERKING: De belichtingstijd moet zo laag mogelijk zijn om fluorescerende blootstelling te minimaliseren en de temporele resolutie in de time-lapse te maximaliseren. Het laservermogen is afhankelijk van de conditie van de laser, maar moet worden aangepast aan een niveau dat een voldoende lage belichtingstijd mogelijk maakt voor dynamische beeldvorming.
  8. Gebruik de softwareknoppen om het volume te selecteren om als een z-stack te maken
  9. Stel elke 30 s een time-lapse in voor de gewenste duur.
    OPMERKING: Voor steriele ventrale vinwonden wordt de maximale rekrutering waargenomen met 2-3 uur.
  10. Voordat u de time-lapse start, maakt u een heldere momentopname van het veld om het gezichtsveld te documenteren. Verwerf indien mogelijk een helder veld in de time-lapse-film.

6. Kwantificering van receptorinternalisatie bij neutrofielen van zebravissen

  1. Noteer het tijdsinterval van beeldacquisitie en de pixelgrootte van de afbeelding. Houd bij hoeveel minuten na het verwonden de beeldvorming is begonnen.
  2. Open de afbeeldingsgegevenssets met Fiji door de afbeelding naar de software-interface te slepen, selecteer een representatief interessekader voor elke dataset met behulp van de tijdschuifregelaar, bijvoorbeeld op 1-1,5 uur na het verwonden, en sla het op.
  3. Ga verder met MATLAB om de afbeeldingsgegevensset te verwerken.
  4. Maak een nieuw script en neem functies op voor het lezen van afbeeldingen (regel 6 in het script genaamd 'select_neutrophils.m' voor centroïde definitie in aanvullend bestand 1), openen (regel 11 in aanvullend bestand 1) en handmatige selectie van punten op de afbeelding (regel 12 in aanvullend bestand 1).
  5. Open het interessekader door dit script uit te voeren (aanvullend bestand 1), identificeer de neutrofielen om te analyseren door visuele inspectie, klik erop en noteer een schatting van hun centroïden, zowel in de ventrale vinwond als in de CHT.
    OPMERKING: De niet-gemobiliseerde neutrofielen in de CHT dienen als een interne referentie voor neutrofielen waarvan de receptorverdeling constant blijft. Dit maakt normalisatie van contrastwaarden van cellen aan de wond tot een interne referentie mogelijk.
  6. Ga verder met segmentatie van de neutrofielen in elk frame met behulp van actieve contourentechniek22 zoals beschreven in de onderstaande stappen.
  7. Maak een functie om de metagegevens op te nemen die nodig zijn voor segmentatie door actieve contouren (d.w.z. aantal iteraties, vertekening van contour, geschatte centroïde enz.) 22 (zie "wondgegevens.m" in aanvullend dossier 2).
  8. Maak een script dat de functie 'wound_data.m' aanroept om de benodigde informatie in te voeren voor segmentatie van elke neutrofiel (regel 28 in script genaamd 'calc_contrast.m' in Aanvullend bestand 3).
  9. Neem in de scriptopdrachten op voor het lezen van afbeeldingen (regel 32 in Aanvullend bestand 3).
  10. Voeg de generatie van een zwarte afbeelding (d.w.z. afbeelding waarbij pixelwaarden nullen zijn) toe met een gelijke grootte als de invoerafbeelding (regel 44 in aanvullend bestand 3) en de definitie van een kwadraat van 10 × 10 pixels rond het middelpunt van elke neutrofiel (regel 45 in aanvullend bestand 3).
  11. Neem de neutrofiele segmentatie op met behulp van actieve contouren (regels 48-49 in aanvullend bestand 3) en het verwijderen van kleine vals gedetecteerde objecten (regel 52 in aanvullend bestand 3).
    OPMERKING: De initiële segmentatiecontour is het vierkant rond het middelpunt, dat evolueert door actieve contourtechniek op basis van de pixelintensiteiten, het aantal iteraties en de vertekening van contour. Het resultaat van segmentatie is een binair masker waarbij alle pixels waarde 0 hebben, afgezien van het neutrofiele gebied waarvan de pixels waarde 1 hebben.
  12. Neem de vermenigvuldiging van de gesegmenteerde binaire afbeelding op met de originele om alleen de pixelintensiteiten van de neutrofiel te krijgen, waarbij de rest van de afbeelding geen getal is, zodat deze niet bijdraagt aan berekeningen (regels 56-57 in aanvullend bestand 3).
  13. Voeg de berekening van de grijs-level co-occurrence matrix toe voor elke neutrofiel (GLCM)14,23 (regel 61 in aanvullend bestand 3). GLCM is een andere weergave van de afbeelding die de relatieve positie van pixels in termen van pixelintensiteit laat zien.
  14. Neem de berekening van het contrast van de neutrofielen op basis van de GLCM op (regels 62,65 in aanvullend dossier 3). De contrastmetriek meet verschillen in intensiteit tussen naburige pixels. Pixels worden vergeleken met pixels op een bepaalde afstand van elkaar, die empirisch kunnen worden aangepast op basis van de grootte van lokale pieken in intensiteit. Ter indicatie, voor de afbeeldingen, met een pixelgrootte van 0,389 μm, toen de receptor vesiculaire verdeling vertoonde, bevond elke heldere stip zich in het bereik van 5 pixels. Daarom werden intensiteiten vergeleken in pixels die 5 pixels uit elkaar stonden.
  15. Voeg opdrachten toe om de waarden afzonderlijk op te slaan voor individuele neutrofielen in de ventrale vin (regel 68 in aanvullend bestand 3).
  16. Neem de berekening van de gemiddelde neutrofielencontrastwaarde van alle CHT-neutrofielen op dezelfde manier op als voor neutrofielen in de wond (regels 72-119 in aanvullend dossier 3). Voor CHT-neutrofielen roept u de functie 'cht_data.m' aan (regel 77 in aanvullend bestand 4).
  17. Neem de normalisatie op van de contrastwaarde van individuele neutrofielen bij de wond tot het gemiddelde contrast van CHT-neutrofielen zoals hierboven berekend in stap 6.16 (d.w.z. deling) (regel 122 in aanvullend dossier 3). Dit geeft een genormaliseerd contrast dat weerspiegelt hoe 'dotty' het uiterlijk van receptor is in individuele reagerende cellen ten opzichte van controle niet-reagerende cellen (figuur 3 en figuur 4).
  18. Voer het script (Aanvullend bestand 3) uit door op het run-symbool in de software te klikken.
  19. Herhaal alle stappen voor verschillende omstandigheden.
  20. Gebruik statistische software (zie Tabel met materialen) om de resultaten voor de verschillende omstandigheden te importeren door een kolomtabel te maken, de resultaten uit te zetten en statistische tests uit te voeren om de significantie van het verschil tussen de gemiddelde waarden te controleren.
    OPMERKING: De codes voor de analyse zijn ook te vinden in GitHub op https://github.com/LeukocyteMotionAndDynamics/ReceptorTraffic

7. Chemokine respons assays in vroege embryo's

OPMERKING: Dit is een optioneel zij-experiment dat het mogelijk maakt om veranderingen in de receptorverdeling te testen als reactie op een kandidaat-chemokine en is onafhankelijk van de hierboven beschreven experimenten met betrekking tot neutrofiele expressie van de receptorconstructen. Verschillen in ligand-geïnduceerde handel tussen receptoren zijn moeilijk vast te stellen met deze techniek, omdat de ligandniveaus verzadigen14. Als men echter ligand-internalisatie van een receptor in dit systeem ziet, kan dit een indicatie zijn dat het ligand door de receptor wordt herkend in gevallen waarin de ligandidentiteit onduidelijk is. Dit is nuttig, omdat expressie van chemokinereceptoren in gevestigde cellijnen zoals HEK293T-cellen14 omslachtig kan zijn.

  1. Zet een kruis van wilde vissen op (bijv. AB) en verzamel eieren de volgende ochtend kort na het optillen van de separatoren (zoals hierboven beschreven).
  2. Injecteer 100 pg fluorescerend gelabeld receptor mRNA (bijv. Cxcr1-FT), samen met 100 pg mRNA voor een membraanmarker (bijv. membraan CFP). Neem in het mengsel verschillende doses mRNA op voor chemokineligand.
    OPMERKING: Als indicatie gaf 150 pg Cxcl8a mRNA een prominente internalisatie van fluorescerende Cxcr1-FT (zie figuur 5).
  3. Spoel embryo's af met E3 medium en incubeer bij 28°C.
  4. Test bij ongeveer 7 hpf de expressie van het mRNA op een fluorescerende ontleedbare scope en selecteer de embryo's om in beeld te brengen.
  5. Bereid vooraf 0,8 % LMP agarose voor en bewaar in een glazen buis in een heatblock bij 60 °C. Gebruik een glazen pipet om de embryo's te manipuleren. Dechorioneer embryo's voorzichtig met behulp van een tang in elke hand.
  6. Zuig een individueel gedechorioneerd embryo op met de glazen pipet en zorg ervoor dat er geen bubbels aan de punt zitten. Laat het embryo voorzichtig los in de buis van agarose waardoor het in de buis kan zinken.
  7. Zuig het embryo op uit de agarosebuis en verzamel onderweg wat vloeibare agarose. Laat het embryo voorzichtig los op het midden van een beeldschaal met glazen bodem. Draai het embryo snel zodat de dierenpaal naar de onderkant van de schaal is gericht (deze kant moet het dichtst bij het objectief liggen bij gebruik van een omgekeerde microscoop).
    OPMERKING: Het kan nodig zijn om de oriëntatie van embryo's aan te passen terwijl de agarose nog steeds wordt ingesteld.
  8. Nadat de agarose is ingesteld, vult u aan met 2 ml E3-medium.
    OPMERKING: De embryo's in dit stadium zijn erg kwetsbaar in vergelijking met larven en het vergt enige oefening om te dechorioneren en op te zetten. Het is belangrijk om zo voorzichtig mogelijk te aspirateren en vrij te geven, om te voorkomen dat het embryo scheurt.
  9. Herhaal het proces met als doel 3-5 embryo's per gerecht te laden.
  10. Beeld embryo's op een omgekeerde confocale microscoop (zie Tabel met materialen). Gebruik een oliedoelstelling van 40x/1,3 NA om een voldoende hoge resolutie te verkrijgen. Visualiseer mCFP, sfGFP en tagRFP met respectievelijk 405, 488 en 552 nm op de scope. Pas filters en instellingen aan om een hoog contrast te hebben, terwijl verzadiging wordt vermeden en lekken tussen de kanalen worden geminimaliseerd.
  11. Herhaal de montage en beeldvorming voor verschillende omstandigheden.

Resultaten

Ventrale vinwonden worden gevolgd door snelle neutrofielenmobilisatie van de CHT in de ventrale vin en clustering aan de wondrand, binnen 30-60 minuten (figuur 1). We visualiseerden de verdeling van twee chemokinereceptoren, Cxcr1 en Cxcr2, die worden uitgedrukt door zebravisneutrofielen24 en Cxcl8a en Cxcl8b14 herkennen, met behulp van confocale microscopie van draaiende schijven. We genereerden twee overeenkomstige transgene lijnen, Tg(lyz:Cxcr1-FT) en Tg(lyz:Cxcr2-FT), waarin neutrofielen een fluorescerende timer (FT) constructie van de receptor tot expressie brengen, d.w.z. een fusie met een tandem van sfGFP en tagRFP (figuur 2 en referentie14). Het gebruik van de twee fluoroforen was bedoeld om monitoring van een breed scala aan receptoren mogelijk te maken en schattingen te geven van de eiwitomzettijd bij het plasmamembraan, omdat nieuw gesynthetiseerde receptoren in groen fluoresceren en geleidelijk rood worden naarmate zeouder worden,14. Deze receptoren bleken echter een snelle constitutieve omzet te hebben bij het neutrofiele plasmamembraan en dat de verblijftijd korter was dan de rijpingstijd van tagRFP, waarbij sfGFP membraanlokalisatie toonde en tagRFP vesiculaire lokalisatie bij steady state (aanvullende video 1 en ref14). Daarom hebben we ons gericht op de distributie van sfGFP om ligand-geïnduceerde internalisatie op plaatsen van weefselschade te controleren. Het patroon van receptorverdeling werd gekwantificeerd met behulp van de contrastmetriek, die verschillen in intensiteit tussen naburige pixels rapporteert. De redenering is dat wanneer de receptorverdeling vliezig en glad is, de contrastwaarde laag is. Wanneer de receptorverdeling vesiculair en punctaat is, is de contrastwaarde hoog (figuur 3).

Een alternatieve methode is het kwantificeren van de verhouding van receptorniveaus (sfGFP-intensiteit) over de niveaus van een controlemembraanmarker, bijvoorbeeld membraan CFP (mCFP) (figuur 3). Beide methoden kunnen receptorinternalisatie detecteren, zoals aangegeven door een meer vesiculaire receptorverdelingspatroon wereldwijd in de cel (hogere contrastwaarde) of lagere receptorniveaus op het membraan (lagere sfGFP / mCFP-verhouding). De contrastmetriek kon echter ook receptorinternalisatie detecteren in neutrofielenclusters aan de wond, waarbij membraansegmentatie minder nauwkeurig en niet toepasbaar was (figuur 3). Met behulp van deze statistiek konden we zichtbare verschillen kwantificeren tussen Cxcr1 en Cxcr2-handel in neutrofielen bij wonden (figuur 4 en aanvullende video 2). Cxcr1-FT geïnternaliseerd in cellen in de wond, terwijl Cxcr2-FT vliezig bleef bij neutrofielen in de wond (figuur 4A-C, aanvullende video 2 en aanvullende video 3). Onderdrukking van Cxcl8a en Cxcl8b, door morfolinobehandeling, beïnvloedde differentieel Cxcr1-FT internalisatie bij wonden (figuur 4C,D). Om verder te valideren dat Cxcr1-FT reageert op Cxcl8a, voerden we chemokineresponstests uit in vroege embryo's. We vonden dat Cxcr1-FT duidelijk geïnternaliseerd was in embryo's waarin Cxcl8a mede tot expressie kwam (figuur 5). Al met al geven deze resultaten aan dat de beschreven methoden kunnen worden ingezet om chemokine-geïnduceerde receptorinternalisatie bij neutrofielen te meten en de identiteit vast te stellen van het ligand dat deze effecten bemiddelt.

figure-results-1
Figuur 1: Neutrofiele migratie naar ventrale vinwonden. (A) (Links) Cartoon van 3 dpf larve toont de locatie van het caudale hematopoietische weefsel (CHT), de venuscirculatie (VC, blauw), de ventrale vin (VF) en de wondplaats. (Rechts) Cartoon met het gebied van de wond (W) met neutrofielen die worden gemobiliseerd uit de CHT en clustering bij de wond. De caudale ader plexus (CVP) van het CHT-weefsel is blauw getekend. (B) Helder veldbeeld (links) en confocale projectie (rechts) met de ventrale vinwond en de verdeling van neutrofielen in Tg(mpx:GFP)-larven 2 uur na de verwonding. Stippellijnen tonen VF- en CHT-contouren. Schaalbalk = 25 μm. Cartoon en fluorescerend beeld gewijzigd van ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Live beeldvorming van de handel in chemokinereceptoren bij neutrofielen. (A) Constructen gebruikt voor neutrofiel-specifieke transgene expressie van Cxcr1-FT (Fluorescent Timer) en Cxcr2-FT. Confocale projecties van neutrofielen in het hoofd van een 3 dpf transgene larve (Tg(lyz:Cxcr1-FT), boven; Tg(lyz:Cxcr2-FT), onder) met tRFP (magenta) en sfGFP (groen) kanalen. Schaalbalk = 20 μm. (B) Anatomisch schema van 3 dpf larve zoals in figuur 1A. Onder de larve zijn schema's die het gebied van de wond (W) weergeven met neutrofielen die worden gemobiliseerd van de CHT (boven) of die chemotaxis uitvoeren bij het binnengaan van de ventrale vin (onder). Onderbroken vierkant geeft het gebied aan dat is afgebeeld in snapshots aan de rechterkant. (C) Neutrofielen in Tg(lyz:Cxcr1-FT) larven (sfGFP wordt getoond) bij mobilisatie van de CHT (bovenste panelen) of chemotaxis naar de wond (onderste panelen). Pijlen tonen dezelfde cellen in de loop van de tijd. Tijdpunten op de rechterafbeelding zijn minuten verstreken na afbeelding aan de linkerkant. Schaalbalk = 10 μm. (D) Schematische weergave van experimentele benadering voor live beeldvorming van chemokinereceptorhandel. Panelen A-C gewijzigd van ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Kwantificeringsvoorbeelden van receptordynamica. Enkele (blauwe) of geclusterde neutrofielen (groen) bij wonden of niet-gemobiliseerde neutrofielen in de CHT (rood, oranje) werden gesegmenteerd en geanalyseerd met verschillende methoden om de resultaten te vergelijken. Dezelfde getoonde voorbeeldcellen werden geanalyseerd met twee methoden om wat er in de afbeelding te zien is te relateren aan het bereik van de geëxtraheerde waarden. (A) Het oppervlak van de geselecteerde voorbeeldcellen is gesegmenteerd op basis van de contourdefinitie in het sfGFP-kanaal. (B) Contrast werd berekend op basis van de voorbeeldcellen in A. (C) Het membraan van de geselecteerde, voorbeeldcellen werd gesegmenteerd op basis van contourdefinitie in het CFP-kanaal. Ratiometrische analyse van sfGFP/CFP volgde. (D) De verhouding sfGFP/CFP werd berekend op de voorbeeldcellen in C. Foutbalken vertegenwoordigen S.E.M. van individuele cellen, in gevallen van n>1 werden de waarden hier niet gebruikt voor statistische analyse, maar slechts om metingen te illustreren die met de verschillende kwantificeringsmethoden zijn verkregen. Schaalbalk = 10 μm. Figuur gewijzigd van ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Differentiële dynamica van Cxcr1 en Cxcr2 als reactie op verwonding. (A) Confocale projectie van neutrofielen in Tg(lyz:Cxcr1-FT) of Tg(lyz:Cxcr2-FT) larven bij de wond 80 min na de verwonding (sfGFP-kanaal getoond). Schaalbalk = 10 μm.  (B) Vergrote Cxcr1-FT neutrofiel (links) en Cxcr2-FT (rechts) bij de wond. Groene receptor wordt weergegeven in grijs. Schaalbalk = 5 μm. (C) Genormaliseerd contrast (contrast per individuele neutrofiel genormaliseerd tot het gemiddelde contrast van niet-gemobiliseerde cellen in de CHT). cxcl8a verwijst naar injectie van een splice-blocking samen met een translatie-blokkerende morpholino voor cxcl8a. cxcl8b verwijst naar injectie met een splice-blocking morpholino voor cxcl8b. Voor Tg(lyz:Cxcr1-FT): n=24 cellen (CHT), n=47 cellen (wond) van 8 larven. Voor Tg(lyz:Cxcr1-FT) met morfolines: n=28 cellen (Cxcl8a-MO) van 5 larven, n=16 cellen (Cxcl8b-MO) van 5 larven. Voor Tg(lyz:Cxcr2-FT): n=10 cellen (CHT) en n=20 cellen (wond) van 3 larven. Gegevens werden samengevoegd van onafhankelijke larven verkregen in 1-5 beeldvormingssessies. Kruskal-Wallis test met Dunn's meerdere vergelijkingstest voor Tg (lyz: Cxcr1-FT), tweezijdige ongepaarde Mann-Whitney-test voor Tg (lyz: Cxcr2-FT). (D) Confocale projectie van neutrofielen in Tg(lyz:Cxcr1-FT) transgene larven behandeld met cxcl8a morpholino (MO) (links) en cxcl8b MO (rechts) die reageren op vinwonden (sfGFP-kanaal weergegeven in groen). Snapshot genomen op tijdstippen van equivalente neutrofielenaccumulatie (85 min na verwonding in linkerbeeld en 45 min na verwonding in rechterbeeld). Schaalbalk = 10 μm. Figuur gewijzigd van ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Chemokine respons assay in vroege embryo's. Laserscanning van confocale plakjes gastruleren embryo's die expressie en distributie van Cxcr1-FT vertonen. 100 pg Cxcr1-FT mRNA werd geïnjecteerd in eieren in één celstadium met of zonder 150 pg Cxcl8a mRNA. Groene en rode receptoren worden in afzonderlijke kanalen weergegeven. Controlemembraan CFP marker (mCFP) wordt weergegeven in het cyaan kanaal. Schaalbalk = 20 μm. Figuur gewijzigd van ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende film 1: Transgene neutrofielen in het hoofd van een Tg(lyz:Cxcr1-FT) (links) en Tg(lyz:Cxcr2-FT) (rechts) larve bij 3 dpf. sfGFP (groen), tagRFP (magenta). Frame-interval is 30 sec en framesnelheid is 5 fps. Schaalbalk = 20 μm. Video is afkomstig van ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende film 2: Neutrofielen bij Tg(lyz:Cxcr1-FT) (links) en Tg(lyz:Cxcr2-FT) (rechts) transgene larven die reageren op vinwonden. De film begint binnen 10 minuten na het verwonden en duurt 60 min. sfGFP (groen), tagRFP (magenta). Frame-interval is 30 sec en framesnelheid is 10 fps. CHT = caudaal hematopoietisch weefsel. VF = ventrale vin. Schaalbalk = 25 μm. Video is afkomstig van ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende film 3. Aanvullende voorbeelden van neutrofielen van een gewonde Tg(lyz:Cxcr1- FT) transgene larve (andere larve dan die getoond in Video 2), verkregen met een hogere resolutie, met receptorinternalisatie (sfGFP-kanaal weergegeven in groen) bij mobilisatie in de CHT of bij binnenkomst en chemotaxis in de ventrale vin. Frame-interval is 30 sec en framesnelheid is 2 fps. Schaalbalk = 10 μm. Video is afkomstig van ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 3: Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 4: Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

De beschreven methode maakt live beeldvorming mogelijk van receptordynamiek in reactie op endogene liganden in situ tijdens een ontstekingsreactie op weefselschade. Het gebruik van Cxcr1/Cxcr2 neutrofielenreporters kan worden uitgebreid naar andere fysiologische instellingen, zoals infectie, tumormodellen of andere soorten weefselschade 14,25,26,27. Bovendien kunnen transgene reddingslijnen, waarbij de endogene receptor wordt onderdrukt en gered door een exogene mutante receptor, nuttige hulpmiddelen bieden om het belang van specifieke neutrofiele migratiepatronen in immuunresponsen te ontleden. Cxcr1-receptormutanten die de desensibilisatie hebben aangetast, veroorzaken bijvoorbeeld meer prominente neutrofielenclustering op ontstekingsplaatsen14. Deze toename van functiefenotype kan worden gebruikt om de rol van neutrofiele congregatie in verschillende fysiologische processen te begrijpen, bijvoorbeeld wondherstel, infectieziekte of tumorevolutie, en receptor knockdown / knock-out experimenten aan te vullen. De methodologie biedt ook een basis om het bereik van beschikbare verslaggevers uit te breiden. De keuze van de fluorescerende verslaggever is belangrijk om te overwegen en hangt af van de biologische vraag. We vonden dat de constitutieve omzet van deze chemokinereceptoren in neutrofielen hoog was, in vergelijking met epitheelcellen, en dat verslaggevers met snelle rijping (bijv. sfGFP) membraanniveaus bij steady state moesten rapporteren en verschillen moesten oplossen bij neutrofiele stimulatie 8,14. Membraanverhoudingen van sfGFP / tagRFP zijn dus niet van toepassing voor het meten van ligand-geïnduceerde internalisatie in dit celtype, maar het patroon van tagRFP maakt het mogelijk om de intracellulaire lotgevallen van de receptor te volgen, wat nuttig zou kunnen zijn in sommige studies. We ontdekten ook dat het meer geconcentreerde intracellulaire signaal van tagRFP nuttig is voor het screenen van individuele larven. Een alternatieve benadering voor het meten van receptorniveaus bij het plasmamembraan zou zijn om een fluorescerende membraanmarker in neutrofielen co-express te brengen in hetzelfde transgen9 of in een onafhankelijk transgen14. In het eerste scenario zou het transgen een extra middel bieden voor het screenen van de vissen en zouden de expressieniveaus vergelijkbaar zijn tussen de marker en de receptor. De laatste aanpak zou meer modulair zijn, in die zin dat een zebravislijn met een receptorverslaggever kan worden gecombineerd met verschillende reporterlijnen. In beide gevallen is het vermeldenswaard dat membraankwantificering van de receptorniveaus een uitdaging is bij geclusterde neutrofielen (zie hieronder). Ten slotte merken we op dat een mogelijke uitbreiding van dit protocol zou zijn om de live beeldvorming door immunohistochemie op te volgen voor meer gedetailleerde lokalisatieanalyses.

Het Tol2-transgenesesysteem is goed ingeburgerd7 en de lysozym C-promotor is uitgebreid gebruikt voor neutrofiele expressie11,15. De transgenesebenadering is daarom relatief eenvoudig en het expressieniveau dat met deze promotor wordt bereikt, is hoog genoeg om voldoende contrast te bieden voor analyse van receptordynamiek. Een mogelijke beperking is dat het expressieniveau de endogene receptorexpressieniveaus niet samenvat. Nieuwe CRISPR-technologieën kunnen worden ingezet om knock-in-lijnen vast te stellen voor receptoren van bijzonder belang28. Deze technologieën zijn nog steeds omslachtig en garanderen mogelijk niet de vereiste expressieniveaus voor subcellulaire beeldvorming, maar hun succesvolle ontwikkeling zou een belangrijke doorbraak zijn voor het begrijpen van endogene signaleringsdynamiek. Functionele validaties zijn belangrijk voor het interpreteren van gegevens met transgene receptorconstructen. Ligandherkenningstests kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om vast te stellen dat het fluorescerende fusie-eiwit functioneel is en redding van knock-outfenotypen kan worden gebruikt om vast te stellen dat de transgene neutrofiele expressieniveaus compatibel zijn met functionaliteit14. Ten slotte zou een meer directe manier om de receptorfusie te valideren zijn om een in vitro functionele test te gebruiken met gelabelde receptor naast niet-gelabelde versies14.

De kwantificeringsbenadering richt zich op specifieke problemen bij nauwkeurige membraansegmentatie bij neutrofielen in vivo. In cellen van epitheliale aard kan kwantificering van receptorniveaus automatisch worden uitgevoerd door membraanreceptorniveaus te normaliseren tot een controlemarker, die in tandem of afzonderlijk kan worden uitgedrukt9. Inderdaad, we hebben een dergelijke benadering toegepast bij het gebruik van de ligand-herkenningstest in gastrulatende embryo's14. Neutrofielen ondergaan echter complexe, snelle veranderingen in celvorm in vivo, waardoor de membraansegmentatie zowel in 2D als 3D14 moeilijk wordt. Dit is nog uitdagender wanneer neutrofielen clusteren, wat in veel fysiologische omgevingen voorkomt29. De contrastmetriek overwint deze beperking omdat het geen membraansegmentatie vereist, maar in plaats daarvan de algehele toestand van receptorverdeling in de cel weerspiegelt (vliezig / glad versus vesiculair / dotty). Het is belangrijk op te merken dat de contrastmetriek kan worden beïnvloed door het algehele contrast van het beeld, dus normalisatie van individuele celwaarden naar een interne referentie is vereist om rekening te houden met de variabiliteit van het signaal in verschillende embryo's / monsters. We gebruikten bijvoorbeeld de gemiddelde celcontrastwaarde van niet-responsieve neutrofielen in de CHT (d.w.z. neutrofielen die stationair blijven en niet migreren naar de ventrale vin)14. Een extra mogelijkheid zou zijn om te normaliseren met contrastwaarden van een controlemarker in dezelfde cel. Dit zou een oplossing bieden wanneer een interne referentie van niet-reagerende cellen niet beschikbaar is en kan waarschijnlijk fijnere kwantitatieve verschillen in receptordynamiek tussen verschillende omstandigheden oplossen.

De locatie van beeldvorming is een andere variabele om te overwegen. De reden om hier de ventrale vinwond te kiezen, in tegenstelling tot het meer algemeen gebruikte staartvin wondmodel16,30, is omdat de plaats van verwonding in de buurt ligt van de plaats van neutrofiele woonplaats / migratie-oorsprong. Dit versnelt de tijdlijn van de test, omdat het relatief weinig tijd kost voordat neutrofielen arriveren. Bovendien biedt het de mogelijkheid om celgedrag vast te leggen, zowel bij de migratieoorsprong (CHT) als bij de doellocatie van belang (wond). Dit is hier relevant, omdat de ruimtelijke en temporele resolutie die nodig is voor subcellulaire beeldvorming moeilijk te combineren is met een groot gezichtsveld of multi-positie scannen. De ventrale vin wondtest maakt het dus mogelijk om de evolutie van de migratierespons van de migratieoorsprong te volgen en gelijktijdige vangst van niet-specifieke receptorfluctuaties in cellen die niet reageren. Zoals hierboven vermeld, is dit laatste nuttig voor kwantificeringsdoeleinden omdat het een interne referentie biedt voor niet-specifieke dynamiek. In andere systemen is het mogelijk dat een dergelijke interne referentie niet mogelijk is, in welk geval de contrastwaarden van een co-uitgedrukte membraanmarker een alternatieve regeling zouden bieden.

Samenvattend verwachten we dat de methodologie toepasbaar is op andere systemen en voor verschillende doeleinden kan worden ingezet. Dezelfde verslaggevers kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt in andere inflammatoire omgevingen, zoals infectie-instellingen of andere ziektemodellen. Het repertoire van zebravisreceptor reporterlijnen kan worden uitgebreid naar andere signaalreceptoren, om signaleringsmechanismen te begrijpen of liganddynamica in vivo te rapporteren. De aanpak kan worden gecombineerd met knockdown/knockout technieken om de mechanistische basis van de waargenomen dynamiek te ondervragen. Verstoring van ligandexpressie kan bijvoorbeeld wijzen op de ligandafhankelijkheid voor waargenomen receptordynamiek. In de toekomst voorzien we dat het systeem verder verfijnd kan worden om knock-in insertie van verslaggevers op te nemen. Uiteindelijk zouden bevindingen met behulp van deze methodologie nieuwe inzichten opleveren die waardevol zijn buiten de zebravisgemeenschap, gezien het behoud van deze signaalreceptoren bij zoogdieren en de relatieve uitdaging om deze studies in grotere organismen uit te voeren.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling

Dankbetuigingen

We bedanken Christine Holt en Bill Harris voor hun hulp bij confocale microscopie. We bedanken Darren Gilmour voor de fluorescerende timer backbone constructs en Anna Huttenlocher voor de Tol2-Lyz backbone vector. We bedanken Steve Renshaw voor de Tg(mpx:GFP)i114 lijn. Dit werk werd ondersteund door de MRC (MR/L019523/1), de Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] en een Isaac Newton Trust grant 19.23(n). C.C. werd ondersteund door een MRC DTP-studentschap en gedeeltelijk door de Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] subsidie. H.W. werd ondersteund door een MRC DTP Studentship. H.P. werd ondersteund door een Wellcome Trust PhD beurs (105391/Z/14/Z) en deels door een Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] subsidie en de MRC (MR/L019523/1).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1-phenyl-2-thioureaSigma-AldrichP7629-25G
50mL CellStar Centrifuge TubeGrenier Bio-One Limited210270
Clark capillary glassHarvard Apparatus30-0020
Cleanline Thin BleachScientific Laboratory SuppliesCLE0301
Dissecting scopeNikonSMZ645
Dri Block heaterTechneFDB02AD
FijiNational Institutes of Health, Bethesda, MD
Forceps, Jewelers Dumont No. 5Sigma-AldrichF6521
Glass bottom microwell dishesMatTekP35G-1.5-14-C
Glass pasteur pipetteFisherbrand11795098
Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription KitInvitrogen10391175
Leica SP8 confocal microscopeLeicaN/A
Low melting point agaroseInvitrogen16520-100
Magnetic standNarishigeGJ-1
MATLABThe MathWorks, Inc., Natick, MA
Methylene blueSigma-AldrichM9140-25G
MgSO4Sigma-AldrichM-2643
Microinjection systemParkerPicospritzer III
Microloader pipette tipsEppendorf5242956003
MicromanipulatorNarishigeM-152
Micropipette PullerSutter Instrument CompanyFlaming/Brown P-97
Microscope slideThermo-ScientificJ1800AMNZ
PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscopeOlympusN/A
Petri dish (120mm)Grenier Bio-One Limited632180
Phenol redSigma-AldrichP0290-100ML
Poly(A) Tailing KitInvitrogenAM1350
PrismGraphPad Software
Small paintbrushN/A
Spectral Applied Research LMM5 laser moduleN/A
Surgical Scalpel Blade No. 23Swann-Morton233-5528
Tricaine MS222Sigma-AldrichE10521-50G
Volocity softwareN/A
Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scannerYokogawaN/A

Referenties

  1. Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annual Review of Immunology. 22, 891-928 (2004).
  2. Cotton, M., Claing, A. G protein-coupled receptors stimulation and the control of cell migration. Cellular Signalling. 21 (7), 1045-1053 (2009).
  3. Liu, X., et al. Bidirectional regulation of neutrophil migration by mitogen-activated protein kinases. Nature Immunology. 13 (5), 457-464 (2012).
  4. Wen, X., Jin, T., Xu, X. Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells. Journal of Visualized Experiments. (115), e54511(2016).
  5. Arnon, T. I., et al. GRK2-dependent S1PR1 desensitization is required for lymphocytes to overcome their attraction to blood. Science. 333 (6051), 1898-1903 (2011).
  6. Jung, H., Mithal, D. S., Park, J. E., Miller, R. J. Localized CCR2 Activation in the Bone Marrow Niche Mobilizes Monocytes by Desensitizing CXCR4. PloS One. 10 (6), 0128387(2015).
  7. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  8. Donà, E., et al. Directional tissue migration through a self-generated chemokine gradient. Nature. 503 (7475), 285-289 (2013).
  9. Venkiteswaran, G., et al. Generation and dynamics of an endogenous, self-generated signaling gradient across a migrating tissue. Cell. 155 (3), 674-687 (2013).
  10. Minina, S., Reichman-Fried, M., Raz, E. Control of receptor internalization, signaling level, and precise arrival at the target in guided cell migration. Current Biology. 17 (13), 1164-1172 (2007).
  11. Yoo, S. K., et al. The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish. Journal of Cell Science. 125, Pt 23 5702-5710 (2012).
  12. Yoo, S. K., et al. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Developmental Cell. 18 (2), 226-236 (2010).
  13. Buchan, K. D., et al. A transgenic zebrafish line for in vivo visualisation of neutrophil myeloperoxidase. PLoS One. 14 (4), 0215592(2019).
  14. Coombs, C., et al. Chemokine receptor trafficking coordinates neutrophil clustering and dispersal at wounds in zebrafish. Nature Communications. 10 (1), 5166(2019).
  15. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42(2007).
  16. Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  17. Khmelinskii, A., et al. Tandem fluorescent protein timers for in vivo analysis of protein dynamics. Nature Biotechnology. 30 (7), 708-714 (2012).
  18. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2007).
  19. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. (25), 1115(2009).
  20. Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , Elsevier. Burlington. (2004).
  21. Le Guyader, D., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
  22. Chan, T. F., Vese, L. A. Active contours without edges. IEEE Transactions on Image Processing. 10 (2), 266-277 (2001).
  23. Haralick, R. M., Shanmugam, K., Dinstein, I. Textural features for image Classification. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. SMC-3 (6), 610-621 (1973).
  24. Deng, Q., et al. Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish. Journal of Leukocyte Biology. 93 (5), 761-769 (2013).
  25. Torraca, V., Mostowy, S. Zebrafish infection: From pathogenesis to cell biology. Trends in Cell Biology. 28 (2), 143-156 (2018).
  26. Feng, Y., Santoriello, C., Mione, M., Hurlstone, A., Martin, P. Live imaging of innate immune cell sensing of transformed cells in zebrafish larvae: parallels between tumor initiation and wound inflammation. PLoS Biology. 8 (12), 1000562(2010).
  27. Poplimont, H., et al. Neutrophil swarming in damaged tissue is orchestrated by connexins and cooperative calcium alarm signals. Current Biology. 30 (14), 2761-2776.e7 (2020).
  28. Cornet, C., Di Donato, V., Terriente, J. Combining Zebrafish and CRISPR/Cas9: Toward a more efficient drug discovery pipeline. Frontiers in Pharmacology. 9, 703(2018).
  29. Kienle, K., Lämmermann, T. Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response. Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).
  30. Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy. Journal of Visualized Experiments. (95), e52654(2015).

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Spinning Disk Confocale MicroscopieReceptorinternalisatieCXCR1 CXCR2ContrastmetriekVerwonding van de Ventrale VinNeutrofielclustering
Live imaging van chemokinereceptoren bij zebravisneutrofielen tijdens wondreacties
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.