Methodenartikel

Single cell analyse van transcriptioneel actieve allelen door single molecule FISH

DOI:

10.3791/61680

⸱

20 september 2020

 ,  ,  ,  , 
1GCC Center for Advanced Microscopy and Image Informatics, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Cancer Research, Institute of Biosciences and Technology, Texas A&M University, 4Department of Pharmacology and Chemical Biology, Baylor College of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Single molecule RNA fluorescentie in situ hybridisatie (smFISH) is een methode om niveaus en lokalisatie van specifieke RNA's op het niveau van één cel nauwkeurig te kwantificeren. Hier rapporteren we onze gevalideerde laboratoriumprotocollen voor natte-bench verwerking, beeldvorming en beeldanalyse voor eencellige kwantificering van specifieke RNA's.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gentranscriptie is een essentieel proces in de celbiologie en stelt cellen in staat om interne en externe signalen te interpreteren en erop te reageren. Traditionele bulkpopulatiemethoden (Northern blot, PCR en RNAseq) die mRNA-niveaus meten, missen het vermogen om informatie te verstrekken over cel-naar-celvariatie in reacties. Nauwkeurige single cell en allelische visualisatie en kwantificering is mogelijk via single molecule RNA fluorescentie in situ hybridisatie (smFISH). RNA-FISH wordt uitgevoerd door doel-RNA's te hybridiseren met gelabelde oligonucleotidesondes. Deze kunnen worden afgebeeld in modaliteiten met een gemiddelde / hoge doorvoer en bieden, via beeldanalysepijplijnen, kwantitatieve gegevens over zowel volwassen als ontluikende RNA's, allemaal op het niveau van één cel. De fixatie-, permeabilisatie-, hybridisatie- en beeldvormingsstappen zijn gedurende vele jaren in het laboratorium geoptimaliseerd met behulp van het hierin beschreven modelsysteem, wat resulteert in een succesvolle en robuuste eencellige analyse van smFISH-etikettering. Het belangrijkste doel met monstervoorbereiding en -verwerking is om beelden van hoge kwaliteit te produceren die worden gekenmerkt door een hoge signaal-ruisverhouding om valse positieven te verminderen en gegevens te leveren die nauwkeuriger zijn. Hier presenteren we een protocol dat de pijplijn beschrijft van monstervoorbereiding tot gegevensanalyse in combinatie met suggesties en optimalisatiestappen om aan te passen aan specifieke monsters.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gentranscriptie en translatie zijn de twee belangrijkste processen die betrokken zijn bij het centrale dogma van de biologie, gaande van de DNA-sequentie tot RNA tot eiwit1. In deze studie richten we ons op de productie van boodschapper-RNA (mRNA) tijdens transcriptie. Het ontluikende RNA-molecuul omvat zowel niet-coderende introns als coderende exonen. Introns worden co-transcriptioneel uitgesplitst voordat het mRNA in het cytoplasma gaat voor translatie op de ribosomen2,3.

Traditioneel wordt de meting van mRNA uitgevoerd in bulkpopulaties van cellen (honderden tot miljoenen) met klassieke assays zoals RT-qPCR of Northern blotting. Hoewel zeer krachtig, zijn deze methoden beperkt omdat ze geen inzicht geven in cel-tot-celvariatie (fenotypische heterogeniteit), identificatie van het aantal transcriptioneel actieve allelen en, misschien nog belangrijker, gebrek aan ruimtelijke informatie. Meer recent begonnen genoombrede technologieën die RNA-sequencing met één cel (RNAseq) mogelijk maakten, de kloof tussen beeldvormingsmethoden en sequencing te overbruggen4. RNAseq heeft echter last van relatief lage detectie-efficiënties en de verwerkingsstappen resulteren in volledig verlies van ruimtelijke informatie5. Hoewel eencellige RNAseq inzicht kan geven in fenotypische heterogeniteit onder een populatie van isogene cellen, kan RNA-fluorescentie in situ hybridisatie (RNA-FISH) een completere verkenning van doelgenexpressie op ruimtelijk niveau en op een allel-per-allel basis6,7.

RNA FISH is een techniek die de detectie en lokalisatie van doel-RNA-moleculen in vaste cellen mogelijk maakt. In tegenstelling tot eerdere, bewerkelijke methoden, maakt de huidige state-of-the-art RNA-FISH gebruik van commercieel beschikbare nucleïnezuursondes die complementair zijn aan de doel-RNA-sequenties, en deze sondes hybridiseren naar hun doelen door Watson-Crick base pairing8. De vroege in situ hybridisatietechnieken betroffen een soortgelijk protocol dat in 1969 door Gall en Pardue werd vastgesteld, omdat een monster werd verwerkt met nucleïnezuursondes die specifiek hybridiseerden tot een doel-RNA9. Oorspronkelijk werd de test uitgevoerd met behulp van radioactieve of colorimetrische detectie; echter, in de jaren 1980, de ontwikkeling van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) protocollen voor DNA FISH en later RNA FISH opende de weg naar meer gevoelige detectie, en het potentieel voor multiplexing10,11.

Verdere ontwikkelingen in RNA FISH hebben geleid tot het vermogen om enkele RNA-moleculen (smFISH) te detecteren en te kwantificeren12,13. Directe detectie is een methode waarbij de sondes zelf worden gelabeld met fluoroforen. Een uitdaging met smFISH is dat er behoefte is aan voldoende hybridiserende sondes /target om de detectie van fluorescerende signalen als afzonderlijke, diffractie-beperkte plekken te vergemakkelijken. Om dit probleem aan te pakken, kan men een sondeset van korte enkelstrengs DNA-oligonucleotiden gebruiken die complementair zijn aan verschillende regio's van hetdoel-RNA 8,12,14. De binding van meerdere sondes verhoogt de lokale fluorofoordichtheid, waardoor het RNA zichtbaar wordt als een afzonderlijke, hoge intensiteitsvlek door fluorescentiemicroscopie. Deze methode is voordelig omdat off-target binding van oligonucleotiden in de probe set pool kan worden onderscheiden van het echte RNA-spotsignaal door kwantitatief de spotgrootte en -intensiteit te analyseren om onderscheid te maken tussen echt signaal en valse oligonucleotidebinding, waardoor een nauwkeurigere analyse wordt vergemakkelijkt door valse positieven te verminderen12.

Alternatieve methoden om mRNA te detecteren zijn de klassieke BAC-kloon-gebaseerde nick-translatiemethode en het meer recent ontwikkelde vertakte DNA-systeem. In de BAC-gekloonde, nick-translatiemethode wordt het te labelen DNA enzymatisch geknepen en wordt een nieuw nucleotide toegevoegd aan het blootgestelde 3'-uiteinde. De activiteit van DNA-polymerase I voegt een gelabeld nucleotide toe, wat resulteert in de gewenste sonde15,16. De vertakte DNA-techniek omvat oligonucleotide-sondes die in paren hybridiseren naar RNA-doelen en deze sondes worden versterkt met behulp van meerdere signaalversterkingsmoleculen. Deze methode kan de signaal-ruisverhouding aanzienlijk verbeteren, maar de versterking kan de nauwkeurige kwantificering scheeftrekken, omdat fluorescerende vlekken enorm kunnen verschillen in grootte en intensiteit17.

Als een modelsysteem voor dit protocol, dat volledig wordt gebruikt als onderdeel van de niehs Superfund Research Program-deelname om de effecten van hormoonontregelende chemicaliën in Galveston Bay / Houston Ship Channel te kwantificeren, gebruikten we de oestrogeenreceptor (ER) positieve borstkankercellijn MCF-7 die 's nachts werd behandeld met een ER-agonist, 17β-estradiol (E2)7,18,19. E2 reguleert veel ER-doelgenen, waaronder het prototypische ER-doelgen, GREB17,20,21,22. Het hier beschreven smFISH-protocol maakt gebruik van een set van twee spectraal gescheiden sondesets gericht op GREB1; een die hybridiseert naar exonen en de andere naar introns, waardoor zowel volwassen als ontluikend RNA kan wordengemeten 7. Vervolgens gebruiken we epifluorescentiemicroscopie in combinatie met deconvolutie om smFISH-gelabelde monsters in beeld te brengen en passen we vervolgens beeldanalyseroutines toe om het aantal actieve allelen en volwassen RNA's per cel te kwantificeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om optimale resultaten te garanderen, vereist het natte laboratoriumgedeelte van dit protocol standaard RNase-vrije voorzorgsmaatregelen bij alle stappen. Zo wordt het gebruik van gefilterde pipetpunten, steriele vaten en RNase-vrije buffers sterk aangemoedigd. Het gebruik van RNase-remmers zoals vanadyl ribonucleoside-complexen wordt ook voorgesteld, vooral voor doel-RNA's met een lage abundantie.

1. Celcultuur en experimentele opstelling

  1. Onderhoud adherent MCF-7 borstkankercellen (ATCC #HTB-22) in een T75 weefselkweekkolf met fenol-rood vrij (alleen nodig voor hormoonstimulatie-experimenten) Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, 1 nM natriumpyruvaat, 50 I.U./ml penicilline en 50 μg/ml streptomycine.
  2. Plaats zuur-geëtste, poly-D-lysine gecoate ronde coverslips (0,16 tot 0,19 mm dik, 12 mm diameter) in een 24 multiwell weefselkweekplaat.
    OPMERKING: Gebruik 1 M HCl om de coverslips te zuur-etsen en te coaten met een 1 mg / ml oplossing van poly-D-lysine gereconstitueerd in steriel PBS (fosfaat-gebufferde zoutoplossing zonder Ca++ en Mg++) volgens standaardprotocollen.
  3. Verwijder de groeimedia uit de cellen en was eenmaal met 5 ml steriel PBS (fosfaat-gebufferde zoutoplossing zonder Ca++ en Mg++). Maak MCF-7-cellen los met behulp van 2-3 ml Trypsine-EDTA 0,25% oplossing. Zodra de cellen zijn losgemaakt, neutraliseert u de Trypsine-EDTA 0,25% oplossing met een gelijk volume groeimedia.
  4. Breng de cellen in de mediasuspensie over naar een conische buis van 15 ml, draai gedurende 1 minuut met 391 x g naar beneden om de cellen te pelleteren. Verwijder de media voorzichtig uit de conische buis zonder de celkorrel te verstoren en resuspend de cellen in een geschikte hoeveelheid behandelingsmedia.
    OPMERKING: Behandelingsmedia zijn fenol-roodvrije DMEM aangevuld met 5% houtskool-dextran gestript en gedialyseerd FBS, 2 mM L-glutamine, 1 nM natriumpyruvaat, 50 I.U./ml penicilline en 50 μg/ml streptomycine. Deze media is essentieel voor steroïde hormoonstimulatie-experimenten omdat de serumcomponent grotendeels is uitgeput van steroïden door houtskool die de media stript en de groeifactoren via dialyse heeft verminderd.
  5. Zaai de cellen op coverslips in de 24 multiwell-plaat met 60.000 tot 70.000 cellen per put in 500 μL behandelingsmedia. Voor dit experiment moet de celconfluentie ongeveer 70-80% zijn bij aanvang van de behandeling. Optimaliseer de celzaaidichtheid afhankelijk van het celtype, de groeisnelheid en de lengte van het experiment om samenloop te voorkomen, wat beeldanalyse bemoeilijkt.
    OPMERKING: Voor de beste beeldvorming en beeldanalyse, vermijd celklonteren. Meng hiervoor de aliquot van cellen grondig door de cellen een paar keer te pipetteren (of kort te vortexen) voordat ze in de putten terechtkomen. Voordat u de vergulde cellen terug in de incubator plaatst, helpt het laten bezinken van de cellen in de weefselkweekkap gedurende ongeveer 20 minuten om het klonteren van cellen te verminderen.
  6. Incubeer cellen gedurende ten minste twee dagen voorafgaand aan de behandelingen om celcyclussynchronisatie en achtergrondreductie te garanderen als gevolg van signaalmoleculen die achterblijven in het gestripte / gedialyseerde serum van groeimedia.
  7. Behandel NA een incubatie van 48 uur in behandelingsmedia MCF-7-cellen met 10 nM 17β-oestradiol (E2) en voertuigcontrole (DMSO), verdund in behandelingsmedia gedurende 24 uur. Deze behandeling maakt gebruik van een verzadigde dosis E2 om een maximale respons te induceren. Voer tijds- en dosis-responsexperimenten uit om empirisch de voorwaarden voor verschillende doelgenen, celmodellen en type behandelingen te bepalen. Zie als voorbeeld onze recente publicatie7.

2. Voorbereiding van buffers

  1. Om de fixatiebuffer voor te bereiden, verdunde gezuiverde, monomere formaldehyde (verkocht door leveranciers van elektronenmicroscopie als 16% paraformaldehyde) tot 4% in steriel PBS Ca++/ Mg++ (fosfaat-gebufferde zoutoplossing plus Ca++ en Mg++). Voeg vanadyl ribonucleoside complexen (VRC) toe aan de fixatiebuffer voor een eindconcentratie van 2 mM om de afbraak van RNA te vertragen.
    1. Bereken de totale hoeveelheid fixatiebuffer op basis van 300-500 μL fixatief per put van een 24 multiwell-plaat. Bewaar de 4% formaldehyde op ijs totdat het nodig is in de fixatiestap.
      OPMERKING: Maak de fixatiebuffer voor elk experiment nieuw.
      LET OP: Formaldehyde is een teratogeen dat door de huid wordt opgenomen. Gebruik deze chemische stof in een zuurkast samen met geschikte PBM's volgens uw institutionele voorschriften.
  2. Bereid voor de permeabilisatiestap 70% ethanol in nucleasevrij water. Een alternatieve optie is 0,5% Triton-X100 in steriel PBS Ca++/Mg++ plus 2 mM VRC. Bereken de totale hoeveelheid permeabilisatiebuffer die nodig is door 500 μL buffer per put te gebruiken.
  3. Om 9 ml van de hybridisatiebuffer te bereiden, voegt u 2 ml bouillon 50% dextransulfaat en 1 ml 20x SSC (zout natriumcitraat) buffer toe aan 6 ml nucleasevrij water. Vortex om de hybridisatiebuffer grondig te mengen. Deze buffer kan maximaal een week bij 4 °C bewaard worden.
  4. Er zijn vijf afzonderlijke wasstappen die 2x zout natriumcitraat (SSC) buffer vereisen. Bereken het uiteindelijke volume van 2x SSC-buffer dat nodig is door te anticiperen op 500 μL buffer per coverslip per wasstap. Verdun de benodigde hoeveelheid bouillon 20x SSC buffer in nucleasevrij water. 2 mM VRC kan als extra voorzorgsmaatregel worden toegevoegd aan wasstappen. Deze buffer kan bij kamertemperatuur worden bewaard voor de duur van de verwerkingsstappen.

3. Fixatie voor RNA FISH

  1. Verwijder na de behandeling de media uit de putten en was eenmaal met steriele, koude PBS Ca++/ Mg++. Als een celmodel met lage hechting wordt gebruikt, gebruik dan geen vacuüm om vloeistof op te zuigen; gebruik handmatig pipetteren om media voorzichtig van de zijkant van de put te verwijderen en de eerste wasstap weg te laten. Voeg 500 μL fixatiebuffer gedurende 30 minuten toe op ijs.
    OPMERKING: Als het monster gevoelig is voor RNA-degradatie, gebruik dan steriel PBS met 2 mM VRC voor de wasstap op dit punt.
  2. Verwijder fixatief en gooi het in chemisch afval volgens institutionele voorschriften. Was de cellen tweemaal met koud steriel PBS Ca++/ Mg++ gedurende 3 minuten.
  3. Verwijder PBS en voeg 500 μL 70% ethanol toe aan elke put. Sluit de 24 putjesplaat af met een paraffine plastic folie. Plaats op een rotator bij 4 °C gedurende ten minste vier uur. Het is het beste om de monsters een nacht in 70% ethanol te laten zitten. Het protocol kan op dit punt worden gepauzeerd en de monsters kunnen maximaal een week worden bewaard in 70% ethanol.
    OPMERKING: Een 0,5% Triton-X100 in PBS met 2 mM VRC-oplossing kan als alternatief worden gebruikt. Incubeer de monsters in 500 μL van deze permeabilisatiebuffer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur op een rotator. Als u deze permeabilisatiebuffer gebruikt, kan het protocol op dit moment niet worden gepauzeerd en moet het doorgaan met de hybridisatiestap.

4. Hybridisatie voor RNA FISH

  1. Verwijder de permeabilisatiebuffer en was eenmalig in 500 μL 2x SSC-buffer plus 10% formamide gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op een rotator.
  2. Bereid de volledige hybridisatiebuffer voor. Bereken ongeveer 30 μL volledige hybridisatiebuffer per coverslip. Voeg formamide toe aan de hybridisatiebuffer om het benodigde percentage te bereiken. Als bijvoorbeeld 500 μL volledige hybridisatiebuffer nodig is, dan zou deze bestaan uit 450 μL van de eerder gemaakte hybridisatiebuffer plus 50 μL formamide van moleculaire kwaliteit om 10% vol / vol te bereiken. Vortex kort te mengen.
    LET OP: Formamide is een teratogeen dat door de huid wordt opgenomen. Gebruik deze chemische stof in een zuurkast samen met geschikte PBM's volgens de institutionele voorschriften.
  3. Verdun de GREB1 intron (gelabeld met Atto 647N) en GREB1 exon (gelabeld met Quasar 570) sondes 1:300 in hybridisatiebuffer. Meng via pipetteren. Bescherm deze buffer tegen licht en direct te gebruiken.
    OPMERKING: De sondes zijn ontworpen en vervaardigd zoals beschreven in Stossi et al7. De sondes worden meestal geleverd als een gedroogde oligonucleotide sondepool die moet worden gereconstitueerd in RNAse-vrije TE-buffer volgens het protocol van de fabrikant14. De voorraadoplossing voor deze sondes was dus 12,5 μM; de werkconcentratie van de sondes is 42 nM.
  4. Bereid een bevochtigingskamer voor op de nachtelijke hybridisatiestap. Leg een stuk paraffine plastic film, onbelicht met de zijkant naar boven, neer in een glazen petrischaal die is gereinigd met een oppervlakteontsmettingsmiddel om RNases te verwijderen. Verzadig twee papieren handdoeken met steriel water en plaats ze langs de randen van de petrischaal om vocht te bieden, omdat drogen specifieke etikettering kan vernietigen.
  5. Aliquot de sondes door 30 μL sondes in hybridisatiebuffer op de schone kant van de paraffine plastic film te stippelen. Verdeel de aliquots van sondes zodat de coverslips niet met elkaar in contact komen.
  6. Gebruik een gesteriliseerde tang om de coverslips cel voorzichtig naar beneden te draaien op de sondes in de glazen petrischaal. Vermijd luchtbellen en oefen geen druk uit op de coverslips.
    OPMERKING: Gooi de weefselkweekplaat met de 2x SSC-buffer niet weg, omdat dit nodig is voor volgende stappen.
  7. Sluit de glazen petrischaal af met paraffine plastic film en bedek de plaat met folie om blootstelling aan licht aan de fluoroforen te voorkomen. Incubeer 's nachts, tot 16 uur, bij 37 °C op een vlak, niet-roterend oppervlak. De incubatietijd kan empirisch worden gevarieerd, maar een minimum van 4 uur wordt aanbevolen.
    OPMERKING: De coverslips zijn gevoelig voor glijden tijdens het broeden in de hybridisatiebuffer, wat kan leiden tot droge plekken op de coverslip en het monster kan beschadigen.

5. Monsters voorbereiden voor beeldvorming

  1. Verwijder de volgende dag de dekplaten uit de bevochtigingskamer met een tang en breng ze terug naar de 24-putplaat met de celzijde naar boven. Voeg 500 μL verse 2x SSC-buffer plus 10% formamide toe om overtollige sonde en niet-specifieke hybridisatie uit te spoelen.
    OPMERKING: Bescherm de monsters vanaf dit punt tegen licht.
  2. Was de cellen tweemaal met 500 μL 2x SSC-buffer plus 10% formamide gedurende 15 minuten elk bij 37°C op een verwarmde rotator.
  3. Counterstain DNA met DAPI bij 1 μg/ml in 2x SSC-buffer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op een rotator.
  4. Was eenmalig met 2x SSC buffer gedurende 5 minuten op kamertemperatuur.
  5. Monteer de coverslips op glazen platen met behulp van niet-uithardende montagemedia na het verwijderen van overtollige 2x SSC-buffer met een papieren handdoek en een snelle wasbeurt in nucleasevrij water om overtollige zouten te elimineren. Sluit tot slot de coverslips af met doorzichtige nagellak.

6. Hoge resolutie microscopie en beeldverwerking

  1. Stel de monsters voor op een wide-field epifluorescentiemicroscoop met behulp van een 60x of 100x olie objectief en een sCMOS camera. Zie de tabel met materialen voor de specifieke microscoop en het objectief dat voor dit experiment is gebruikt.
    1. Volledige beeldvorming zodra de monsters volledig zijn verwerkt om tijdsafhankelijke degradatie van het signaal te voorkomen.
      OPMERKING: In dit experiment wordt dompelolie met een brekingsindex (RI) van 1,516 gebruikt. Empirische tests moeten worden uitgevoerd om de olie-RI af te stemmen op specifieke monsters, omdat RI-mismatches zullen resulteren in aberraties van de puntspreidingsfunctie die de deconvolutie van het beeld zullen beïnvloeden.
  2. Beelden worden vastgelegd met een laterale pixelgrootte van 0,10827 μm.
  3. Optimaliseer de hoeveelheid verlichting van de lichtbron (d.w.z. procentuele transmissie) en belichtingstijden voor elk kanaal (DAPI-, TRITC-, CY5-filters in dit specifieke voorbeeld) met behulp van het monster dat naar verwachting de hoogste intensiteit heeft (d.w.z. positieve controles). In dit experiment wordt verwacht dat het met E2 behandelde monster een hogere intensiteit zal hebben voor beide GREB1-sondesets. Over het algemeen is het percentage transmissie voor GREB1 intron- en exon-sondes 50 - 100% en de belichtingstijden variëren van 0,25 - 0,60 seconden.
  4. Verkrijg bovendien afbeeldingen onder omstandigheden die fotobleeken en / of verzadiging van camerapixels voorkomen. In onze ervaring zou er een minimaal ~ tienvoudig verschil moeten zijn tussen de achtergrond en de signaalintensiteit. Verzadiging van enkele pixels/veld kan optreden als gevolg van niet-specifieke signalen in het monster (d.w.z. vuil op de coverslip, sondeaggregaten buiten de cel), wat aanvaardbaar kan zijn, maar alleen als verzadigde gebieden niet zijn opgenomen in de kwantificering.
  5. Als u de acquisitie van een z-stack wilt instellen, richt u zich op het monster in het DAPI-kanaal. Selecteer de boven- en onderkant van de z-stack op de afstanden waar de DAPI-gekleurde kernen onscherp worden. De z-stack stapgrootte die we gebruikten is 0,25 μm per plak en de totale z-stack moet de hele cel overspannen (ongeveer 10 μm in MCF-7-cellen). De z-stack stapgrootte verandert echter afhankelijk van het gebruikte doel en moet voldoen aan het Nyquist-bemonsteringscriterium.
    OPMERKING: Introns zijn meestal alleen aanwezig in de kern; exonen bevinden zich echter zowel in de kern als in het cytoplasma. Daarom zal het instellen van de z-stack zoals hierboven beschreven het grootste deel van de intron- en exon-labeling vastleggen, aangezien de z-stack de hele cel omvat.
  6. Stel meestal minimaal 200 cellen af voor kwantitatieve analyse in voorlopige experimenten om een momentopname te maken van de omvang van de respons en variatie tussen cellen.
  7. Sommige afgebeelde cellen worden uitgesloten van de uiteindelijke analyse (d.w.z. uitvalpercentage) omdat ze worden gefilterd door de analysepijplijn (d.w.z. cellen die de rand van het beeld raken, apoptotische / mitotische cellen).
    OPMERKING: Bij het selecteren van afbeeldingsgebieden zijn er een paar factoren waarmee u rekening moet houden. Kies gebieden met gelijkmatig verdeelde, niet-overlappende cellen zoals gedefinieerd door DAPI-gelabelde, nucleaire fluorescentie. Probeer bovendien gebieden te selecteren met het minste aantal kernen langs de randen van het afbeeldingsgebied om te voorkomen dat gedeeltelijke cellen worden geteld. Geautomatiseerde, onbevooroordeelde beeldvorming heeft altijd de voorkeur voor experimenten die statistische analyse vereisen.
  8. Na acquisitie deconvolve beelden met behulp van een agressief restauratief algoritme met behulp van 10 cycli (d.w.z. aantal iteraties). Genereer projecties met maximale intensiteit voor beeldanalyse (laat deze stap weg als specifieke 3D-analyse vereist is). Sla alle projectiebeelden op volgens de bitdiepte van de gebruikte camera; in ons geval werden 16-bits TIFF-grijswaardenafbeeldingen opgeslagen. RGB-afbeeldingen hebben een verminderde bitdiepte, wat resulteert in een verlies van informatie; daarom zijn RGB-beelden niet geschikt voor beeldanalyse.

7. Beeldanalyse

  1. Lees de instructies en download de jupyter notebook van github (https://github.com/pankajmath/RNA_FISH_analysis).
  2. Installeer Python anaconda distribution (https://www.anaconda.com/distribution/) versie 3.6 of hoger.
  3. Open de anaconda-prompt en typ de installatieopdracht om Simple ITK voor anaconda te installeren (https://anaconda.org/SimpleITK/simpleitk).
  4. Open anaconda navigator en start jupyter notebook. Het opent een webbrowser met mappen en bestanden. Blader door de mapstructuren om de map te bereiken die de gedownloade jupyter notebook van github bevat.
  5. Open het notitieblok en voer elke cel uit door tegelijkertijd op Shift en Enter te drukken.
  6. Volg de details van elke functie en stap in het notitieblok. Voor een andere set afbeeldingen moet men mogelijk enkele parameterwaarden wijzigen.
    OPMERKING: In het kort worden kernen gesegmenteerd vanuit het DAPI-kanaal met behulp van lokale drempels met een blokgrootte van 251 pixels, gaten zijn opgevuld en objecten kleiner dan 100 pixels verwijderd. Aanrakende kernen werden gesplitst met behulp van een stroomgebiedalgoritme. Het nucleaire masker werd vervolgens met 100 pixels verwijd en waterscheiding werd gebruikt om aanrakende objecten te scheiden met behulp van kernen als bassins. Om steady state RNA (exonen) te identificeren, werd Otsu thresholding gebruikt; voor transcriptionele actieve allelen (intron) werd eerst een Gaussiaanse vervaging (sigma=1) toegepast en vervolgens werd maximale entropiedrempeling gebruikt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om hormonale reacties via smFISH te analyseren, kozen we bijvoorbeeld voor het oestrogeenreceptor (ER) -model dat wordt gebruikt in high throughput-testen om de aanwezigheid van hormoonontregelende chemicaliën bij milieurampen te bepalen in de context van deelname aan het NIEHS Superfund Research Program7. In dit experiment werden adherente MCF-7 borstkankercellen gedurende 24 uur behandeld met de ER-agonist 17β-oestradiol (E2, 10 nM) of voertuig (DMSO). Spectraal gescheiden sondesets tegen GREB1 ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De beschreven smFISH-methodologie is gebaseerd op eerder gepubliceerde protocollen7,12,14. In dit protocol leggen we de kritieke stappen uit die zijn geoptimaliseerd van het natte laboratorium (inclusief zaaidichtheid, fixatietijd, permeabilisatie en sondeconcentratie), tot beeldvorming en beeldanalyse, waardoor een volledige experimentele pijplijn wordt geboden voor laboratoria die geïnteresseerd zijn in het uitvoeren van eence...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MAM, FS en MGM worden gefinancierd door NIEHS (Project 4, P42ES027704, PI, Rusyn). MAM, FS, RMM, MGM en PKS worden ondersteund door het door CPRIT gefinancierde GCC Center for Advanced Microscopy and Image Informatics (RP170719). Beeldvorming wordt ook ondersteund door de Integrated Microscopy Core aan het Baylor College of Medicine met financiering van NIH (DK56338 en CA125123), CPRIT (RP150578), het Dan L. Duncan Comprehensive Cancer Center en het John S. Dunn Gulf Coast Consortium for Chemical Genomics.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
17β EstradiolSigma-AldrichE2257CAS Number 50-28-2
Ambion SSC (20X) Buffer, Rnase-freeThermoFisher ScientificAM9770
Corning DMEM met L-Glutamine en 4,5 g/L GlucoseFisher ScientificMT10017CVGemaakt door Invitrogen
DAPISigma-AldrichD8417Zonder natriumpyruvaat
Dextran Sulfaat, 50% Oplossing SterielSigma-Aldrich3730-100ML
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Ca++/Mg++Corning21030CVGemaakt door Calbiochem
Ethanol, 200 Proof (100%)Fisher Scientific07-678-005
Falcon 24-Well Clear Flat Bottom TC-behandelde Multiwell Cel Cultuur PlaatCorning353047Gemaakt door Decon Laboratories
Fetaal Rundserum (FBS), 500 mLFisher Scientific50-753-2978Gemaakt door Gemini Bio Products
GE Healthcare DeltaVision LIVE Hoge Resolutie Deconvolutie MicroscoopGE Healthcare
Hyclone Water, Moleculaire Biologie KwaliteitFisher ScientificSH3053802
Immersie Olie 1.516GE Healthcare Life Sciences29162940Gemaakt door GE Healthcare Bio-Science
L-glutamine OplossingFisher ScientificMT25005ClGemaakt door Corning
MCF-7 cellenATCCHTB-22
Moleculaire Kwaliteit FormamidePromegaPAH5051
Olympus 60x/1.42 NA ObjectiefOlympus
ParafilmBemis Company, Inc.52858-076Verdeeld door VWR
Paraformaldehyde, 16% Oplossing, EM KwaliteitElectron Microscopy Sciences15710
Penicilline-Streptomycine OplossingFisher ScientificMT3001ClGemaakt door Corning
Ribonucleoside Vanadyl ComplexVWR101229-716Gemaakt door New England Biosciences
RNase AwayAmbion9780
Natriumpyruvaat, 100 mMFisher Scientific11-360-070Gemaakt door Gibco
Thermo Scientific Glas Dekglasjes, #1.5Fisher Scientific12-545-81P
Triton X-100, 100 mLFisher ScientificBP151-100Gemaakt door Fisher BioReagents
Trypsine-EDTA Oplossing 0,25%Sigma-AldrichT4049-500ML
Vectashield Antifade Montage Medium 10 mLFisher ScientificNC9265087Gemaakt door Vector Laboratories

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Russell, P. J. Gene Expression: Transcription. iGenetics: A Mendelian Approach. , Pearson Education, Inc. 331-352 (2006).
  2. Darnell, J. E. Variety in the level of gene control in eukaryotic cells. Nature. 297, 365-371 (1982).
  3. Köhler, A., Hurt, E. Exporting RNA from the nucleus to the cytoplasm. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 761-773 (2007).
  4. Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C., Teichmann, S. A. The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing. Molecular Cell. 58, 610-620 (2015).
  5. Shah, S., Lubeck, E., Zhou, W., Cai, L. In situ Transcription Profiling of Single Cells Reveals Spatial Organization of Cells in the Mouse Hippocampus. Neuron. 92, 342-357 (2016).
  6. Halpern, K. B., et al. Bursty Gene Expression in the Intact Mammalian Liver. Molecular Cell. 58, 147-156 (2015).
  7. Stossi, F., et al. Estrogen-induced transcription at individual alleles is independent of receptor level and active conformation but can be modulated by coactivators activity. Nucleic Acids Research. 48, 1800-1810 (2020).
  8. Coassin, S. R., Orjalo, A. V., Semaan, S. J., Johansson, H. E. Simultaneous Detection of Nuclear and Cytoplasmic RNA Variants Utilizing Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization in Adherent Cells. Methods in Molecular Biology. 1211, 189-199 (2014).
  9. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 63, 378-383 (1969).
  10. Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van Duijn, P. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochrome labelled RNA. Experimental Cell Research. 128, 485-490 (1980).
  11. Singer, R. H., Ward, D. C. Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with biotinated nucleotide analog. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 79, 7331-7335 (1982).
  12. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
  13. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5, 877-879 (2008).
  14. Orjalo, A. V., Johansson, H. E. Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization for the Simultaneous Detection of Immature and Mature Long Noncoding RNAs in Adherent Cells. Methods in Molecular Biology. 1402, 119-134 (2016).
  15. Johnson, C. V., Singer, R. H., Lawrence, J. B. Chapter 3 Fluorescent Detection of Nuclear RNA and DNA: Implications for Genome Organization. Methods in Cell Biology. 35, 73-99 (1991).
  16. Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: Past, present and future. Journal of Cell Science. 116, 2833-2838 (2003).
  17. Wang, F., et al. RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
  18. Stossi, F., et al. Defining estrogenic mechanisms of bisphenol A analogs through high throughput microscopy-based contextual assays. Chemistry and Biology. 21, 743-753 (2014).
  19. Szafran, A. T., Stossi, F., Mancini, M. G., Walker, C. L., Mancini, M. A. Characterizing properties of non-estrogenic substituted bisphenol analogs using high throughput microscopy and image analysis. PLoS One. 12, 1-19 (2017).
  20. Rae, J. M., et al. GREB1 is a critical regulator of hormone dependent breast cancer growth. Breast Cancer Research and Treatment. 92, 141-149 (2005).
  21. Heldring, N., et al. Estrogen receptors: How do they signal and what are their targets. Physiological Reviews. 87, 905-931 (2007).
  22. Hah, N., et al. A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells. Cell. 145, 622-634 (2011).
  23. Kadam, P., Bhalerao, S. Sample size calculation. International Journal of Ayurveda Research. 1, 55-57 (2010).
  24. Kocanova, S., et al. Activation of estrogen-responsive genes does not require their nuclear co-localization. PLoS Genetics. 6, (2010).
  25. Shaffer, S. M., Wu, M. T., Levesque, M. J., Raj, A. Turbo FISH: A Method for Rapid Single Molecule RNA FISH. PLoS One. 8, (2013).
  26. Kim, S. O., Kim, J., Okajima, T., Cho, N. J. Mechanical properties of paraformaldehyde-treated individual cells investigated by atomic force microscopy and scanning ion conductance microscopy. Nano Convergence. 4, (2017).
  27. Shieh, T. M., et al. Application of ribonucleoside vanadyl complex (RVC) for developing a multifunctional tissue preservative solution. PLoS One. 13, 1-14 (2018).
  28. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).
  29. Vinegoni, C., Feruglio, P. F., Weissleder, R. High dynamic range fluorescence imaging. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25, (2019).
  30. Tam, R., Shopland, L. S., Johnson, C. V., McNeil, J. A., Lawrence, J. B. Application of RNA FISH for visualizing gene expression and nuclear architecture. FISH: A Practical Approach. , 93-117 (2002).
  31. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. , (2020).
  32. Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nature Protocols. 7, 408-419 (2012).
  33. Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Reports. 46, 65-72 (2013).
  34. Sibarita, J. B. Deconvolution microscopy. Advcances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 201-243 (2005).
  35. Takei, Y., Shah, S., Harvey, S., Qi, L. S., Cai, L. Multiplexed Dynamic Imaging of Genomic Loci by Combined CRISPR Imaging and DNA Sequential FISH. Biophysical Journal. 112, 1773-1776 (2017).
  36. Moffitt, J. R., Zhuang, X. RNA Imaging with Multiplexed Error-Robust Fluorescence in situ Hybridization (MERFISH). Methods in Enzymology. 572, 1-49 (2016).
  37. Shah, S., et al. Dynamics and Spatial Genomics of the Nascent Transcriptome by Intron seqFISH. Cell. 174, 363-376 (2018).
  38. Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification. Scientific Reports. 9, 1-13 (2019).
  39. Lubeck, E., Coskun, A. F., Zhiyentayev, T., Ahmad, M., Cai, L. Single-cell in situ RNA profiling by sequential hybridization. Nature Methods. 11, 360-361 (2014).
  40. Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8, (2018).
  41. Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16, 33-41 (2019).
  42. Zimmerman, S. G., Peters, N. C., Altaras, A. E., Berg, C. A. Optimized RNA ISH, RNA FISH and protein-RNA double labeling (IF/FISH) in Drosophila ovaries. Nature Protocols. 8, 2158-2179 (2013).
  43. Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59, 209-221 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

RNA fluorescentie in situ hybridisatieGREB1 intron exon sondesbehandeling met oestrogeenreceptoragonistwidefield epifluorescentiemicroscopieimage analysis pipelineDAPI tegenkleuringspoeling met nucleasevrij water

Gerelateerde artikelen