Visualisatie van replisoomontmoetingen met een antigeen gelabelde blokkerende laesie

Samenvatting

Hoewel replicatievorkbotsingen met DNA-adducten dubbele strengsbreuken kunnen veroorzaken, is er minder bekend over de interactie tussen replisomen en blokkerende laesies. We hebben de proximity ligation assay gebruikt om deze ontmoetingen te visualiseren en de gevolgen voor de replisoomsamenstelling te karakteriseren.

Samenvatting

Er is veel inzicht aanwezig in de cellulaire respons op dubbelstrengsbreuken (DSB's), geïnduceerd door nucleasen, straling en andere DNA-brekers. Voor een deel weerspiegelt dit de beschikbaarheid van methoden voor de identificatie van pauzeplaatsen en de karakterisering van factoren die bij die sequenties voor DSB's zijn gerekruteerd. DSB's verschijnen echter ook als tussenproducten tijdens de verwerking van DNA-adducten gevormd door verbindingen die niet direct breuken veroorzaken en niet reageren op specifieke sequentieplaatsen. Bijgevolg zijn voor de meeste van deze middelen technologieën die de analyse van bindingsinteracties met responsfactoren en reparatie-eiwitten mogelijk maken, onbekend. DNA interstrand crosslinks (ICL's) kunnen bijvoorbeeld breuken veroorzaken na replicatievorkontmoetingen. Hoewel gevormd door geneesmiddelen die veel worden gebruikt als kankerchemotherapeutica, is er geen methodologie voor het monitoren van hun interacties met replicatie-eiwitten.

Hier beschrijven we onze strategie voor het volgen van de cellulaire reactie op vorkbotsingen met deze uitdagende adducten. We koppelden een steroïde antigeen aan psoraleen, dat fotoactivatieafhankelijke ICL's vormt in kernen van levende cellen. De ICL's werden gevisualiseerd door immunofluorescentie tegen de antigeentag. De tag kan ook een partner zijn in de Proximity Ligation Assay (PLA) die de nauwe associatie van twee antigenen rapporteert. De PLA werd gebruikt om eiwitten te onderscheiden die nauw verbonden waren met de gelabelde ICL's en eiwitten die dat niet waren. Het was mogelijk om replisoomeiwitten te definiëren die werden behouden na ontmoetingen met ICL's en andere te identificeren die verloren waren gegaan. Deze aanpak is van toepassing op elke structuur of DNA-adduct dat immunologisch kan worden gedetecteerd.

Inleiding

De cellulaire respons op dubbelstrengsbreuken is goed gedocumenteerd dankzij een opeenvolging van steeds krachtigere methoden om breuken naar specifieke genomische locaties te leiden ^1,2,3. De zekerheid van locatie maakt een eenduidige karakterisering mogelijk van eiwitten en andere factoren die zich op de locatie ophopen en deelnemen aan de DNA Damage Response (DDR), waardoor de niet-homologe eindverbindingsroutes (NHEJ) en homologe recombinatie (HR) worden aangedreven die breuken repareren. Natuurlijk worden veel pauzes geïntroduceerd door middelen zoals straling en chemische soorten die specifieke sequenties niet aanvallen⁴. Hiervoor zijn er echter procedures beschikbaar die de uiteinden kunnen omzetten in structuren die geschikt zijn voor tagging en lokalisatie ^5,6. Onderbrekingen worden ook geïntroduceerd door biologische processen, zoals immunoglobuline-herschikking, en recente technologie maakt hun lokalisatie mogelijk, evenals⁷. De relatie tussen responsieve factoren en die sites kan dan worden bepaald.

Breuken verschijnen ook als een indirect gevolg van adducten gevormd door verbindingen die geen inherente brekers zijn, maar DNA-transacties zoals transcriptie en replicatie verstoren. Ze kunnen worden gevormd als een kenmerk van de cellulaire reactie op deze obstructies, misschien tijdens reparatie of omdat ze een structuur veroorzaken die kwetsbaar is voor nuclease-aanval. Meestal is de fysieke relatie tussen het adduct, de breuk en de associatie met reagerende factoren inferentieel. ICL's worden bijvoorbeeld gevormd door chemotherapeutica zoals cisplatine en Mitomycine C⁸ en als reactieproduct van abasisch sites⁹. ICL's staan bekend als krachtige blokken voor replicatievorken¹⁰, waardoor vorken worden geblokkeerd die kunnen worden gesplitst door nucleasen¹¹. De covalente koppeling tussen strengen wordt vaak verlicht door paden met obligate breuken als tussenproducten 12,13^, waardoor homologe recombinatie nodig is om de replicatievork¹⁴ opnieuw op te bouwen. In de meeste experimenten volgt de onderzoeker de reactie van factoren die van belang zijn op de breuken die worden gevormd stroomafwaarts van de botsing van een replicatievork met een ICL. Omdat er echter geen technologie is geweest voor de lokalisatie van een provocerende laesie, kan de nabijheid van het replisoom en zijn samenstellende delen tot de ICL alleen worden aangenomen.

We hebben een strategie ontwikkeld om de analyse van eiwitassociaties met niet-sequentiespecifieke covalente adducten mogelijk te maken, hier geïllustreerd door ICL's. In ons systeem worden deze geïntroduceerd door psoraleen, een fotoactief natuurproduct dat al duizenden jaren wordt gebruikt als therapeutisch middel voor huidaandoeningen¹⁵. Onze aanpak is gebaseerd op twee belangrijke kenmerken van psoralenen. De eerste is hun hoge frequentie van crosslinkvorming, die 90% van de adducten kan overschrijden, in tegenstelling tot de minder dan 10% gevormd door populaire verbindingen zoals cisplatine of Mitomycine C ^8,16. De tweede is de toegankelijkheid van de verbinding tot conjugatie zonder verlies van crosslinking-capaciteit. We hebben trimethyl psoraleen covalent gekoppeld aan Digoxigenin (Dig), een lang gevestigde immunotag. Dit maakt detectie van de psoraleenadducten in genomisch DNA mogelijk door immunostaining van de Dig-tag en visualisatie door conventionele immunofluorescentie¹⁷.

Dit reagens werd in ons vorige werk toegepast op de analyse van replicatievorkontmoetingen met ICL's met behulp van een op DNA-vezels gebaseerde test¹⁶. In dat werk ontdekten we dat replicatie verder kon gaan dan een intacte ICL. Dit was afhankelijk van het ATR-kinase, dat wordt geactiveerd door replicatiestress. De herstart van de replicatie was onverwacht gezien de structuur van de CMG-replicatieve helicase. Dit bestaat uit de MCM hetero-hexamer (M) die een offset gapped ring vormt rond de sjabloonstreng voor leidende strengsynthese die wordt vergrendeld door de eiwitten van het GINS-complex (G, bestaande uit PSF1, 2, 3 en SLD5) en CDC45 (C)¹⁸. Het voorstel dat replicatie opnieuw kon starten aan de kant van de ICL-distale naar de kant van de replisoombotsing pleitte voor een verandering in de structuur van het replisoom. Om de vraag te beantwoorden welke componenten zich in het replisoom bevonden op het moment van de ontmoeting met een ICL hebben we de hier beschreven aanpak ontwikkeld. We gebruikten de Dig-tag als partner in Proximity Ligation Assays (PLA)¹⁹ om de nauwe associatie van de ICL met eiwitten van het replisoom²⁰ te onderzoeken.

Protocol

1. Celvoorbereiding

1. Dag 1
   1. Voorbehandel kweekschalen met glazen bodem van 35 mm met een celkleefoplossing.
   2. Plaatcellen in de voorbehandelde schotels een dag voor de behandeling. Cel moet actief delen en 50-70% confluent zijn op de dag van het experiment.
      OPMERKING: HeLa-cellen werden in dit experiment gebruikt met Dulbecco Modified Eagle Medium DMEM, aangevuld met 10% foetaal runderserum, 1x penicilline / streptomycine. Er is geen beperking voor aanhangende cellijnen. Niet-hechtende cellen moeten echter op dia's worden gecentrifugeerd en voorafgaand aan de analyse door PLA worden gefixeerd.
2. Dag 2
   1. Bereid een stamoplossing van Digoxigenin Trimethyl psoralen (Dig-TMP) door een bevroren aliquot van eerder gesynthetiseerd Dig-TMP opnieuw te suspenderen in 1:1 EtOH:H2 O. Bepaal de concentratie door OD te meten bij 250 nm van een 100x verdunning (in H₂O) van het opgeloste Dig-TMP. De extinctiecoëfficiënt van Dig-TMP is 25.000. Controleer de concentratie door vóór elk gebruik OD bij 250 nm te meten en bereken de voorraadconcentratie: Abs x 100 x 10⁶/25.000 = Concentratie (in μM). Over het algemeen is de voorraadoplossing ongeveer 3 mM. De oplossing kan ongeveer een maand bij –20 °C worden bewaard.
      OPMERKING: Dig-TMP moet van tevoren chemisch worden gesynthetiseerd, volgens de hier beschreven procedure. Reflux 4'-chloormethyl-4,5',8-trimethylpsoraleen met 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanedi-amine in tolueen onder stikstof gedurende 12 uur. Verwijder het oplosmiddel en recupereer het 4'-[N-(13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminomethyl-4,5',8-trimethylpsoraleenproduct door middel van silicagelchromatografie. Conjuteert het product aan digoxigenine NHS-ester in dimethylformamide en triethylamine bij 50 °C gedurende 18 uur. Verwijder het oplosmiddel en zuiver het residu door preparatieve dunne laag silicagelchromatografie. Elueer de productband chloroform: methanol: 28% ammoniumhydroxide (8:1:0.1) mengsel. Verdamp de oplosmiddelen en los de pellet op in 50% EtOH:H₂O.
   2. Voeg Dig-TMP-bouillon in 50% EtOH:H₂O toe aan het celkweekmedium tot een eindconcentratie van 5 μM. Breng het medium op 37 °C. Zuig het medium uit de platen, voeg de voorverwarmde Dig-TMP bevattende media toe en plaats de platen gedurende 30 minuten in een incubator (37 °C, 5% CO₂) om de Dig-TMP in evenwicht te brengen.
   3. Terwijl de cellen aan het broeden zijn, verwarmt u de UV-box (zie materiaaltabel) voor tot 37 °C.
   4. Plaats de platen in de voorverwarmde UV-doos en stel de cellen bloot aan een dosis van 3 J/cm² UVA-licht gedurende 5 minuten voor dit experiment. De platen werden bovenop een thermoblok geplaatst dat tijdens de bestraling op 37 °C werd gehouden. Bereken de tijd met behulp van de formule:
      
   5. Zuig het medium op met behulp van een pipet, voeg vers voorverwarmd medium toe en plaats de platen terug in de incubator bij 37 °C, 5% CO₂ gedurende 1 uur.
   6. Verwijder media en was de afwas eenmaal voorzichtig met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
   7. Verwijder PBS en voeg 0,1% formaldehyde (FA) toe in PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). Dit voorkomt celloslating tijdens CSK-R (cytoskeletextractiebuffer met RNase, beschreven in 1.2.9.) voorbehandeling die nodig is om de cytoplasmatische elementen te extraheren en de PLA-achtergrond te verminderen.
   8. Zuig FA af en was één keer met PBS.
   9. Voeg CSK-R buffer toe en incubeer gedurende 5 minuten bij RT om cytoplasma te verwijderen [CSK-R buffer: 10 mM PIPES, pH 7.0, 100 mM NaCl, 300 mM sucrose, 3 mM MgCl₂, 0.5%Triton X-100, 300 μg/ml RNase A]. Zuig de buffer op, voeg verse CSK-R toe en incubeer gedurende 5 minuten bij RT.
      OPMERKING: Een voorraad CSK-buffer kan worden opgeslagen bij 4 °C en Triton X en RNaseA kunnen direct voor gebruik worden toegevoegd.
   10. Was driemaal met PBS.
   11. Fixeer cellen met 4% formaldehyde in PBS gedurende 10 minuten bij RT.
   12. Was cellen met PBS. Voer deze stap drie keer uit.
   13. Voeg koude 100% methanol toe en incubeer gedurende 20 minuten bij -20 °C.
   14. Was cellen driemaal met PBS. Op dit punt kunnen cellen in PBS worden opgeslagen in een vochtige kamer bij 4 °C gedurende maximaal een week.
   15. Incubeer cellen in 80 μL van 5 mM TritonX-100 gedurende 10 minuten bij 4 °C.
   16. Incubeer cellen met 100 μL van 5 mM EDTA in PBS aangevuld met 1 μL van 100 mg/ml RNase A gedurende 30 minuten bij 37 °C.
   17. Was cellen driemaal met PBS.
   18. Bewaar cellen in blokkerende buffer (5% BSA en 10% geitenserum in PBS) in een vochtige kamer 's nachts bij 4 °C.

2. Nabijheidsligatietest

OPMERKING: Voer de nabijheidsligatietest uit op dag 3.

1. Antilichaamkleuring
   1. Bereid 40 μL van de primaire antilichaamoplossing per plaat voor: Voeg het juiste volume primaire antilichamen toe om de gewenste verdunning te bereiken (muisantidigoxigenine en konijnenantilichaam tegen een replisoomcomponent zoals MCM5, CDC45, PSF1 of pMCM2, verdunningen gespecificeerd in de materiaaltabel) in de blokkeringsbuffer (om een eindvolume van 24 μl te bereiken). Mix door te tikken en laat het 20 minuten staan bij RT. Bereid een mastermix voor meerdere monsters en mix door te tikken voordat je het op de putten aanbrengt.
   2. Voeg 40 μL primaire antilichaamoplossing toe aan het midden van de put en incubeer gedurende 1 uur in een vochtige kamer bij 37 °C. Laat tijdens het kleuren de PLA-sondes en de blokkerende buffer opwarmen tot kamertemperatuur.
   3. Was cellen met PBS-T [PBS-T: 0,05% Tween-20 in 1X PBS] bij RT. Voer deze stap drie keer uit.
   4. Bereid tijdens het wassen 40 μL PLA-sondeoplossing per schaal voor (PLA-sondes bestaan uit een secundair antilichaam dat IgG van konijn of muis herkent, covalent gekoppeld aan een PLUS- of MIN-oligonucleotide): 8 μL PLA-sonde antimuis-PLUS + 8 μL PLA-sonde antikonijn-MINUS-antilichaam + 24 μL blokkeringsbuffer. Meng en laat het 20 minuten staan bij RT. Bereid een mastermix voor meerdere monsters en meng goed voordat je het op de putten aanbrengt. Plaats de oplossing in het midden van de put in de plaat.
   5. Verwijder de laatste was, voeg 40 μL PLA-sondeoplossing toe aan het midden van de put en incubeer gedurende 1 uur in een vochtige kamer bij 37 °C.
   6. Was in buffer A driemaal, gedurende 10 minuten elk, op een kantelbaar platform bij RT. Breng tijdens het wassen het ligatiemengsel naar RT.
2. Ligatie en amplificatie
   1. Bereid 40 μL ligatiemengsel per plaat: 8 μL (5x) ligatiebouillon + 31 μL gedestilleerd water + 1 μL ligase. Bereid mastermix voor meerdere platen en meng goed voordat u het op de putten aanbrengt.
   2. Voeg 40 μL ligatieoplossing toe aan elke plaat en incubeer gedurende 30 minuten in een vochtige kamer bij 37 °C.
   3. Was cellen 3x met buffer A, elk gedurende 2 min, op een kantelplatform bij RT.
   4. Bereid 40 μL amplificatieoplossing per schaal: 8 μL (5x) amplificatievoorraad + 31,5 μL gedestilleerd water + 0,5 μL DNA Polymerase. Bereid een mastermix voor meerdere monsters en meng goed voordat u deze op de putten aanbrengt.
   5. Voeg 40 μL amplificatieoplossing toe aan elke plaat en incubeer gedurende 100 minuten in een vochtige kamer bij 37 °C.
   6. Zuig de versterkingsoplossing af en was met buffer B. Voer 6 wasbeurten uit gedurende elk 10 minuten, op een kantelplatform bij RT.
   7. Was één keer met 0,01x buffer B gedurende 1 min bij RT.
   8. Aspireerbuffer B en incubeer platen met secundaire antilichamen, Alexa Fluor 488 antimuis IgG en Alexa Fluor 568 anti-konijn IgG in blokkerende oplossing bij geschikte verdunningen in blokkerende buffer, in een vochtige kamer, gedurende 30 minuten bij 37 °C of 's nachts bij 4 °C.
   9. Was cellen drie keer met PBS-T, gedurende 10 minuten elk op een kantelplatform bij RT.
   10. Zuig PBS-T aan en monteer in montagemedium met DAPI. De gemonteerde platen kunnen onmiddellijk worden afgebeeld of bij 4 °C in het donker worden bewaard gedurende niet langer dan 4 dagen voordat ze worden afgebeeld.

3. Beeldvorming en kwantificering

1. Voer beeldvorming uit in een epifluorescente of confocale microscoop (als 3D-beeldvorming wenselijk is, bedek dan ten minste 3 μm in 15 stapels). Voer experimenten uit in drievoud en breng voldoende velden in beeld om ten minste 100 waarnemingen per monster of toestand te doen. Bekijk alle velden en voorbeelden, inclusief besturingselementen, met dezelfde belichtingsinstellingen.
2. Kwantificeren met een geschikte beeldanalysesoftware (zie Materiaaltabel voor open source en commerciële software die deze analyse kan uitvoeren in enkele of meerdere vlakbeelden).
   1. Segmenteer celkernen op basis van de DAPI-kleuring. Voer detectie uit van nucleaire PLA-stippen. Wijs PLA-stippen toe aan hun overeenkomstige kern. Exporteer PLA-punten per kernresultaten als een csv-bestand (zie Aanvullend Bestand 1 en Aanvullend Bestand 2).
3. Statistische analyse (zie Materiaaltabel voor voorgestelde open source en commerciële software).
   1. Controleer of de monsters een normale verdeling volgen met een Shapiro-Wilk-test.
   2. Bepaal of er een significant verschil is tussen twee steekproeven met behulp van een Student-t-test (als aan de normale verdelingsaanname is voldaan) of een Wilcoxon-Rank Sum-test (als de normale verdelingsaanname voor een steekproef wordt geschonden).
4. Datavisualisatie: Genereer dot plots in combinatie met box plots om datadistributie, mediaan (Q₂), 25^th (Q₁) en 75^e percentiel voor de verschillende samples te visualiseren (zie Table of Materials voor voorgestelde open source en commerciële software).

4.3D weergave van pMCM2: ICL-interacties

1. Afbeelding PLA platen op een draaiende schijf confocale microscoop, met behulp van een Plan Fluor 60x/1.25 numerieke diafragma olie objectief. Schaf 16 stapels van 1,6 mm aan en genereer de 3D-reconstructie met de juiste beeldanalysesoftware (zie materiaaltabel).

Resultaten

PLA van Dig-TMP met replisome eiwitten
De structuur van de Dig-TMP is weergegeven in figuur 1. De details van de synthese, waarbij trimethylpsoraleen via een glycollinker werd geconjugeerd aan digoxigenine, zijn eerder besproken^17,21. Incubatie van cellen met de verbinding gevolgd door blootstelling aan 365 nm licht (UVA) fotoactiveert de verbinding en drijft de crosslinkingreactie aan. Iets meer dan 90% van de ad...

Discussie

Hoewel de PLA een zeer krachtige techniek is, zijn er technische problemen die moeten worden opgelost om duidelijke en reproduceerbare resultaten te verkrijgen. De antilichamen moeten een hoge affiniteit en specificiteit hebben. Verder is het belangrijk om de niet-specifieke achtergrondsignalen zoveel mogelijk te beperken. We hebben ontdekt dat membranen en cellulair puin bijdragen aan de achtergrond en we hebben ze zoveel mogelijk verwijderd. De wasbeurten met wasmiddel met buffers voorafgaand aan het fixeren en de was ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Alexa Fluor 568, Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody	Invitrogen	A-10011	1 in 1000
35 mm plates with glass 1.5 coverslip	MatTek	P35-1.5-14-C	Glass Bottom Microwell Dishes 35mm Petri Dish Microwell
Alexa Fluor 488,Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody	Invitrogen	A-10001	1 in 1000
Bovine serum albumin (BSA)	SeraCare	1900-0012	Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C
CDC45 antibody (rabbit)	Abcam	ab126762	1 in 200
Cell adhesive	Life Science	354240	for cell-TAK solution
Confocal microscope	Nikkon	Nikon TE2000 spinning disk microscope	equipped with Volocity software
Digoxigenin (Dig) antibody (mouse)	Abcam	ab420	1 in 200
Dig-TMP	synthesized in the Seidman Lab
Duolink Amplification reagents (5×)	Sigma-Aldrich	DUO82010	reagents need to be stored at -20 °C
Duolink in situ detection reagents	Sigma-Aldrich	DUO92007	reagents need to be stored at -20 °C
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004	anti-mouse MINUS, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002	anti-rabbit PLUS, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ wash buffer A	Sigma-Aldrich	DUO82046	Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ wash buffer B	Sigma-Aldrich	DUO82048	Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C
epifluorescent microscope	Zeiss	Axiovert 200M microscope	Equipped with the Axio Vision software packages (Zeiss, Germany)
Formaldehyde 16%	Fisher Scientific	PI28906	for fix solution
Goat serum	Thermo	31873	Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C
Image analysis software	open source	Cell profiler	works for analysis of single plane images
Image analysis software-license required	Bitplane	Imaris	Cell Biology module needed. Can quantify PLA dots/nuclei in image stacks (3D) and do 3D reconstructions
Ligase (1 unit/μl)	Sigma-Aldrich	DUO82029	reagents need to be stored at -20 °C
Ligation reagent (5×)	Sigma-Aldrich	DUO82009	reagents need to be stored at -20 °C
MCM2 antibody (rabbit)	Abcam	ab4461	1 in 200
MCM5 antibody (rabbit monoclonal)	Abcam	Ab75975	1 in 1000
Methanol	Lab ALLEY	A2076	pre-cold at -20°C before use
phosphoMCM2S108 antibody (rabbit)	Abcam	ab109271	1 in 200
Polymerase (10 unit/μl)	Sigma-Aldrich	DUO82030	reagents need to be stored at -20 °C
Prolong gold mounting media with DAPI	ThermoFisher Scientific	P36935
PSF1 antibody (rabbit)	Abcam	ab181112	1 in 200
RNAse A 100 mg/ml	Qiagen	19101	reagents need to be stored at 4 °C
Statistical analysis and data visualization software	open source	R studio	ggplot2 package for generation of dot plot and box plots
Statistical analysis and data visualization software-license required	Systat Software	Sigmaplot V13
TMP (trioxalen)	Sigma-Aldrich	T6137_1G
TritonX-100	Sigma-Aldrich	T8787_250ML
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416_100ML
UV box	Southern New England Ultraviolet		Discontinued. See Opsytec UV test chamber as a possible replacement
UV test Chamber	Opsytec	UV TEST CHAMBER BS-04
VE-821	Selleckchem	S8007	final concentration is 1µM