Een efficiënte methode voor de productie van Adenovirus

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor de productie van adenovirus met behulp van het pAdEasy-systeem. De technologie omvat de recombinatie van de pAdTrack en pAdEasy-1 plasmiden, de verpakking en versterking van het adenovirus, de zuivering van de adenovirale deeltjes uit cellysaat en kweekmedium, de virale titratie en het functioneel testen van het adenovirus.

Samenvatting

Adenovirale transductie heeft het voordeel van een sterke en voorbijgaande inductie van de expressie van het gen van belang in een breed scala aan celtypen en organen. Recombinante adenovirale technologie is echter arbeidsintensief, tijdrovend en duur. Hier presenteren we een verbeterd protocol met behulp van het pAdEasy-systeem om gezuiverde adenovirale deeltjes te verkrijgen die een sterke groene fluorescerende eiwitexpressie (GFP) in transduceerde cellen kunnen induceren. De voordelen van deze verbeterde methode zijn een snellere voorbereiding en lagere productiekosten in vergelijking met de originele methode ontwikkeld door Bert Vogelstein. De belangrijkste stappen van de adenovirale technologie zijn: (1) de recombinatie van pAdTrack-GFP met de pAdEasy-1 plasmide in BJ5183 bacteriën; 2. de verpakking van de adenovirale deeltjes; 3. de versterking van het adenovirus in AD293-cellen; 4. de zuivering van de adenovirale deeltjes uit cellysaat en kweekmedium; en (5) de virale titratie en functionele tests van het adenovirus. De verbeteringen aan de oorspronkelijke methode bestaan uit (i) de recombinatie in BJ5183-bevattende pAdEasy-1 door chemische transformatie van bacteriën; ii) de selectie van recombinante klonen door "negatieve" en "positieve" PCR; iii) de transfectie van AD293-cellen met behulp van het K2-transfectiesysteem voor adenovirale verpakkingen; iv) de neerslag met ammoniumsulfaat van de virale deeltjes die door AD293-cellen in celkweekmedium vrijkomen; en v) de zuivering van het virus door eenstaps cesiumchloride discontinue gradiënt ultracentrifugatie. Een sterke expressie van het gen van belang (in dit geval GFP) werd verkregen in verschillende soorten transduceerde cellen (zoals hepatocyten, endotheelcellen) uit verschillende bronnen (menselijk, rund, murine). Adenoviral-gemedieerde genoverdracht is een van de belangrijkste instrumenten voor de ontwikkeling van moderne gentherapieën.

Inleiding

Adenovirussen zijn niet-ontwikkelde virussen die een nucleocapsid en een dubbelstrengs lineair DNA-genoom^1,2,3bevatten . Adenovirussen kunnen een breed scala aan celtypen infecteren en infectie is niet afhankelijk van actieve gastheerceldeling. Na infectie introduceert het adenovirus zijn genomische DNA in de celkern van de gastheer, waar het epichromosoom blijft en samen met de genen van de gastheer wordt getranscribeerd. Er wordt dus een minimaal potentieel risico voor insertie mutagenese of oncogenese-regulatie bereikt^4,5,6. Het adenovirale genoom wordt niet samen met het gastheergenoom gerepliceerd en dus worden de adenovirale genen verdund in een delende celpopulatie. Onder de voordelen van adenovirale transductie zijn er: (i) hoge niveaus van transgene expressie; ii) verminderde risico's in verband met de integratie van het virale DNA in het genoom van de gastheer als gevolg van episomale expressie; iii) transductie van een grote verscheidenheid aan delende en niet-delende celtypen. De meeste adenovirussen die in biomedisch onderzoek worden gebruikt, zijn niet-repliceerbaar en missen de E1-regio^7,8,9. Voor hun productie is een cellijn nodig die de E1-reeks levert (zoals HEK293). Bovendien werd een niet-essentieel gebied voor de virale levenscyclus (E3) verwijderd om het inbrengen van een transgeen in het virale genoom mogelijk te maken; andere regio's (E2 en E4) werden verder geschrapt bij sommige adenovirussen, maar in deze gevallen werden een verminderde opbrengst van adenovirale productie en lage expressie van het transgene gerapporteerd⁷.

Hier presenteren we een verbeterd protocol voor het construeren, verpakken en zuiveren van de adenovirussen met behulp van het AdEasy-systeem. Deze verbeteringen maakten het mogelijk om het adenovirus sneller en zuiniger in te pakken in vergelijking met de oorspronkelijke methode ontwikkeld door Bert Vogelstein^2,10, vanwege de volgende voordelen: (i) de recombinatie in BJ5183-bevattende pAdEasy-1 door chemische transformatie van bacteriën; ii) de selectie van de recombinante klonen door PCR; iii) de transfectie van AD293-cellen met behulp van het K2-transfectiesysteem voor adenovirale verpakkingen; iv) de neerslag van adenovirale deeltjes uit kweekmedium na virale verpakking en versterking; v) de adenovirale zuivering met behulp van eenstaps cesiumchloride (CsCl) gradiënt ultracentrifugatie.

Het protocol voor de productie van adenovirus met behulp van het AdEasy-systeem (figuur 1) omvat de volgende stappen:

(1) Recombinatie van pAdTrack-GFP met pAdEasy-1 in BJ5183 bacteriën
(2) Verpakking van de adenovirale deeltjes
(3) Versterking van het adenovirus
(4) Zuivering van de adenovirale deeltjes uit cellysaat en kweekmedium
(5) Titratie van het Adenovirus.

Figuur 1: De adenovirus productietechnologie. De belangrijkste stappen van de adenovirale technologie zijn: (1) De recombinatie van de pAdTrack-GFP met de pAdEasy-1 plasmide in BJ5183 bacteriën. De geselecteerde opnieuw vereende plasmiden worden versterkt in DH5α-bacteriën en vervolgens gezuiverd; (2) De verpakking van de adenovirale deeltjes in AD293-cellen die adeno-E1-eiwitten produceren; (3) De versterking van het adenovirus in AD293-cellen; (4) De zuivering van de adenovirale deeltjes uit het cellysaat en het cultuurmedium door ultracentrifugatie op een cscl-dichtheidsgradiënt; (5) De titratie van het adenovirus en de functionele tests. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

In dit protocol illustreerden we de technologie voor de productie van het adenovirus, die de expressie van GFP in de gastheercellen kan induceren. GFP is al ingevoegd in de ruggengraat van de pAdTrack-CMV shuttle vector (Addgene #16405), onder een tweede CMV promotor en wordt gebruikt als een reporter gen (Figuur 1). Om deze reden hebben we hier de pAdTrack-CMV-vector aangeduid als pAdTrack-GFP en hebben we de expressie van GFP beoordeeld voor demonstratieve doeleinden. Naast GFP-expressie kan het systeem worden gebruikt om een interessant gen te overexpresseren, dat kan worden gekloond in de meerdere kloonsites van de pAdTrack-CMV. Een gen of een minigeen gekloond in de pAdTrack-CMV is meestal efficiënter voor expressie-inductie in vergelijking met de cDNA¹¹. De gegevens toonden een sterke GFP-expressie in transduceerde cellen (zoals hepatocyten, endotheelcellen) uit verschillende bronnen (menselijk, rund, murine). Adenoviral-gemedieerde genoverdracht is een van de belangrijkste instrumenten voor de ontwikkeling van moderne gentherapieën.

Protocol

Veiligheidsnota: Over het algemeen worden adenovirussen geclassificeerd als organismen van bioveiligheidsniveau 2 en daarom moeten alle manipulaties in een bioveiligheidskast van klasse II worden uitgevoerd door een getraind persoon, die biogevaarlijke beschermingsmiddelen draagt (inclusief handschoenen, gezichtsmasker voor biologische aerosolen, laboratoriumjas, enz.). Alle vaste materialen die besmet zijn met het adenovirus moeten gedurende 30 minuten worden gedesinfecteerd met een bleekoplossing van 10% en gedurende 30 minuten bij 121 °C en 1 bar worden geautoclaveerd. Afhankelijk van het ingebrachte gen kan het gecreëerde adenovirus een gevaarlijk potentieel hebben en in andere bioveiligheidsniveaus worden ingedeeld.

1. Experimentele voorbereiding

1. Gebruik een aparte celkweekkap voor adenovirale manipulaties en een aparte incubator voor elk adenovirustype. Gebruik T-kolven met filterdoppen voor virale verpakking en versterking; vermijd zoveel mogelijk transductie-experimenten in geventileerde Petri-platen.
2. Leeg de celkweekkap na elk gebruik en stel deze gedurende 15 minuten bloot aan UV.
3. Autoclaaf periodiek de pipethulp, pipetten en andere gebruiksvoorwerpen. Indien mogelijk, kweek in een apart celkweeklaboratorium/kap de cellen voor adenovirale verpakking (AD293-cellen) en de cellen die moeten worden gebruikt in transductie-experimenten. Partijen verschillende adenovirussen die in dezelfde periode zijn versterkt, moeten worden gecontroleerd op kruisbesmetting door PCR.
4. Bereid de volgende oplossingen voor.
   1. Bereid SOB (Super Optimal Broth) medium: 20 g trypton, 5 g gistextract, 0,5 g NaCl (10 mM eindconcentratie), 2,5 ml van 1 M KCl (2,5 mM eindconcentratie), amd H₂O tot 1 L. Voeg na autoclaaf bij 121 °C de volgende steriele oplossingen toe: 5 ml 1 M MgCl₂ en 5 ml van 1 M MgSO₄.
   2. Bereid SOC (Super Optimal bouillon met Katabolietrepressie) medium: voeg in 1 L steriele SOB de volgende steriele oplossingen toe: 20 ml 1 M glucose, 5 ml van 1 M MgCl₂ en 5 ml van 1 M MgSO₄.
   3. Bereid neerslagoplossing: los 29,5 g kaliumacetaat op in 60 ml H₂O, voeg 11,5 ml azijnzuur en H₂O tot 100 ml toe.
   4. Bereid resuspensiebuffer voor: 95 ml 20% glucose, 5 ml 1 M Tris-Cl pH 8, 4 ml van 0,5 M EDTA pH 8 en voeg H₂O toe aan 200 ml.
   5. Bereid lysisoplossing voor: 4,8 ml 8,3 M NaOH, 10 ml 20% SDS en H₂O tot 200 ml.

2. Recombinatie van pAdTrack-GFP virale vector met pAdEasy-1 plasmide in BJ5183 bacteriën

1. Linearisatie van pAdTrack-GFP en zuivering van de gesaldeerde plasmide.
   1. Bereid de volgende spijsverteringsmix op ijs:
      10 μg pAdTrack-GFP
      5 μL 10x kleurloze buffer
      2 μL Pme I
      H₂O tot een eindvolume van 50 μL.
   2. Incubeer bij 37 °C gedurende 3 uur in een waterbad.
   3. Inactiveren bij 65 °C gedurende 20 min.
   4. Controleer de efficiëntie van de spijsvertering van pAdTrack-GFP met Pme I: voer 1 μg van de verteerde plasmide parallel met 1 μg onverteerd plasmide uit op een 0,8% agarosegel.
2. Isolatie en zuivering van DNA
   OPMERKING: Stap 1-6 moet worden uitgevoerd in een zuurkast.
   1. Voeg een gelijk volume fenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1) toe aan het spijsverteringsmengsel en draai de buis om totdat het mengsel homogeen is.
   2. Centrifugeer gedurende 3 minuten op 16.200 x gen breng vervolgens de bovenste waterfase over naar een opvangbuis.
   3. Voeg een gelijk volume fenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1) toe over de onderste organische fase en vortex.
   4. Centrifugeer gedurende 3 minuten bij 16.200 x gen breng vervolgens de bovenste fase over naar dezelfde opvangbuis.
   5. Voeg een gelijk volume chloroform toe over de waterige fase die in de opvangbuis en vortex is geoogst.
   6. Centrifugeer gedurende 3 minuten op 16.200 x gen breng vervolgens de bovenste waterfase over naar een nieuwe opvangbuis.
   7. Voeg een 1/10 volume van 3 M natriumacetaat en 2 volumes koude 100% ethanol en vortex toe.
   8. Incubeer gedurende 1 uur bij -70 °C of 's nachts bij -20 °C.
   9. Ontdooi het monster op ijs en centrifugeer het gedurende 10 minuten bij 16.200 x g en 4 °C.
   10. Verwijder het supernatant en voeg 750 μL 75% ethanol toe.
   11. Centrifugeer gedurende 3 min bij 16.200 x g en 4 °C en verwijder het supernatant.
   12. Draai de buis kort om al het supernatant te verwijderen en droog de pellet in de kap. Droog de DNA-pellet niet lang omdat het lastig is om op te lossen.
   13. Los de pellet op in 15 μL H₂O.
   14. Meet de DNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer (bijv. Nanodrop).
3. Transformatie van AdEasier-1 bacteriën met pAdTrack-GFP
   OPMERKING: In deze stap vindt de recombinatie van pAdTrack-GFP met pAdEasy-1 plasmide plaats.
   1. Bereid AdEasier-1 (BJ5183-bevattende pAdEasy-1, Addgene #16399) chemische competente bacteriën, met behulp van een commerciële transformatie kit, volgens de instructies van de fabrikanten. Houd aliquots van 100 μL competente bacteriën bij -80 °C.
   2. Ontdooi een aliquot van competente AdEasier-1 bacteriën op ijs en voeg 1 μg gezuiverde Pme I-verteerde pAdTrack-GFP toe. Meng voorzichtig door op de buis te tikken (pipetteer het mengsel niet). Incubeer gedurende 10 minuten op ijs.
   3. Voeg 900 μL SOC-medium toe en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C met schudden.
   4. Microfuge gedurende 5 min bij 600 x g.
   5. Verwijder 900 μL van het supernatant, meng de pellet en het supernatant en zaai de getransformeerde bacteriën op LB-agarplaten met kanamycine.
   6. Incubeer gedurende ~16 uur bij 37 °C (niet langer dan 18 uur).
4. Selectie van de mogelijke positieve klonen door PCR
   1. Verdeel tandenstokers in twee helften en steriliseer de halve tandenstokers door autoclaaf.
   2. Pak kleine en doorschijnende kolonies op met steriele halve tandenstokers.
   3. Draai de halve tandenstoker kort met bacteriën in 10 μL water (in een PCR-buis) en plaats de halve tandenstoker vervolgens in een Eppendorf-buis van 1,5 ml met een SOC-medium van 100 μL met kanamycine. Incubeer gedurende 4-6 uur bij 37 °C, terwijl u de klonen test met "negatieve" en "positieve" PCR.
   4. Incubeer de PCR-buizen met 10 μL water met bacteriën gedurende 5 minuten bij 95 °C om het bacteriemonster te verkrijgen en voer parallel de "negatieve" en "positieve" PCR uit.
   5. "Negatieve" PCR - om de pAdTrack-GFP integriteit te testen: Bereid de volgende PCR mix voor op de negatieve PCR op ijs.
      5 μL van het bacteriemonster
      0,1 μL primer Voorwaarts (4631 F: 5'-CAGTAGTCGGTGCTCGTCCAG)
      0,1 μL primer Reverse (5616 R: 5'-TATGGGGGCTGTAATGTTGTCTC)
      0,1 μL dNTP 10 mM
      3 μL 5x buffer
      1,5 μL MgCl₂ 25mM
      0,1 μL GoTaq Polymerase
      H₂O tot een eindvolume van 15 μL
      OPMERKING: De positieve controle waarbij de DNA-sjabloon de pAdTrack-GFP-vector is, moet worden opgenomen.
   6. "Positieve" PCR - om de aanwezigheid van het gen van belang te testen. Gebruik specifieke primers voor het ingebrachte gen en bereid de mix voor zoals in de vorige stap. De primers die voor GFP werden gebruikt, waren de volgende:
      V: 5'-CAAGGACGACGGCAACTACA
      R: 5'-ATGGGGGTGTTCTGCTGGTA
   7. Voer parallel de "negatieve" en de "positieve" PCR uit. Het PCR-programma is: 5 min, 95 °C; 40 cycli van de volgende stappen: 30 sec, 95 °C; 30 sec, 68 °C; 1 min, 72 °C; laatste verlenging: 10 min, 72 °C.
      OPMERKING: Pas de gloeitemperatuur aan om het gen van belang te versterken.
   8. Evalueer de PCR-producten op een 1% agarose gel en maak de selectie van de klonen.
   9. Overweeg voor verdere verwerking van de klonen die geen PCR-producten geven voor de "negatieve PCR" en het specifieke PCR-product na de "positieve PCR".
5. Kweek de bacterieculturen van geselecteerde recombinante klonen
   1. Verdun de culturen van de veronderstelde positieve klonen (resulteerde in stap 2.4.3.) in 4 ml SOC-medium met kanamycine en incubeer ze 's nachts bij 37 °C met schudden.
6. Isolatie van plasmide-DNA van AdEasier-1-bacteriën (Miniprep met alkalische lysis)
   1. Breng 1,5 ml bacteriecultuur over in microcentrifugebuizen, centrifugeer gedurende 1 min bij 16.200 x gen verwijder het supernatant.
   2. Breng nog een bacteriële cultuur van 1,5 ml over in dezelfde buis, herhaal centrifugeren en verwijder het supernatant.
   3. Voeg 200 μL resuspensiebuffer toe (50 mM glucose, 10 mM EDTA, 25 mM Tris-HCl pH 8).
   4. Voeg 200 μLlysisoplossing (0,2 N NaOH, 1% SDS) toe, meng voorzichtig door de buis om te keren.
   5. Voeg 200 μL neerslagoplossing toe (60 ml kaliumacetaat van 5 m, 11,5 ml ijsazijn, voeg H₂O toe tot 100 ml) en meng voorzichtig door de buis om te keren.
   6. Centrifugeer gedurende 3 min bij 16.200 x g.
   7. Breng het supernatant over in een nieuwe microcentrifugebuis, voeg 500 μL isopropanol toe, meng en incubeer gedurende 20 minuten op ijs.
   8. Centrifugeer gedurende 15 min bij 16.200 x g en voeg 500 μL 75% ethanol toe.
   9. Centrifugeer gedurende 10 min op 16.200 x g en verwijder het supernatant.
   10. Centrifugeer gedurende 3 min bij 16.200 x g,verwijder het supernatant en voeg 15 μL H₂O toe.
7. Versterking, isolatie en hertesten van de opnieuw vereende plasmiden
   1. Transformatie van DH5α bacteriën met het DNA geïsoleerd uit AdEasier-1 cellen.
      1. Bereid DH5α competente bacteriën voor met behulp van de commerciële transformatiekit, volgens de instructies van de fabrikant.
      2. Ontdooi 100 μL DH5α competente bacteriën op ijs, voeg het recombinante DNA toe en incubeer 10 min op ijs. Zaai de bacteriën vervolgens op LB-agar platen met kanamycine.
      3. Incubeer 's nachts bij 37 °C.
      4. Pak verschillende kolonies op en groei elk in 2 ml LB-medium met kanamycine, bij 37 °C, 's nachts, met schudden.
   2. Isoleer het DNA (Miniprep met alkalische lysis) en resuspend het verkregen DNA in 25 μL H₂O.
   3. Bevestig de positieve klonen door enzymatische spijsvertering.
      1. Bereid de volgende mix op ijs:
         5 μL recombinant DNA
         1,5 μL 10x kleurloze buffer
         0,5 μL Hind III of Pst I
         H₂O tot een eindvolume van 15 μL
      2. Incubeer bij 37 °C gedurende 30 min.
         OPMERKING: Verteer als controle ook de pAdTrack-GFP en pAdEasy-1 plasmiden.
      3. Voeg in elk monster 3 μL Sx6-laadbuffer toe met RNase A (als RNase A niet aanwezig is in de miniprepbuffers).
      4. Voer de verteerde DNA fragmenten uit op 1% agarose gel elektroforese.
         OPMERKING: Het spijsverteringspatroon van een positieve kloon omvat de meerderheid van de fragmenten van de verteerde pAdEasy plasmide, waardoor pAdEasy-recombinatie met de pAdTrack-vector wordt onthuld. Het gen van belang moet worden aangetoond door de spijsvertering met de restrictie-enzymen die worden gebruikt voor klonen.
   4. Bereiding van plasmide-DNA (transfectiekwaliteit) voor adenovirusverpakkingen.
      1. Kweek een 200 ml kweek van bacteriën uit een positieve kloon om het plasmide-DNA te isoleren.
      2. Isoleer het plasmide-DNA met behulp van een commerciële kit voor plasmide-DNA Midiprep (bijv. Qiagen Plasmid Midi Kit) volgens de instructies van de fabrikant.

3. Verpakken van de adenovirale deeltjes

1. Dag 1. Zaai de AD293-cellen
   1. Was de AD293 cellen met PBS en incubeer ze met 0,125% Trypsine gedurende 2-5 min bij 37 °C.
   2. Verzamel de cellen in koud medium met serum.
   3. Centrifugeer gedurende 5 min bij 400 x g bij 4 °C.
   4. Resuspend de cellen in medium met serum en zaad de cellen met een dichtheid van ~2 x 10⁶/T25 kolf. Gebruik bij voorkeur een kolf met een filter.
2. Dag 1. Verteer het recombinante DNA met Pac I
   1. Bereid de volgende mix voor:
      6 μL recombinant DNA (1 μg/μL)
      2 μL Pac I
      2,5 μL 10x kleurloze buffer
      H₂O tot een eindvolume van 25 μL
   2. Incubeer gedurende 3 uur (of 's nachts) bij 37 °C en inactiveer het enzym vervolgens gedurende 20 minuten bij 65 °C.
   3. DNA-neerslag met ethanol: voeg 2,5 μL (1/10 v/v) 3 M natriumacetaat en 2-3 volumes 100% ethanol toe. Incubatie gedurende 30 minuten bij -70 °C of 's nachts bij -20 °C.
   4. Centrifugeer bij 16.200 x g gedurende 30 min bij 4 °C en resuspend de pellet in steriel water.
3. Dag 2: Transfectie van AD293 cellen met K2 reagens
   1. Voeg 40 μL K2 Multiplier toe over de cellen, twee uur voor transfectie.
   2. Bereid A- en B-oplossingen voor:
      Oplossing A: Voeg 6 μg Pac l-linearized DNA toe in 260 μL Opti-MEM.
      Oplossing B: Voeg 21,6 μL K2-reagens toe in 248,4 μL Opti-MEM.
   3. Voeg oplossing A toe over oplossing B en meng voorzichtig door pipetten.
   4. Incubeer het mengsel gedurende 20 minuten op kamertemperatuur. Voeg dropwise A en B mix toe aan de cellen.
4. Dag 3-11: Monitor de GFP-expressie door fluorescentiemicroscopie
   OPMERKING: Cellen moeten groen lijken in fluorescentiemicroscopie en moeten geleidelijk losraken.
5. Dag 11: Oogst de F1 adenovirale deeltjes
   1. Verzamel de losgemaakte cellen en het medium in een buis van 50 ml, schraap de aanhechtingscellen en voeg ze toe in dezelfde buis.
   2. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 x g, verzamel het supernatant in een nieuwe buis en resuspendeer de celkorrel in 0,5 ml PBS.
   3. Celverstoring
      1. Breng de celsuspensie over in een microcentrifugebuis.
      2. Voer drie vries-/dooicycli uit (vries in vloeibare stikstof of bij -80 °C /dooi bij 37 °C gedurende maximaal 7 minuten).
      3. Geef de gebroken cellen drie keer door een spuitnaald van 23 G.
   4. Verwijder het celafval door centrifugeren bij 9.600 x g gedurende 12 minuten.
   5. Breng het supernatant over op de buis van 50 ml met het verzamelde medium.

4. Versterking van het adenovirus

OPMERKING: Als de AD293-cellen niet de noodzakelijke samenvloeiing hebben bereikt, mogen de aliquots van de adenovirale voorraden (lysaat verkregen uit de virusproducerende cellen) die voor infectie worden gebruikt, bij -80 °C worden opgeslagen.

1. Bereid de F2 adenovirale deeltjes voor.
   1. Zaai de AD293-cellen in een T75-kolf (5 x 10⁶ cellen/kolf).
   2. Infecteer ~90% samenvloeiende AD293-cellen met behulp van de F1-adenovirale deeltjes: voeg het celhomogenaat en het medium uit de T25-kolf toe aan de cellen die in de T75-kolf worden gekweekt.
   3. Bewaak de GFP-expressie door fluorescentiemicroscopie.
   4. Oogst de virusproducerende cellen wanneer ~90% van de getransduceerde AD293 worden losgemaakt (~ de^5e dag na transductie). Houd het celkweekmedium op 4 °C.
   5. Verstoor de cellen (op dezelfde manier als die voor F1) in 1 ml PBS.
2. Bereid de F3 adenovirale deeltjes voor.
   1. Infecteer ~90% samenvloeiende AD293 cellen gezaaid in T175 kolf met F2 adenovirale deeltjes en het celkweekmedium uit de F2 adenovirale deeltjes.
   2. Oogst de cellen (~ 5 dagen na transductie).
   3. Verstoor de cellen (op dezelfde manier als die voor F1) in 2 ml PBS.
3. Bereid de F4 adenovirale deeltjes voor.
   1. Infecteer 5 T175 kolven met ~90% samenvloeiende AD293 cellen met F3 adenovirale deeltjes en celkweekmedium.
   2. Oogst de cellen (~ 5 dagen na transductie).
   3. Verstoor de cellen (op dezelfde manier als die voor F1) in 3 ml PBS.
4. Bereid de F5 adenovirale deeltjes voor.
   1. Infecteer 25 T175 kolven met ~90% samenvloeiende AD293 cellen met F4 adenovirale stam en celkweekmedium.

5. Zuivering van het adenovirus uit cellysaat en cultuurmedium

1. Het oogsten van de virusproducerende cellen en het kweekmedium.
   1. Oogst de AD293-cellen van F5 na 5 dagen na transductie.
   2. Bewaar het medium in een steriele fles voor neerslag van de adenovirale deeltjes.
      OPMERKING: Bewaar het medium in de koelkast tot de zuivering van het adenovirus.
   3. Centrifugeer de cellen op 400 x g, gedurende 5 min, op 4 ^oC.
   4. Resuspend de laatste pellet in 5 ml van 10 mM Tris HCl, pH 8 met 2 mM MgCl₂.
   5. Aliquot de suspensie in 1,5 ml buizen.
   6. Verstoor de cellen (op dezelfde manier als die voor F1): drie cycli van invriezen/ontdooien.
      OPMERKING: Als de ultracentrifugatie niet onmiddellijk kan worden uitgevoerd, bewaar de monsters dan op -80 °C.
   7. Geef de celsuspensie drie keer door een 23G-spuitnaald.
   8. Centrifugeer het homogenaat op 9 600 x g, gedurende 12 min.
   9. Bewaar het supernatant voor adenovirus zuivering door CsCl gradiënt ultracentrifugatie.
2. Neerslag van het adenovirus dat vrijkomt in het cultuurmedium.
   1. Breng de fles met opgeslagen celkweekmedium op kamertemperatuur.
   2. Voeg 121 g ammoniumsulfaat toe aan elke 500 ml celkweekmedium (verzadiging van de oplossing moet tussen 40 - 42% zijn).
   3. Meng voorzichtig tot het ammoniumsulfaat volledig is opgelost.
   4. Incubeer minimaal 2,5 uur bij kamertemperatuur.
   5. Centrifugeer op 1600 x g, gedurende 15 min, op 22 ^oC en bewaar de pellet.
   6. Resuspend de pellet in 4 ml van 10mM Tris HCl pH 8 met 2mM MgCl_2; deze suspensie moet onmiddellijk worden gezuiverd door cscl gradiënt ultracentrifugatie.
      OPMERKING: Als de zuiveringsstap vervolgens niet kan worden uitgevoerd, dialyse 's nachts de geresuspendeerde pellet tegen 10mM Tris HCl, pH 8 met 2mM MgCl₂.
3. Adenovirus zuivering door ultracentrifugatie.
   1. Bereid een discontinue CsCl gradiënt voor in polypropyleen buizen voor SW41Ti rotor. Voeg 3 ml 765 mg/ml CsCl (hoge dichtheid: 1,4 g/L) toe aan de onderkant van de buis. Voeg langzaam 3 ml 288,5 mg/ml CsCl (lage dichtheid: 1,2 g/L) toe bovenop de eerste CsCl-laag.
   2. Leg voorzichtig 3 - 4 ml adenovirale deeltjessuspensie die vrijkomt uit de cellen of neergeslagen is uit het celkweekmedium (zoals eerder beschreven) bovenop de gradiënt.
   3. Vul de buizen met minerale olie en doe de buizen in de koude SW41Ti emmers.
   4. Equilibreren van de buizen. Zorg ervoor dat de gevulde polypropyleen buizen symmetrisch in de rotor worden geladen. Plaats de rotor in de ultracentrifuge.
   5. Centrifugeer bij 210.000 x g en 4 °C, gedurende 18 uur geen rem.
   6. Plaats de ultracentrifugebuizen op een standaard met een zwart papier erachter om de banden te krijgen.
   7. Gooi de heldere bovenste fase, het celafval en de bovenste band weg in een afvalcontainer met de bleekoplossing.
   8. Oogst de laagste band die het volledige adenovirus (~700 μL - 1 ml) bevat in een steriele buis van 1,5 ml en houd het op ijs.
   9. Maak een dialysecassette in de dialysebuffer (10 mM Tris-Cl buffer pH 8, 2 mM MgCl 2 )_voor.
   10. Injecteer het gezuiverde adenovirus in de dialysecassette met een spuit van 2 ml.
   11. Dialyseer 's nachts tegen 10 mM Tris-Cl buffer pH 8, 2 mM MgCl₂ (verander de dialysebuffer 3 - 4 keer).
   12. Oogst de adenovirale bouillon uit de dialysecassette in aliquots van 10 - 100 μL.
   13. Voeg sacharose toe aan 4% eindconcentratie aan virale aliquots (voor cryoprotectie).
   14. Bewaar aliquots bij -80 °C.

6. Titratie van het Adenovirus

1. Dag 1: Plateren van de cellen
   1. Zaai de AD293-cellen met een dichtheid van 2,5 × 10⁵ cellen per put (in een 12-put kweekplaat) in 1 ml volledig groeimedium, zoals weergegeven in figuur 2. Zorg ervoor dat cellen gelijkmatig in elke put worden verspreid voor nauwkeurige titerbepaling.

Figuur 2: Titratieplaatontwerp. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

2. Dag 2: Transductie van cellen
   1. Maak de cellen los van één put met trypsine en tel ze. Noteer dit getal omdat het zal worden gebruikt om de virale titer te berekenen.
   2. Voer seriële verdunningen (1/10⁴; 1/10⁵; 1/10⁶; 1/10⁷) van het virale bestand uit in 1 ml volledig groeimedium als volgt:
   3. 1/10³: verdunning van het virusbestand - voeg 2 μL viraal bestand toe aan 1998 μL volledig medium.
   4. 1/10⁴: Verdunning van 1:10 van 1/10³ door 120 μL tot 1080 μL volledig medium (A) te verdunnen.
   5. 1/10⁵: Verdunning van B 1:10 door 120 μL A tot 1080 μL volledig medium (B) te verdunnen.
   6. 1/10⁶: Verdunning van C 1:10 door 120 μL B tot 1080 μL volledig medium (C) te verdunnen.
   7. 1/10⁷: Verdun 1:10 van D door 120 μL C tot 1080 μL volledig medium (D) te verdunnen.
      OPMERKING: Bereid 3 buisjes van elke verdunning (A, B, C, D) voor om het experiment in drievoud uit te voeren.
   8. Verwijder het celkweekmedium uit de putten en voeg de bereide verdunningen van het virus toe, zoals weergegeven in figuur 2.
3. Dag 3: GFP-expressie bewaken
   1. Controleer de putten op de aanwezigheid van groene cellen met behulp van een fluorescentiemicroscoop.
4. Dag 4: Flow cytometrie analyse van GFP-positieve cellen
   1. Bereid twaalf buizen van 1,5 ml voor en label ze.
   2. Verzamel het celkweekmedium (samen met de losgemaakte cellen) in buizen van 1,5 ml en houd ze op ijs.
   3. Voeg 200 μL trypsine toe aan elke put.
   4. Incubeer de plaat gedurende 2 - 3 min bij 37 °C in de CO₂ incubator.
   5. Oogst de cellen in dezelfde Eppendorf-buizen met het celkweekmedium. Hou de buizen op ijs.
   6. Pellet de cellen op 400 x g, gedurende 5 min, bij 4 °C.
   7. Verwijder het supernatant; houd de buizen op ijs.
   8. Resuspend de pellet in 250 μL PBS + 2% FBS; houd de buizen op ijs.
   9. Breng de celsuspensie over in flow cytometriebuizen of plaat.
   10. Voer de monsters uit op een flowcytometer die de fluorescentie van de GFP-uitdrukkende cellen registreert.
       Titer berekening: De monsters met 5 - 20% GFP positieve cellen van de ouderpopulatie moeten in aanmerking worden genomen voor de berekening van virale titer met behulp van de volgende formule:
       Titer (TU/mL) = D x F/100 x C/V
       D = verdunningsfactor
       F = percentage positieve cellen / 100
       C = aantal cellen / put
       V = volume viraal entmateriaal

7. Adenovirale transductie van doelcellen en testen van de geïnduceerde eiwitexpressie

1. Dag 1: Het zaaien van de cellen
   1. Zaai de doelcellen zodat ze gelijkmatig in de putten worden verspreid.
2. Dag 2: Transductie van de cellen
   1. Maak de doelcellen los van één put en tel ze.
   2. Bereken het juiste volume van de adenovirale suspensie die nodig is om de cellen te transduceren met het gewenste aantal infectieuze deeltjes per cel.
   3. Voeg de overeenkomstige hoeveelheid virale suspensie toe aan de doelcellen.
3. Dag 3: Verwijdering van de virale suspensie en controle op GFP-expressie
   1. Vervang het celkweekmedium met adenovirale deeltjes door vers medium.
   2. Controleer de GFP-expressie bij de fluorescentiemicroscoop.

Resultaten

We hebben het oorspronkelijke Vogelstein-protocol aangepast en verbeterd om een snellere en efficiëntere productie van adenovirussen te bereiken. Ten eerste hebben we de methodologie herzien om een gemakkelijkere selectie van recombinanten te bereiken. Na recombinatie werden de BJ5183-bacteriële klonen getest door "negatieve PCR" om de integriteit van pAdTrack-GFP te beoordelen als een indicator van het gebrek aan recombinatie (figuur 3A), of door "positieve PCR" om het gen van belang te identificeren, in ons geval geassimileerd met GFP (figuur 3B). In zowel "negatieve" als "positieve" PCR's gebruikten we pAdTrack-GFP als controlesjabloon, die een band van 986 bp gaf voor pAdTrack-integriteit(figuur 3A,baan 1) en een band van 264 bp voor GFP(figuur 3B,baan 3). De primers die werden gebruikt voor de "negatieve PCR" zijn ontworpen om een fragment van 986 bp te versterken dat de PmeI-site in pAdTrack-GFP bevat. Dit DNA-fragment wordt drastisch vergroot na recombinatie en wordt niet versterkt in de positieve recombinante klonen. Negatieve klonen voor recombinatie, waarbij pAdTrack-GFP intact bleef, worden weergegeven in figuur 3A, rijstroken 3, 4 en 6. De primers gloeien op de DNA-sequenties naast de recombinatieplaats. Potentiële positieve recombinante klonen (figuur 3A, rijstroken 2 en 5) uitgedrukt GFP zoals weergegeven in figuur 3B, baan 1 en 2. Plasmide DNA van deze klonen werd geïsoleerd en gebruikt voor DH5α transformatie om een hogere hoeveelheid DNA te verkrijgen. Deze voorgeselecteerde recombinante plasmiden versterkt in DH5α werden vervolgens getest door enzymatische spijsvertering. In figuur 3worden C-E de resultaten geïllustreerd van de enzymatische vertering van één recombinant-positieve kloon verteerd met Hind III, PstI, BamHI restrictie enzymen(Figuur 3C, D, E baan 2). De HindIII- en PstI-spijsverteringspatronen van de recombinante kloon waren vergelijkbaar met die verkregen voor pAdEasy-1 sinds HindIII en PstI respectievelijk 24 en 25 keer de pAdEasy-1 plasmide hebben doorgesneden (figuur 3C en D, baan 3); HindIII snijdt één keer en PstI snijdt vier keer de pAdTrack-GFP vector(figuur 3C en D,baan 1). BamHI sneed tweemaal pAdEasy-1 vector(figuur 3C,baan 3) en eenmaal pAdTrack-GFP(figuur 3C, baan 1).

PacI knipte een fragment van 4,5 kb uit de recombinante plasmide(figuur 3F,baan 2), een fragment van 2863 bp uit pAdTrack-GFP(figuur 3F, baan 1) en lineariseerde de pAdEasy-1 vector(figuur 3F,baan 3). De DNA-ladder is weergegeven in figuur 3C-F, in baan 4. Het recombinante plasmide werd verteerd met Pac I voor verder gebruik voor AD293 transfectie.

Figuur 3: De recombinatie van pAdTrack-GFP met de pAdEasy-1 plasmide. De plasmiden verkregen na de recombinatie van pAdTrack-GFP en pAdEasy-1 werden getest door "negatieve" PCR op de pAdTrack-GFP integriteit (A). De niet-recombinante klonen werden aangetoond door de aanwezigheid van een 986 bp-band die overeenkomt met de sequentie versterkt door de pAdTrack-GFP plasmide (A, banen 3, 4 en 6). De klonen die mogelijk positief zijn voor recombinatie (A, baan 2 en 5) werden ook verkregen. Toen de pAdTrack-GFP-vector als sjabloon werd gebruikt, werd een band van 986 bp voor pAdTrack-GFP (A, baan 1) verkregen. De potentieel positieve recombinante klonen werden getest op GFP-expressie door "positieve" PCR (B); een band van 264 bp verschijnt voor zowel potentieel opnieuw verbonden klonen (B, baan 1 en 2), als voor de pAdTrack-GFP plasmide. Het DNA van één potentiële recombinante kloon werd getest met HindIII, PstI, BamHI en PacI restrictie-enzym (C-F, lanes 2). In de controles werden de pAdEasy-1 vector (C-F, lanes 3) en de pAdTrack-GFP plasmide (C-F, lanes 1) verteerd met dezelfde enzymen. De DNA ladder is vertegenwoordigd in C-F baan 4. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

De adenovirale verpakking en versterking werden uitgevoerd in AD293 cellen. De adenovirale deeltjes (AdV-GFP) werden gezuiverd uit het AD293-cellysaat en uit het celkweekmedium, waar ze waren vrijgegeven door de geïnfecteerde cellen. Om het adenovirus in het celkweekmedium te concentreren, werden de deeltjes neergeslagen met ammoniumsulfaat en vervolgens geresuspendeerd in 10 mM Tris HCl pH 8 met 2 mM MgCl₂, dezelfde buffer als die gebruikt voor cellysis. Vervolgens werden de adenovirale deeltjes uit het cellysaat en uit het kweekmedium gezuiverd door CsCl discontinue gradiënt ultracentrifugatie. Na ultracentrifugatie werd een sterke band van gezuiverde AdV-GFP verkregen, zoals weergegeven in figuur 4.

Figuur 4: De adenovirale zuivering door ultracentrifugatie op een discontinue CsCl gradiënt. Het celhomogenaat en het adenovirus dat uit het medium werd neergeslagen, werden onderworpen aan ultracentrifugatie op een discontinue gradiënt gevormd door CsCl-oplossingen met lage en hoge dichtheid. Sterke banden van GFP- adenovirus werden in beide gevallen aangetoond. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Om de virale titer, uitgedrukt in transducerende eenheden per ml (TU/ml), te bepalen, werden de AD293-cellen geïnfecteerd met seriële verdunningen van het AdV-GFP. Na 48 uur drukten de geïnfecteerde cellen GFP uit, in een omgekeerde correlatie met de verdunningsfactor van de virale suspensie. Dit werd waargenomen door fluorescentiemicroscopie en het percentage GFP-positieve cellen werd bepaald door flowcytometrie (figuur 5). Om de titer te berekenen, werd de virale verdunning overwogen die 5 - 20% van de GFP-positieve cellen veroorzaakte (Figuur 5C). Meestal verkrijgen we een virale titer van ~10¹⁰ (TU/ml) voor GFP-adenovirus.

Hieronder geven we een voorbeeld van een adenovirale titerberekening voor een specifieke adenovirale batch waarbij 300000 cellen (C) werden getransduceerd met 1 ml adenovirale oplossing (V), bij een verdunningsfactor van 10⁶ (D), waarvoor 6% GFP-positieve cellen (F) werden verkregen:

Titer (TU/ml) = D x F/100 x C/V = 10⁶ x 6/100 x 300000/1 = 1,8 x 10¹⁰ TU/ml

Figuur 5: De beoordeling van de adenovirale titer. AD293-cellen werden geïnfecteerd met verschillende adenovirale verdunningen. Achtenveertig uur later werden de cellen waargenomen door fluorescentiemicroscopie en geanalyseerd door flowcytometrie om het percentage GFP-positieve cellen te bepalen dat werd geïnduceerd door verschillende adenovirale verdunningen (A-D). Om de poort voor flowcytometrie vast te stellen, werden ook niet-transduceerde cellen geanalyseerd (E). De titer berekend voor de verdunningsfactor 10⁶, toen 6% van de cellen GFP-positief was, was 1,8 x 10¹⁰ TU/ml. Voor panelen A-E, staven: 100μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Om het transductiepotentieel van het voorbereide adenovirus te testen, werden vier cellijnen gebruikt: menselijke endotheelcellen (EA.hy926), boviene aorta-endotheelcellen (BAEC), muriene hepatocyten (Hepa 1-6) en murine mesenchymale stromale cellen (MSC). Endotheelcellen (EA.hy926 en BAEC) werden getransduceerd met 25 TU/cel, de hepatocyten werden getransduceerd met 5 TU/cel en MSC werden getransduceerd met 250 TU/cel.

Hier is een voorbeeld van hoe het volume van adenovirale suspensie dat nodig is om 3 x 10⁶ cellen met 25 TU/cel te infecteren, met behulp van de adenovirale suspensie met 1,8 x^{10 10} TU/ml, werd berekend.

Voor 1 cel.............. 25 TU
3 x 10⁶ cellen .............. x TU x=75 x 10⁶ TU
Als de virale voorraad
1,8 x 10¹⁰ TU .............. 1 ml
75 x 10⁶ TU .............. y ml y= 4,2 x 10^-3 ml = 4,2 μL virale voorraad

Achtenveertig uur na transductie werden de cellen geanalyseerd door fluorescentiemicroscopie. Zoals weergegeven in figuur 6,werden endotheelcellen van mensen of runderen met een goede efficiëntie (~50%) voor 25 TU/cel(figuur 6 EA.hy926 en BAEC). Muriene hepatocyten (Hepa 1-6) werden efficiënt getransduceerd door het adenovirus bij een lage hoeveelheid adenovirusdeeltjes (5 TU/cel), maar ze zijn ook gevoelig voor het adenovirus omdat een hoger percentage dode cellen (PI-positieve cellen) werd geregistreerd (~16%) in vergelijking met de andere celtypen. Mesenchymale stromale cellen waren het moeilijkst te transduceren (figuur 6), vanwege het ontbreken van specifieke adenovirale receptoren (niet-gepubliceerde gegevens).

Figuur 6: De infectiviteit van het adenovirus en de inductie van GFP-expressie in transduceerde cellen. Menselijke endotheelcellen (EA.hy926), boviene aorta endotheelcellen (BAEC), muriene hepatocyten (Hepa 1-6) en murine mesenchymale stromale cellen (MSC) werden getransduceerd met de aangegeven hoeveelheid adenovirus. GFP werd gedetecteerd door fluorescentiemicroscopie en het percentage van de GFP-positieve cellen werd geanalyseerd door flowcytometrie. PI-positieve cellen bepaald door flowcytometrie tonen de celsterfte bepaald door virale transductie. EA.hy926 cellen, runder aorta endotheelcellen en Hepa 1-6 cellen werden sterk getransduceerd door het adenovirus, de opbrengst van transductie variërend van 41 - 52%. Voor MSC veroorzaakte een hogere hoeveelheid virus (250 TU/cellen) slechts 27% GFP-positief van de transduceerde cellen. Balken: 100μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussie

Recombinante adenovirussen zijn een veelzijdig hulpmiddel voor genafgifte en expressie^12,13,14. Om een sterke eiwitexpressie door adenovirale transductie te induceren, wordt de coderingssequentie van het interessegen ingevoegd in het genoom van het adenovirus. Het AdEasy adenovirale systeem, ontwikkeld in het laboratorium van Bert Vogelstein, bestaat uit een backbone plasmide (pAdEasy-1) met het grootste deel van het wild-type adenovirus serotype 5 genoom, en een shuttle vector (pAdTrack), ontworpen voor gen klonen^2,10. De deletie van de adentovirale genen E1 (verantwoordelijk voor de assemblage van infectieuze virusdeeltjes) en E3 (codering van eiwitten die betrokken zijn bij het ontwijken van gastheerimmuniteit) creëerde een ruimte in het adenovirale genoom, waarin een gen van belang van 6,5-7,5 kb kan worden ingevoegd^2,3. Deze grootte is voldoende voor veel genen, vooral voor mensen met kortere introns^15,16,17. Er zijn ook onderzoekers die de productie rapporteren van adenovirussen die het cDNA van een transgene^18,19,20dragen . We hebben echter een lagere opbrengst van transgene expressie verkregen voor cDNA-dragende adenovirussen dan voor hun tegenhangers die een gen of een mini-gen dragen (gegevens niet weergegeven).

Het verbeteren en aanpassen van de vorige methoden^{2,10,14,18,21}, de technologie voor adenovirale productie vereist een kortere tijd, lagere kosten en minder inspanning. Het adenovirale DNA over de volledige lengte wordt verkregen door recombinatie tussen de shuttlevector en de pAdEasy-1 plasmide in de homologe recombinatiegevoelige E. coli stam, BJ5183. Het protocol impliceert de chemische transformatie van AdEasier-1 cellen (BJ5183 bacteriën die pAdEasy-1 bevatten). Deze techniek vereist geen elektroporator die mogelijk niet beschikbaar is in sommige laboratoria, is zeer eenvoudig, verhoogt de recombinatieopbrengst en vermindert de tijd die nodig is om competente cellen te verkrijgen en de transformatie uit te voeren. De voorselectie van recombinante klonen uitgevoerd door PCR verkort de tijd verder en vergemakkelijkt de hele procedure. Een vergelijkbare procedure werd gebruikt door Zhao en collega's²², maar in het protocol hebben we de sequenties van de primers geoptimaliseerd.

Voor de GFP-adenovirus verpakking en versterking werd een HEK293 afgeleide cellijn gebruikt, namelijk AD293 cellen, die meer aan de kweekplaat hechten. Andere cellijnen die vaak worden gebruikt voor adenovirale productie zijn de volgende: 911, 293FT, pTG6559 (A549 afgeleide), PER. C6 (HER derivaat), GH329 (HeLa derivaat), N52. E6, en HeLa-E1^23,24,25,26. In onze handen werd geen verbetering van de adenovirale productie verkregen toen 911 cellen werden gebruikt (gegevens niet getoond). De transfectie van AD293-cellen met het recombinante plasmide met K2-reagens verhoogde de efficiëntie van de virale verpakkingsstap sterk. Na de productie van het adenovirus bevindt tot ~70% van het adenovirus zich nog steeds in de cellen en komt het vrij door drie vries- en ontdooicycli. Het verhogen van het aantal cycli is niet geschikt omdat het het adenovirus vernietigt.

Tijdens het routinematige adenovirale productieproces komen talrijke virale deeltjes vrij in het celkweekmedium. Het weggooien van dit celkweekmedium tijdens het oogsten van de geïnfecteerde AD293-cellen zou resulteren in een belangrijk viraal verlies. We hebben het door Schagen en collega's beschreven protocol geoptimaliseerd om de adenovirale deeltjes uit het celkweekmedium te zuiveren door neerslag met ammoniumsulfaat²⁷. Deze methode heeft een hogere efficiëntie in adenovirusherstel van het celkweekmedium in vergelijking met de methode met polyethyleenglycol²⁸. Het neergeslagen adenovirus moet onmiddellijk worden gezuiverd door ultracentrifugatie of een paar dagen in de koelkast worden bewaard, maar alleen na dialyse, om het zoutoverschot te verwijderen. Het langer dan een paar uur zonder dialyse houden van het neerslag is schadelijk voor het virus.

Zuivering van de adenovirale deeltjes door ultracentrifugatie in één stap vermindert de manipulatie van de adenovirale voorraad en vergemakkelijkt de procedure in vergelijking met de protocollen met behulp van opeenvolgende ultracentrifugatiestappen^14,29. Dialyse van het gezuiverde adenovirus is noodzakelijk om cesiumchloride te verwijderen dat de transductie verder kan beïnvloeden. In het protocol gebruikten we Tris-buffer met MgCl_2, maar geen sacharose voor dialyse, omdat het een enorme, ongerechtvaardigde hoeveelheid sacharose vereist die anders nodig is als conserveermiddel voor bevriezing. Zo voegden we sucrose later toe, direct in de adenovirale voorraden die klaar waren om te bevriezen. Om frequent invriezen en ontdooien van het gezuiverde adenovirus te voorkomen, is het raadzaam om de adenovirale voorraden te aliquoteren en op te slaan bij -80 °C. De adenovirale titer werd geëvalueerd door flowcytometrie gezien het GFP-reportergen en het percentage getransduceerde cellen voor een specifieke virale verdunning. Deze methode is sneller in vergelijking met de klassieke "plaquetest" en is betrouwbaarder in vergelijking met de evaluatie van de capsid-eiwitten (door verschillende methoden zoals ELISA of flowcytometrie) die de capaciteit van infectie van de adenovirale deeltjes niet onthult. Op ELISA gebaseerde kwantificering, Q-PCR of plaquetest met behulp van in de handel verkrijgbaar kits zijn echter alternatieve methoden, vooral nuttig voor titratie van adenovirussen die geen fluorescerende tracer bevatten.

Gezien het feit dat pAdTrack-adenovirussen zijn afgeleid van menselijke adenovirussen serotype 5, die wordt herkend door Coxsackievirus en Adenovirus Receptors (CAR), hebben we aangetoond dat het GFP-adenovirus cellen van menselijke oorsprong (endotheelcellen), maar ook cellen van andere oorsprong overdraagt: runderen (endotheelcellen) en murine (mesenchymale stromale cellen en hepatocyten). De gegevens toonden aan dat het GFP-adenovirus een hoog expressieniveau van een transgeen kan induceren.

Kortom, we hebben deze moeizame technologie geoptimaliseerd om de tijd, de kosten en de inspanning die nodig is om de adenovirale deeltjes te verkrijgen, te verminderen. Het voorbereide adenovirus kan verschillende celtypen infecteren en de expressie van het interessegen induceren. Dit protocol kan in verschillende experimenten worden gebruikt, omdat de adenovirale gemedieerde genoverdracht een van de belangrijkste instrumenten is voor de ontwikkeling van moderne gentherapieën.

AFKORTINGEN: AdV-GFP, adenovirale deeltjes; BAEC, aorta-endotheelcellen van runderen; CsCl, cesiumchloride; GFP, groen fluorescerend eiwit; MSC, mesenchymale stromale cellen; TU, transducerende eenheden.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
AD293 cellen	Agilent Technologies	240085
AdEasier-1 cellen	Addgene	16399
Agarose I (voor elektroforese)	Thermo Scientific	17850
Ammoniumsulfaat	Sigma	A4418
Ampicilline natriumzout	Sigma	A0166
BamH I	Thermo Scientific	FD0054
Celcultuur platen 100 mm	Eppendorf	30702115
Cesiumchloride	Sigma	L4036
DH5alpha bacteriën	Thermo Scientific	18265017
DMEM (GlutaMAX, 4,5 g/L D-Glucose)	Gibco	3240-027
EA.hy926 cellen	ATCC	CRL-2922
EDTA	Sigma	E5134
Ethanol (99,8%)	Roth	5054.2
Fetaal bovien serum	Sigma	F7524
Flacons T25, T75, T175	Eppendorf	30712129
Glucose	Sigma	G7021
Hepa 1-6 muurmuis hepatocyten	ATCC	CRL-1830
Hind III	Thermo Scientific	FD0504
Kanamycinesulfaat	Thermo Scientific	15160054
K2 Transfectie Systeem	Biontex	T060-5.0
LB medium	Formedium	LBx0102
LB-agar	Formedium	LBx0202
Mix & Go E. coli Transformatie kit	Zymo Research	T3001
Midori Green Advanced DNA kleurstof	Nippon Genetics Europe	MG-04
NaOH	Sigma	S8045
Opti-MEM	Thermo Scientific	31985070
Pac I	Thermo Scientific	FD2204
pAdEasy-1	Addgene	16400
pAdTrack-CMV	Addgene	16405
Fenol:chloroform:isoamyl alcohol (24:24:1)	Invitrogen	15593-031
Polymerase GoTaq	Promega	M3005
Pme I (Mss I)	Thermo Scientific	FD1344
Kaliumacetaat	VWR Chemicals	43065P
Pst I	Thermo Scientific	FD0614
Qiagen Midi Prep kit	Qiagen	12125
Celschraper	TPP	99003
SDS	Thermo Scientific	28365
Slide-A-Lyzer dialyse cassettes	Thermo Scientific	66330
Natriumpyruvaat	SIGMA	P5280-100G
Spuit met 23G naald	B Braun	464BR
Tris HCl	Sigma	1185-53-1
Trypan blauw	Roth	CN76.1
Tubes 50ml	TPP	91050
Ultra-Clear Tubes (14x89 mm)	Beckman Coulter	344059
Centrifuge (gekoeld)	Sigma Sartorius	3-19KS
HeraeusFresco 17 Microcentrifuge	Thermo Scientific	75002420
Ultracentrifuge met SW41Ti rotor	Beckman Coulter	Optima L-80 XP
Kweekkap	Thermo Scientific	Class II
Pipetten (0-2µl, 1-10µl, 2-20µl, 10-100µl, 20-200µl, 100-1000µl)	Thermo Scientific
Dry Block Verwarming Thermostat	Biosan	TDB-120
Thermocyclus	SensoQuest	012-103
Waterbad	Memmert	WNB 14