Methodenartikel

In Vivo CRISPR/Cas9-screening om tegelijkertijd de genfunctie in de huid en mondholte van de muis te evalueren

DOI:

10.3791/61693

⸱

2 november 2020

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Molecular and Systems Biology, Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 3Department of Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een snelle en directe in vivo CRISPR/Cas9 screeningsmethodologie met behulp van echogeleide in utero embryonale lentivirale injecties om tegelijkertijd functies van verschillende genen in de huid en mondholte van immunocompetente muizen te beoordelen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genetisch gemodificeerde muismodellen (GEMM) hebben een belangrijke rol gespeeld bij het beoordelen van de genfunctie, het modelleren van menselijke ziekten en dienen als preklinisch model om therapeutische wegen te beoordelen. Hun tijd-, arbeids- en kostenintensieve aard beperkt echter hun nut voor systematische analyse van de genfunctie. Recente vooruitgang in genoombewerkingstechnologieën overwint deze beperkingen en maakt het mogelijk om op een multiplexed en snelle manier snelle generatie van specifieke genperturbaties rechtstreeks in specifieke muisorganen mogelijk te maken. Hier beschrijven we een CRISPR/Cas9-gebaseerde methode (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) om duizenden gen knock-out klonen te genereren in het epitheel van de huid en mondholte van muizen, en bieden we een protocol met de stappen die nodig zijn om een direct in vivo CRISPR-scherm uit te voeren   voor tumoronderdrukkergenen. Deze aanpak kan worden toegepast op andere organen of andere CRISPR/Cas9-technologieën zoals CRISPR-activering of CRISPR-inactivatie om de biologische functie van genen tijdens weefselhomeostase of in verschillende ziekte-instellingen te bestuderen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een van de uitdagingen voor kankeronderzoek in het post-genomische tijdperk is het ontginnen van de enorme hoeveelheid genoomgegevens voor causale genmutaties en het identificeren van knooppunten in het gennetwerk die therapeutisch kunnen worden gericht. Hoewel bioinformatische analyses enorm hebben bijgedragen aan deze doelen, is het opzetten van efficiënte in vitro en in vivo modellen een voorwaarde om de complexiteit van biologische systemen en ziektetoestanden te ontcijferen en de ontwikkeling van geneesmiddelen mogelijk te maken. Terwijl conventionele transgene muismodellen uitgebreid zijn gebruikt voor in vivo kankergeneticastudies, heeft hun kosten-, tijd- en arbeidsintensieve aard de systematische analyse van de honderden putatieve kankergenen die door de moderne genomica zijn ontrafeld, grotendeels verboden. Om dit knelpunt te overwinnen, combineerden we een eerder vastgestelde echografie-geleide in utero-injectiemethodologie1,2 met een CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) genbewerkingstechnologie3 om tegelijkertijd verlies van functiemutaties van honderden genen in de huid en mondholte van een enkele muis te induceren en te bestuderen.

De hier beschreven methodologie maakt gebruik van ultrageluidgeleide injecties van gemanipuleerde lentivirussen in de vruchtholte van levende muisembryo's op embryonale dag E9.5. De lentivirale lading met CRISPR/Cas9 componenten transduceert het enkellaagse oppervlak ectoderm, wat later aanleiding geeft tot het epitheel van de huid en mondholte. De huid bestaat uit een buitenste epidermis, gevolgd door keldermembraan en dermis. Epidermis is een gelaagd epitheel dat bestaat uit een binnenste, basale laag, die contact houdt met het keldermembraan en proliferatieve en stamcelcapaciteit heeft. De basale laag geeft aanleiding tot de gedifferentieerde lagen hierboven, zoals spineuze, korrelige en stratum corneumlagen2,4. Lineage tracing studies tonen aan dat deze directe in vivo CRISPR/Cas9 methode genetisch weefsel-resident stamcellen manipuleert binnen de basale laag die gedurende de volwassenheid aanhoudt. Aangezien lentivirus kan worden getitreerd om het E9.5-oppervlakte-ectoderm bij klonale dichtheid over te brengen, kan deze methode worden gebruikt om mozaïekmuizen te genereren die duizenden discrete gen knock-out klonen herbergen. Next generation sequencing kan vervolgens worden gebruikt om het effect van CRISPR/Cas9-gemedieerde genablatie binnen die klonen op een multiplexed manier te analyseren5.

We hebben deze methode onlangs gebruikt om de functie te beoordelen van 484 genen die terugkerende mutaties vertonen in humaan plaveiselcelcarcinoom (HNSCC)5. HNSCC is een verwoestende kanker met een hoog sterftecijfer van 40-50% en het is de6e meest voorkomende kanker wereldwijd6. HNSCC ontstaat in mucosale bekledingen van de bovenste luchtwegen of mondholte en wordt geassocieerd met tabaks- en alcoholgebruik of infectie met humaan papillomavirus (HPV). Cutaan plaveiselcelcarcinoom (SCC) zijn huidtumoren en vertegenwoordigen de op een na meest voorkomende kanker bij mensen7. Cutane SCC en HNSCC lijken histologisch en moleculair erg op elkaar, met een hoog percentage gevallen dat veranderingen vertoont in TP53, PIK3CA, NOTCH1 en HRAS8. Hoewel er slechts een handvol genen gemuteerd zijn met hoge frequentie, zijn er honderden genen gemuteerd gevonden bij lage frequentie (< 5%), een fenomeen dat gewoonlijk de long-tail distributie wordt genoemd. Omdat de meerderheid van de long-tail genen biologische of klinische validatie mist, gebruikten we deze in vivo CRISPR screening technologie om functieverlies van deze genen te modelleren bij tumorgevoelige muizen met sensibiliserende mutaties in p53, Pik3ca of Hras en identificeerden we verschillende nieuwe tumor suppressor genen die samenwerken met p53, Pik3ca of Hras om tumorontwikkeling te triggeren5.

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol om multiplexed sgRNA lentiviral CRISPR sgRNA-bibliotheken te genereren en CRISPR / Cas9-gen knock-outschermen in het ectoderm van het muisoppervlak uit te voeren. Deze methodologie kan worden aangepast om andere genmanipulatietechnologieën op te nemen, zoals CRISPR-activering (CRISPRa) en CRISPR-inactivatie (CRISPRi), of worden aangepast om andere orgaansystemen in de muis te targeten om genfuncties te bestuderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol werd goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de IACUC van de Universiteit van Toronto.

1. Ontwerp en klonen van gepoolde CRISPR-bibliotheken

  1. Selecteer 4-5 sgRNAs die zich richten op muisgenen die interessant zijn uit bronnen zoals de SgRNA-ontwerper van het Broad Institute (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) of de CHOPCHOP-server (https://chopchop.cbu.uib.no). Selecteer een gelijk aantal sgRNAs zonder targeting uit bijvoorbeeld Sanjana et al.9 om een gRNA-bibliotheek met niet-targetingbesturingselementen van gelijke grootte te genereren.
  2. Zorg er bij de bouw van de sgRNA-bibliotheken voor dat er voldoende dekking is voor elke sgRNA in het beoogde orgaansysteem. Voor de muishuid is de epidermis bij E9.5 een enkele laag die ~ 150.000 cellen bevat, waarvan de meeste stamcelcapaciteithebben 4. Als lenti-virale transductie resulteert in 15-20% infectiviteit, worden slechts 18.000-24.000 cellen getransduceerd bij E9.5. Schaal het experiment dienovereenkomstig.
  3. Voor het klonen en versterken van deze sgRNA-bibliotheken, voeg BsmBI enzymbeperkingsplaatsen toe, evenals primerbindende DNA-sequenties aan 5' en 3' uiteinde van het sgRNA en bestel de resulterende volledige lengte oligos als gepoolde oligonucleotidechip (Figuur 1A).
    1. Voeg bibliotheekspecifieke primersequenties toe om verschillende bibliotheken op één chip te multiplexen.
    2. Met behulp van de juiste primerparen versterkt u elke bibliotheek afzonderlijk van de gepoolde oligochip. Meng in een PCR-buis 25 μL 2x polymerase mastermix, 20 μL DNase/RNase vrij water, 5 ng oligochip-DNA, 2,5 μL geschikte voorwaartse primer en 2,5 μL geschikte omgekeerde primer. Gebruik 12-15 cycli en versterk met 98 °C denaturatie, 63-67 °C gloeien, 72 °C extensieparameters voor elke cyclus in de PCR-machine.
    3. Voer PCR-product uit op een 2,5% agarosegel en zuiver ~ 100 bp PCR-product met behulp van een gel-DNA-opruimkit.
  4. Bereid de ruggengraat plasmide voor.
    1. Verteer 5 μg van de Cre-recombinase met pLKO-Cre stuffer v3 plasmide met 2 μL BsmBI in 50 μL reactiemix gedurende 1 uur bij 55 °C, gevolgd door 1 μL alkalische fosfatase incubatie gedurende 45 minuten bij 37 °C volgens de instructies van de fabrikant.
      OPMERKING: Cre-recombinase met pLKO-Cre stuffer v3 plasmide is een lenti-virale gebaseerde plasmide die Cre-recombinase-enzym bevat om Lox-Stop-Lox-cassette in muiscellen te verwijderen en heeft ook een U6-promotor om de expressie van sgRNA en tracrRNA aan te drijven. Een versie met Cas9 en zonder Cas9 kan worden gebruikt en beschikbaar op Addgene #158030 en #158031.
    2. Voer het verteerde DNA uit op een 1% agarose gel en zuiver de 7 kb lineaire vectorband met behulp van een gel DNA clean-up kit. Let op, een vulband van 2 kb moet ook zichtbaar zijn, wat wijst op een succesvolle samenvatting.
  5. Stel de ligatiereactie in om een sgRNA plasmidebibliotheek te genereren.
    1. Meng 1 μg gezuiverde vector en 30 ng gezuiverde PCR insert met 2 μL BsmBI, 5 μL T4 DNA ligase, 10 μM ATP en 1x buffer specifiek voor BsmBI. Incubeer de ligatiemix 's nachts bij 37 °C. Gebruik een extra buis met alle bovenstaande materialen behalve de PCR-wisselplaat als negatieve controle.
    2. Zuiver de volgende dag de ligatiemix met behulp van de oligo-opruimset en elute in 7 μL RNase/ DNase-vrij water.
  6. Elektroporateer de bibliotheek in competente cellen.
    1. Voeg 2 μL geëlekte sgRNA-bibliotheek of negatieve controleligatiemix toe aan 25 μL ontdooide elektrocompetente cellen in voorgekoelde cuvetten (1,0 mm) op ijs. Elektroporaat volgens het protocol van de fabrikant (10 μF, 600 Ohm, 1800 Volt). Voeg aan de cuvette 975 μL herstelmedium (of SOC-medium) toe binnen 10 s van de puls.
    2. Breng elektroporated cellen over in een kweekbuis en incubeer gedurende een uur bij 37 °C in een bacteriële schudincubator bij 300 tpm.
  7. Schat de transformatie-efficiëntie en de bibliotheekdekking per sgRNA.
    1. Bereid een 100-voudige verdunning voor door 10 μL van de transformatiereactie met cellen geëlektropoeerd met sgRNA-bibliotheek of negatieve controleligatie over te brengen naar 990 μL Recovery Medium en goed te mengen.
    2. Plaat 10 μL van de verdunde transformatiemix op een voorverwarmde 10 cm LB + ampicilline (100 μg/L) agarplaat. Dit resulteert in een 10.000-voudige verdunning van de transformanten en gebruik deze plaat om de transformatie-efficiëntie te berekenen. Voer incubatie van de platen uit bij 30 °C gedurende 14-16 uur.
  8. Plaat de rest van de transformatiereactie door 100 μL teruggewonnen cellen te verspreiden op elke plaat van in totaal 10 voorverwarmde 15 cm LB + ampicilline agarplaten. Incubeer de platen gedurende 14-16 uur bij 30 °C. Van belang, groei bij 30 °C minimaliseert recombinatie tussen de twee lange-terminale herhalingen binnen de virale plasmide.
  9. Om het kloonsucces te beoordelen, berekent u de transformatie-efficiëntie. Tel het aantal kolonies op de verdunningsplaat met transformanten uit de sgRNA-bibliotheek of negatieve controleligatie (10 cm platen, stap 1.8.2). Negatieve controlemix mag geen of slechts zeer weinig kolonies hebben. Om het totale aantal kolonies te verkrijgen, vermenigvuldigt u het aantal kolonies met 10.000.
    OPMERKING: Het getelde totale aantal kolonies vertegenwoordigt een bibliotheekdekking die minimaal 200x kolonies per sgRNA moet zijn.
    1. Zorg ervoor dat een bibliotheek met 2000 sgRNAs minstens 400.000 kolonies zal hebben. Als er niet genoeg kolonies zijn, herhaal en zet meer elektroporatie op.
  10. Kwaliteitscontrole: Kies uit de verdunningsplaat 20 kolonies en voeg elke kolonie toe aan een individuele kweekbuis met 3 ml LB-media + ampicilline. Incubeer alle 20 buizen 's nachts bij 30 °C schudden bij 250 tpm. Zuiver het plasmide-DNA met behulp van een mini-prep-kit volgens de instructies van de fabrikant en Sanger-sequentie alle 20 plasmide-DNA-monsters om te controleren of elk monster een andere sgRNA-sequentie heeft met behulp van de U6-primer (5'-GAG GGC CTA TTT CCC ATG ATT CC-3').
  11. Oogst de kolonies van elke plaat van 15 cm.
    1. Voeg 7 ml LB-medium toe en schraap de kolonies vervolgens van de LB Agar-plaat met een celstrooier. Gebruik een pipet van 10 ml om de cellen over te brengen in een steriele conische kolf van 2 L. Herhaal dit voor alle platen en poolbacteriën in de kolf van 2 L. Incubeer de kolf gedurende 2-3 uur schudden bij 30 °C. Centrifugeer de kweek en verzamel de pellet.
    2. Zuiver plasmide-DNA met behulp van een maxi-plasmide zuiveringskit.
  12. Extra kwaliteitscontrole: Gebruik 1 ng maxi-prep sgRNA library plasmide DNA en voer een PCR-reactie uit met behulp van Next-Generation sequencing primers volgens de instructies van de fabrikant. De weergave van alle sgRNAs in de bibliotheek kan worden geverifieerd door een deep sequencing platform.

2. Productie van high titer lentivirus geschikt voor in vivo transductie

OPMERKING: Voer alle stappen in dit gedeelte van het protocol uit in een BSL2+ faciliteit in een klasse II, type A2 bioveiligheidskast. 293FT en vooral de 293NT verpakkingscellen zorgen voor een hogere virusproductie. Gebruik lage passage (

  1. Bereid virale verpakkingscellen voor.
    1. Op dag 1 bedekten plaat HEK293T-cellen op 6 poly-L-lysine gecoate platen van 15 cm bij 35% samenvloeiing in groeimedia (DMEM + 10% FBS + 1% Penicilline-Streptomycine-antibioticumoplossing (m/v)). Incubeer cellen 's nachts bij 37 °C, 5% CO2.
    2. Zodra de geplateerde cellen 70-80% samenvloeien en gelijkmatig verspreid zijn, vervang je groeimedia door 25 ml serum en antibioticavrije DMEM-media.
    3. Voeg tijdens het voeden langzaam media toe aan de zijkanten van kolven, omdat HEK293T- en 293NT-cellen gemakkelijk kunnen loskomen van weefselkweekplastic
  2. Bereid transfectiemix voor.
    1. Voeg 65 μg lentivirale verpakking plasmiden psPAX2, 43 μg VSV-G expresserende envelop plasmide pMD2.G, 65 μg sgRNA bibliotheek plasmide en 240 μL van 1 mg/ml polyethyleenimine (PEI) toe aan 6 ml DMEM en vortex.
      OPMERKING: Gebruik altijd een ongeopende of zeer recent geopende fles DMEM voor de transfectie, omdat de pH bij deze stap van cruciaal belang is en DMEM na verloop van tijd meer basis wordt na het openen.
    2. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Deze transfectiemix is voldoende voor cellen die zijn geplateerd op platen van 6 x 15 cm met een oppervlakte van 870 cm2. Schaal de transfectiemix volgens de vereisten van het experiment.
  3. Transfectie van virale verpakkingscellen.
    1. Na 15 minuten incubatie transfecteer elk van de 15 cm platen door 1 ml van het transfectiemengsel druppelgewijs door de plaat toe te voegen. Incubeer bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 8 uur.
    2. Verwijder na incubatie de serumvrije media die het transfectiemengsel bevatten en voeg 30 ml gewone kweekmedia toe aan de platen van 15 cm en kweek gedurende 48 uur bij 37 °C, 5% CO2.
  4. Verzamel na 48 uur het virale supernatant en filtreer door het PVDF-filter van 0,45 μm. Bewaar 1 ml van het virale supernatant en bewaar bij -80 °C voor kwaliteitscontrole en virale titering.
  5. Concentreer het virale supernatant door sucrose-gradiëntcentrifugatie in een snelle centrifuge met behulp van sw28 rotorkop.
    1. Prime ultracentrifuge buizen door ze te wassen met 70% ethanol, gevolgd door 3 spoelingen met PBS. Verdeel ongeveer 30 ml van het virale supernatant gelijkmatig over elk van de 6-ultracentrifugebuis.
    2. Pipetteer voorzichtig naar de bodem van elke buis 4 ml van de 20% sacharoseoplossing (20 g sacharose in 100 ml PBS). Plaats de zes ultracentrifugebuizen in de zes SW28 swing buckets en breng elk tegengesteld paar emmers precies in balans door virale supernatant toe te voegen of te verwijderen.
    3. Centrifugeer viraal supernatans bij 4 °C gedurende ten minste 2 uur en tot 4 uur bij 80.000 x g en 4 °C. Zodra de centrifugeren is voltooid, gooi je het supernatant voorzichtig weg.
    4. Giet het resterende supernatant af door ultracentrifugebuizen ondersteboven op steriel zacht keukenpapier te plaatsen gedurende ten minste 2 minuten en veeg eventuele druppels supernatant in de buis af met een zachte papieren handdoek om van elk restmedium af te komen. Een kleine grijswitte pellet kan zichtbaar zijn aan de onderkant van de buis.
    5. Voeg 20-25 μL koude, verse PBS toe aan elke buis. Sluit buizen af met paraffinefilm en incubeer buizen rechtop op ijs met zachtjes schudden op een orbitale platform shaker gedurende ~ 2 uur.
    6. Gebruik een pipet van 20 μL en verwijder de pellet van de eerste buis voorzichtig en zorg ervoor dat er geen bellen ontstaan. Breng het medium over naar de volgende buis en herhaal het proces totdat alle viruskorrels zijn losgemaakt en gecombineerd tot één buis van ongeveer 120-150 μL volume. Incubeer deze high-titer virale suspensie nog eens ~ 2 uur op ijs met zacht schudden.
    7. Breng de virale suspensie over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en draai de buis bij 4 °C in een gekoelde en voorgekoelde tafelcentrifuge van 12.000 x g gedurende 2 minuten. Aliquot het heldere virale supernatant zorgvuldig als 10 μL aliquots in afzonderlijke buizen van 0,2 ml en bewaren bij -80 °C. Gooi de pellet aan de onderkant van de buis weg, omdat dit de naald verstopt tijdens embryonale injecties.
  6. Titratie van gepoolde CRISPR lentivirusbibliotheek
    OPMERKING: De resulterende virale suspensie moet een geschatte concentratie van 2.000 keer en de resulterende virusoplossing opleveren en moet een virale titer van 107-10 9hebben, wat goed genoeg is voor meer dan 100 E9,5-operaties die hieronder worden beschreven.
    1. Zaad R26-Lox-STOP-Lox-tdTomato muis embryonale fibroblasten (MEF's) of R26-Lox-STOP-Lox-tdTomato primaire keratinocyten of een andere Cre-reporter cellijn in een 2 x 6 put plaat.
    2. Zodra de cel ~40% samenvloeiing bereikt, zijn cellen klaar voor transductie. Bepaal op dat moment het aantal cellen binnen één put om later de berekening van virale titer mogelijk te maken. Verander de media van de Cre-reporter cellen in groeimedia aangevuld met 10 μg/ml polybreen (=hexadimethrinebromide).
    3. Verdun 1 μL geconcentreerd virus met 2 ml groeimedia. Voeg 0, 10, 50, 200 μL verdunde virale suspensie en 50, 200 μL niet-geconcentreerd virus toe vanaf stap 2.4 en meng borden en incubeer 's nachts bij 37 °C, 5% CO2.
    4. Verwijder groeimedia die de volgende dag virus bevatten, was cellen met PBS en vervang door normale groeimedia. Het supernatant wordt op dit moment nog steeds beschouwd als viraal afval en moet worden verwijderd in overeenstemming met de institutionele BSL2-regelgeving.
    5. Beoordeel ongeveer 36-48 uur na transductie cre-gemedieerde recombinatie van de Lox-STOP-Lox cassette en expressie van tdTomato door FACS. Bereken virale titer. Bereken kolonievormende eenheden (kve)/ml met behulp van de volgende formule:
      figure-protocol-1
      OPMERKING: Vergelijking tussen de geconcentreerde virale suspensie met zijn niet-geconcentreerde virale supernatans zal het mogelijk maken om het succes van (1) virale productie en (2) virale concentratie te schatten. Als alternatief kan de virale titer worden geschat met behulp van qRT-PCR-methode10. Grootschalige productie en concentratie van lentivirus kan ook worden uitgevoerd met behulp van een concentratie in twee stappen met een patroonconcentratie gevolgd door ultracentrifugatie zoals eerder beschreven2.

3. Ultra-sound geleide chirurgie en injectie

OPMERKING: Deze technologie is aangepast van4,11. Micro-injection gericht op transductie van het oppervlakte-epitheel moet worden uitgevoerd op embryonale dag E9.5, wanneer het oppervlakte-ectoderm uit een enkele laag bestaat en vóór de vorming van het periderm vanaf E10, wat transductie van deze basale laag zou voorkomen. Zet bij voorkeur muizen op vrijdag, zodat de eerste mogelijke dag met E9.5 embryo's de volgende maandag is. Gebruik Rosa26-Lox-STOP-LOX-Cas9-GFP muizen (Jackson Laboratory #024857) voor optimale CRISPR/Cas9 efficiëntie12.

  1. Stel geschikte mannelijke en vrouwelijke muizen in voor getijde zwangerschappen 10 dagen voor de gewenste operatiedatum.
    1. Plug-check muizen in de volgende dagen om potentieel zwangere muizen te identificeren. Bevestig de zwangerschap de dag voor de geplande operatie (d.w.z. E8.5) met behulp van echografie.
  2. Bereid de aangepaste Petrischaal.
    1. Lijm met behulp van de dubbelzijdige plakband het siliconenmembraan op de bodem van de Petrischaal die de ronde opening bedekt. Knip met een scherpe schaar een ovale opening van 2 x 10 mm in het siliconenmembraan.
  3. Voorbereiding van het micro-injectiesysteem
    1. Bereid injectienaalden van een dikwandig glazen capillair met behulp van een micropipettrekker met de volgende instellingen: Druk = 200; Warmte = 769; Trekken = 0; Snelheid = 140; Tijd = 100.
    2. Gebruik een fijne schaar om de naaldpunt af te snijden op het niveau waar de diameter ~ 30 μm is. Schuinen van de naald met naaldslijpmiddel tot 20° op een fijnwaardige schuurplaat met regelmatige bevochtiging gedurende 20 min.
    3. Steriliseer de micro-injectienaald door 70% ethanol te duwen met een spuit van 10 ml met een naald van 26 G1/2. Vul de micro-injectienaald op met een spuit van 10 ml en een naald van 26 G1/2, geladen met minerale olie. Zorg ervoor dat er geen bellen in de micro-injectienaald zitten.
    4. Monteer de micro-injectornaald op de micromanipulator volgens de instructies van de fabrikant.
  4. Laad de naald met virale sgRNA-bibliotheek.
    1. Pipet 10 μL virale suspensie op een parafilm bevestigd op een vlak oppervlak.
    2. Verdrijf de minerale olie met behulp van micromanipulator. De aanwezigheid van een klein volume olie in de naald voorkomt dat het lentivirus in contact komt met de zuiger. Laad ongeveer 4-5 μL virale suspensie door langzame aspiratie zonder luchtbellen.
  5. Verdoof zwangere muis met behulp van isofluraan inductiekamer. Zet de zuurstofregelaar op 1 L/min en isofluraan vaporizer op 2%. Om te bepalen of het dier verdoofd is, controleert u na ~ 3-5 minuten in de isofluraaninductiekamer.
  6. Plaats de verdoofde dierlijke ventrale kant omhoog in de verwarmde operatiefase (40 °C) en breng operatietapes aan om de poten op hun plaats te houden met de neuskegel anesthesiebuis voor constante toevoer van isofluraan en zuurstof totdat de operatie is voltooid.
  7. Bevestig de zwangerschap van E9.5 als dit niet is gebeurd bij E8.5.
    1. Breng een kleine hoeveelheid (~ 1/2 theelepel) van een ontharingscrème aan op de buik en verdeel deze over een gebied van 3 x 3 cm met behulp van een applicator met katoenen punt.
    2. Verwijder na 2-3 minuten de crème voorzichtig met gaas of tissue en veeg het gebied schoon met PBS en 70% ethanol.
    3. Controleer met behulp van de ultrasone sonde en gel de zwangere muis op embryonale dag E9.5. Let op, dit kan ook de dag ervoor op E8.5 worden gedaan om tijd te besparen op de eigenlijke operatiedag.
    4. Verwijder ultrasone gel en veeg het gebied schoon met BPS en vervolgens 70% ethanol om te desinfecteren.
  8. Injecteer 0,02 cc Buprenorfine analgeticum subcutaan in de muizendam.
  9. De baarmoeder operatief blootstellen
    1. Maak met behulp van steriele tang en schaar een verticale incisie van ~ 2 cm in de huid van de muis.
    2. Gebruik stompe tangen scheiden de huid rond de incisie van het buikvlies.
    3. Snijd met behulp van een steriele tang en schaar door het buikvlies.
    4. Trek met een stompe tang voorzichtig de linker- en rechter baarmoederhoorn eruit en tel de embryo's.
    5. Plaats de meeste baarmoederhoorns opnieuw, maar laat het distale uiteinde van één baarmoederhoorn met 3 embryo's bloot.
    6. Duw en trek met een stompe tang de baarmoeder met de 3 embryo's voorzichtig door de opening in het siliconenmembraan van de gemodificeerde petrischaal.
    7. Stabiliseer de Petrischaal met behulp van blokjes boetseerklei.
  10. Stabiliseer de baarmoeder met de drie embryo's in de petrischaal met behulp van een siliconen mal. Maak de siliconenplug aan de zijkant van de embryo's plat met een scherp mes.
  11. Vul de Petrischaal met steriel PBS. Spoel het siliciummembraan op de bodem van de Petrischaal met de buik van de zwangere moeder, waardoor lekkage wordt voorkomen.
  12. Beweeg de echokop in de Petrischaal ~ 0,5 cm bovenop het bovenste embryo en pas het stadium aan zodat de vruchtholte duidelijk zichtbaar wordt in het echografiebeeld.
  13. Lijn de injectornaald voorzichtig uit in de gemodificeerde petrischaal. Plaats met behulp van de micromanipulator de punt van de naald binnen ~ 5 mm van het bovenste embryo. Schakel vervolgens de naald heen en weer en ga naar het vlak waar de punt het helderst in het echografiebeeld verschijnt.
  14. Duw met behulp van de micromanipulator de naald door de baarmoederwand in de vruchtholte.
  15. Injecteer lentivirus met sgRNA-bibliotheek.
    1. Programmeer de injector vooraf op 62 nL en de langzame injectiesnelheid. De micro-injectie kan worden geprogrammeerd om specifieke volumes met een langzame of hoge snelheid te injecteren.
    2. Druk 8 keer op de injecteerknop voor een totaal van 496 nL per embryo. Pas het volume aan de vereiste behoeften en virale titer aan. Een virale titer van 1 x 108 pfu/ml en 496 nL injectievolume zal resulteren in ongeveer 30% infectiviteit.
    3. Herhaal dezelfde procedure voor andere twee embryo's.
    4. Til de ultrasone klankkop op en verwijder de siliconenplug.
    5. Duw de 3 embryo's voorzichtig in de buik van de muis met behulp van een steriele katoenen swap.
    6. Trek voorzichtig de volgende 3 embryo's eruit en herhaal de injectieprocedure totdat het gewenste aantal embryo's is geïnjecteerd.
      OPMERKING: Niet meer dan 30 minuten anesthesie, omdat zwangere moeders veel meer kans hebben om hun embryo's na die tijd te aborteren. Een ervaren chirurg kan tot 12 embryo's injecteren binnen 30 minuten chirurgie.
  16. Til de ultrasone klankkop op, verwijder de micromanipulator met de naald, aspireer de PBS en verwijder de petrischaal. Absorbeer met steriele doekjes pbs die zich mogelijk in de buikholte hebben opgehoopt.
  17. Sluit de peritoneale incisie met behulp van absorbeerbare hechtingen. Gebruik twee nietjes om de incisie in de buikhuid te sluiten.
    OPMERKING: Tijdens het uitvoeren van ultrageluidgeleide operaties in utero-operaties moet de grootst mogelijke zorg worden besteed aan het handhaven van een schone omgeving, het zoveel mogelijk handhaven van steriliteit en het vermijden van mogelijke verontreinigingen. Als er meer dan één operatie op dezelfde dag moet worden uitgevoerd, is het belangrijk om de dissectie-instrumenten te steriliseren met behulp van een kraalsterilisator en andere apparaten te reinigen die muisweefsel tegenkomen dat is gereinigd met ethanol. Dit verhoogt de hogere overleving van de embryo's na de operatie aanzienlijk. De overlevingskans voor de hier beschreven operatiemethode ligt consistent tussen de 80-100%.
  18. Na de operatie.
    1. Laat het zwangere vrouwtje herstellen in een verwarmde kooi en observeer gedurende 15-30 minuten.
    2. Controleer het vaginale kanaal op bloed, wat een vroeg teken is van abortus en complicaties. Voor postoperatieve pijnverlichting, lever het analgeticum twee keer per dag toe gedurende twee dagen na de operatie.
  19. Identificeer getransduceerde embryo's/pasgeboren Rosa26-Lox-STOP-Lox-Cas9-GFP muizen met behulp van een fluorescerende ontledingsmicroscoop, een fluorescerende eiwit zaklamp en filterbril of door genotypering voor geïntegreerde virale deeltjes in oor- of staartclips.
    OPMERKING: Muizen kunnen het beste worden geïdentificeerd met behulp van een fluorescerende microscoop tot postnatale dag 3 voordat het haar begint te groeien.
  20. Om voldoende dekking voor de CRISPR-bibliotheek te garanderen, berekent u de dekking op basis van de volgende parameters: E9.5 muisoppervlak ectoderm bestaat uit ~ 150.000 cellen; transductie van ~20% resulteert in een minimale dubbele infectie tarief (~ 1/10 dubbele geïnfecteerde cellen)4,5,11; bij 20% infectiviteit heeft elk embryo 30.000 geïnfecteerde cellen. Zorg ervoor dat ten minste 100 afzonderlijke cellen worden getransduceerd met een bepaald sgRNA. Een pool van 2000 sgRNAs vereist bijvoorbeeld 2 x 105 cellen of 6-7 dieren.

4. Diepe sequencing procedure

  1. Op een experimenteel eindpunt zoals tumorvorming of een ander fenotype offert u de muis op en oogst u het weefsel van belang. Gebruik bloed- en weefsel-DNA-extractiekit om genomisch DNA te zuiveren volgens het protocol van de fabrikant. Voordat u begint met DNA-extractie uit tumoren, reinigt u de werkbank met DNA Erase en werkt u weg van het laboratoriumgebied waar plasmiden worden behandeld.
    OPMERKING: Het is belangrijk om een referentiemonster te genereren om sgRNA-vouwveranderingen in de loop van de tijd te kunnen berekenen. Transgetransduceerde embryo's 3 dagen na infectie of getransduceerde cellen (zie stap 2. 6) kunnen dienen als referentiemonster om de sgRNA-representatie in de oorspronkelijke bibliotheek te bepalen.
  2. Gebruik 100 ng – 1,5 μg genomisch DNA als sjabloon in een 50 μL pre-amplificatie PCR 1-reactie met behulp van de buitenste primers vermeld in tabel 1 en het PCR-programma beschreven in tabel 2. Stel voldoende reactie in om de gewenste dekking op te leveren.
    OPMERKING: Stel de barcoding PCR-reactie in in een apart speciaal gedeelte van het lab of in een weefselkweekkap die grondig wordt gereinigd door DNA-wissen om besmetting te voorkomen. Voer negatieve controle uit voor elke PCR-plaat met water als sjabloon om ervoor te zorgen dat er geen verontreiniging is.
  3. Pool alle PCR 1-reactie en voer 20 μL uit op een 1,5% controle-agarosegel om een succesvolle versterking van een 600 bp-band te verifiëren.
  4. Gebruik 5 μL van de gepoolde PCR1-reactie als sjabloon in een 50 μL PCR 2-reactie met behulp van een unieke barcode-primercombinatie vermeld in tabel 3 en het PCR-programma beschreven in tabel 4. Voer 50 μL PCR 2-reactie uit op een 2% agarosegel en zuiver de 200bp-band met behulp van een gelextractiekit volgens de instructies van de fabrikant.
    OPMERKING: De voorversterkingsstap is alleen nodig voor de versterking van een complex transgetransduceerd weefsel. Als het versterken van een enkele tumor die zich vermoedelijk heeft ontwikkeld een klonale cel vormt en dus slechts één sgRNA bevat, kan men de pre-amplificatie PCR1 overslaan en meteen doorgaan met PCR2.
  5. Kwantificeer de DNA-concentratie met behulp van fluorometrische kwantificering en stuur voor diepe sequencing naar de sequencingfaciliteit (bijv. 1 miljoen aflezingen per tumor).
  6. Gebruik Bowtie v1.2.3, die alleen niet-uitgelijnde uitlijningen toestaat, lijn gesequentieerde leesten uit naar sgRNA-bibliotheek13. Maak een bowtie-index met behulp van bowtie-build commando dat de sgRNA-sequenties in fasta-indeling invoert. Breng de leesopties in kaart met de opdracht bowtie met opties -m 2 -v 1, waarmee maximaal twee mismatches mogelijk zijn tijdens het uitlijnen van de leesuitlijning en leesopties worden verwijderd die meer dan één sgRNA-reeks van de bibliotheek uitlijnen. Doorgaans wordt meer dan 80% van de leesingen uitgelijnd onder deze parameters.
  7. Gebruik de opdracht MAGeCK count om de tabel read count te verkrijgen met behulp van het uitgelijnde bestand als invoer14. sgRNA-tellingstabel kan worden gebruikt voor downstreamanalyse, zoals het bepalen van de differentiële sgRNA's (MAGeCK) en het vinden van essentiële genen (BAGEL).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 1A toont het ontwerp van de oligonucleotiden voor het op een kosteneffectieve manier multiplexen van verschillende aangepaste CRISPR-bibliotheken in een enkele oligochip van 12k of 92k. Zodra de sgRNAs (blauwe kleur gecodeerd) zijn geselecteerd, worden de oligonucleotiden ontworpen met beperkingsplaatsen (oranje gekleurde BsmBI) en bibliotheekspecifieke PCR-primerparen (groene kleur gecodeerd). Verschillende bibliotheken kunnen worden ontworpen met behulp van een unieke combinatie van...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRISPR/Cas9 genoombewerking is veel gebruikt in in vitro en in vivo studies om genfuncties en cellulaire processen te onderzoeken. De meeste in vivo studies maken gebruik van CRISPR/Cas9 gen bewerkte cellen geënt in een diermodel (allograft of xenograft). Hoewel dit een krachtig hulpmiddel is om kankergenetica en cellulaire functies te bestuderen, mist het nog steeds het micromilieu van het inheemse weefsel en kan het wond- en / of immuunreacties opwekken.

Om deze uitdagingen het hoofd te bied...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door een projectsubsidie van het Canadian Institute of Health Research (CIHR 365252), de Krembil Foundation en het Ontario Research Fund Research Excellence Round 8 (RE08-065). Sampath Kumar Loganathan is de ontvanger van een Canadian Cancer Society fellowship (BC-F-16#31919).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.45 micron filterSigmaS2HVU02RE
12k or 92k oligo chipCustomarray Inc. (Genscript)
15 cm cell culture platesCorning
293FTInvitrogenR70007
293NTSystems BiosciencesLV900A-1
Alkaline phosphataseNEBM0290L
AmplicillinFisher ScientificBP1760-25
ATPNEB9804S
BsmBINEBR0580L
Chromic gut sutureCovidien
Deep sequencing (Next-Seq or Hi-Seq)Illumina
DNA-cleanup kitZymo ResearchD4008
DNAesy Blood and Tissue DNA extraction kitQiagen69506
Endura electrocompetent cellsLucigen60242-1
Glass CapillariesDrummond3-000-203-G/X
HEK293T cellsATCCCRL-3216
High-Speed CentrifugeBeckman CoulterMLS-50
LB AgarWisent Technologies800-011-LG
Micropipette pullerSutter InstrumentP97
Mineral oilSigmaM5904
Mini-prep plasmid KitFrogga BioPDH300
Mouse oxygen anaesthesia systemVisual Sonics
Nanoject II micromanipulatorDrummond
NEBuffer 3.1 (Buffer for BsmBI)NEBR0580L
Needle sharpenerSutter InstrumentBV-10
Oligo cleanup kitZymo researchD4060
PAGE purified illumina sequencing primerIDT DNA
PEI (polyethyleneimine)Sigma408727-100ML
Permoplast modeling clay
Petridish with central openingVisual Sonics
pMD2.GAddgene12259
psPAX2Addgene12260
Q5 Polymerase 2x Master mixNEBM0494L
Qubit Fluorometric QuantificationInvitrogenQ33327
Semicircular Silicone plugCorning
Silicone membraneVisual Sonics
T4 DNA ligaseNEBM0202L
Ultra-centrifuge tubesBeckman Coulter344058
Vevo2000 ultrasound systemVisual Sonics

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beronja, S., Fuchs, E. RNAi-mediated gene function analysis in skin. Methods in Molecular Biology. 961, 351-361 (2013).
  2. Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos. Nature Medicine. 16, 821-827 (2010).
  3. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343, 84-87 (2014).
  4. Beronja, S., et al. RNAi screens in mice identify physiological regulators of oncogenic growth. Nature. 501, 185-190 (2013).
  5. Loganathan, S. K., et al. Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling. Science. 367, 1264-1269 (2020).
  6. Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18, 269-282 (2018).
  7. Green, A. C., Olsen, C. M. Cutaneous squamous cell carcinoma: an epidemiological review. British Journal of Dermatology. 177, 373-381 (2017).
  8. Campbell, J. D., et al. pathway network, and immunologic features distinguishing squamous carcinomas. Cell Reports. 23, 194-212 (2018).
  9. Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11, 783-784 (2014).
  10. Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnology. 6, 34(2006).
  11. Schramek, D., et al. Direct in vivo RNAi screen unveils myosin IIa as a tumor suppressor of squamous cell carcinomas. Science. 343, 309-313 (2014).
  12. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159, 440-455 (2014).
  13. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, 25(2009).
  14. Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens. Genome Biology. 15, 554(2014).
  15. Winters, I. P., Murray, C. W., Winslow, M. M. Towards quantitative and multiplexed in vivo functional cancer genomics. Nature Reviews Genetics. 19, 741-755 (2018).
  16. Rogers, Z. N., et al. Mapping the in vivo fitness landscape of lung adenocarcinoma tumor suppression in mice. Nature Genetics. 50, 483-486 (2018).
  17. Chow, R. D., et al. AAV-mediated direct in vivo CRISPR screen identifies functional suppressors in glioblastoma. Nature Neuroscience. 20, 1329-1341 (2017).
  18. Wang, G., et al. Mapping a functional cancer genome atlas of tumor suppressors in mouse liver using AAV-CRISPR–mediated direct in vivo screening. Science Advances. 4, 5508(2018).
  19. Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K. R., Mero, P., Moffat, J. Pooled CRISPR-based genetic screens in mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (151), e59780(2019).
  20. Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163, 1515-1526 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

In Vivo CRISPR ScreenCRISPR Cas9 KnockoutMouse Skin EpitheliumOral Cavity TissueTumor Suppressor GenesUltrasound Guided InjectionLentiviral sgRNA LibraryEmbryonic Day 9 5Single Cell RNA SequencingHead and Neck Cancer

Gerelateerde artikelen