We presenteren een methode voor het creëren van een 3D-celkweekomgeving, die kan worden gebruikt om het belang van cel/matrix-interacties bij de progressie van kanker te onderzoeken. Met behulp van een eenvoudig zelfassemblerend octapeptide kan de matrix rond ingekapselde cellen worden gecontroleerd, met onafhankelijke regulatie van mechanische en biochemische signalen.
Methodenartikel
Bereiding van een door de gebruiker gedefinieerde peptidegel voor gecontroleerde 3D-kweekmodellen van kanker en ziekte
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Er is een groeiend besef dat cellen die in 3D worden gekweekt beter in vivo gedrag modelleren dan cellen die in 2D worden gekweekt. In dit protocol beschrijven we een eenvoudige en afstembare 3D-hydrogel, geschikt voor het kweken van cellen en weefsel in een omgeving die past bij hun oorspronkelijke omgeving. Dit is vooral belangrijk voor onderzoekers die onderzoek doen naar het ontstaan, de groei en de behandeling van kanker, waarbij de interactie tussen cellen en hun lokale extracellulaire matrix een fundamenteel onderdeel van het model is. De overstap naar een 3D-cultuur kan een uitdaging zijn en gaat vaak gepaard met een gebrek aan reproduceerbaarheid als gevolg van de grote variatie van batch tot batch in 3D-cultuurmatrices van dierlijke oorsprong. Evenzo kunnen hanteringsproblemen het nut van synthetische hydrogels beperken. Als antwoord op deze behoefte hebben we een eenvoudige, zelfassemblerende peptidegel geoptimaliseerd om de kweek van relevante cellijnmodellen van kanker en ziekten mogelijk te maken, evenals van patiënten afgeleide weefsels/cellen. De gel zelf is vrij van matrixcomponenten, met uitzondering van de componenten die tijdens de inkapseling zijn toegevoegd of door de ingekapselde cellen in de gel zijn afgezet. De mechanische eigenschappen van de hydrogels kunnen ook onafhankelijk van de toevoeging van de matrix worden gewijzigd. Het fungeert daarom als een 'onbeschreven blad' waarmee onderzoekers een 3D-kweekomgeving kunnen bouwen die het doelweefsel van belang weerspiegelt en de invloeden van mechanische krachten en/of biochemische controle van celgedrag onafhankelijk kunnen ontleden.
Inleiding
De vele rollen die de extracellulaire omgeving speelt bij de ontwikkeling en progressie van kanker worden steeds duidelijker1. Onlangs hebben gedetailleerde proteomische analyses bijgedragen aan een toch al overtuigende literatuurbasis, die aantoont dat matrixcomponenten afgeleid van kanker-geassocieerde stromale cellen, of de kankercellen zelf, sleutelfactoren zijn bij gebeurtenissen zoals de bevordering van epitheliale mesenchymale overgang en metastatische verspreiding 2,3,4. Gezien het erkende belang van de extracellulaire matrix (ECM), wordt het van cruciaal belang om over te stappen op celkweekplatforms die controle mogelijk maken over de 3D-omgeving die aan cellen wordt gepresenteerd. Als antwoord op deze behoefte presenteert dit protocol een methode voor celinkapseling en -kweek in een 3D-hydrogel, met door de gebruiker gedefinieerde ECM-samenstelling en mechanische eigenschappen5.
Momenteel is er een slechte correlatie tussen de therapeutische werkzaamheid van kanker in 2D in vitro cultuur, de impact van deze therapieën in de huidige in vivo (patiënt-afgeleide xenotransplantaat, PDX) modellen en hun uiteindelijke activiteit in klinische onderzoeken 6,7. Dit heeft geleid tot aanzienlijke mislukkingen in de pijplijn voor het ontdekken van geneesmiddelen met een dringende behoefte aan verbeterde in-vitromodellen waarmee geteste therapieën 'vroeg falen, goedkoop falen'. Veel onderzoekers gebruiken het van muizenmastocytoom afgeleide product, bijvoorbeeld Matrigel (of vergelijkbare producten) om 3D-matrixrijke omgevingen te creëren om te groeien en celgedrag in vitro te observeren, inclusief PDX-afgeleide en andere cellen die dicht bij de patiënt staan 8,9,10. Deze 'one size fits all'-benadering negeert echter de complexe rol die matrixeiwitten/glycanen spelen bij het ontstaan en de progressie van kanker.
Erkenning van de rol van extracellulaire matrix (ECM) bij de controle van celgedrag heeft ook het gebruik van 3D-cultuur in of op hydrogels die zijn samengesteld uit specifieke matrixcomponentenaangemoedigd 11. Hoewel dit nuttig is voor het onderzoeken van specifieke interacties, lijden deze systemen onder het onvermogen om mechanische en biochemische instructies tussen cellen en matrix te scheiden. Ze kunnen ook moeilijk te hanteren zijn en kunnen onduidelijke uitlezingen van het celgedrag geven. Collageengels zijn een belangrijk voorbeeld van dit probleem, aangezien celgemedieerde gelcontractie het vermogen om cellen in de gel te visualiseren drastisch kan verminderen5. Er zijn ook enkele zeer elegante, uit meerdere componenten bestaande gelsystemen, die experts met groot succes hebben gebruikt 12,13,14. Deze kunnen enzymgevoelige linkers en bio-actieve motieven bevatten, maar zijn aanzienlijk complexer in hun formulering en toepassing dan het hier beschreven systeem.
Dit protocol beschrijft een methode voor het maken van volledig gedefinieerde 3D-cultuurmodellen, waarmee de rol van de ECM in ontwikkeling en ziekte in vitro kan worden gemodelleerd. De basis van het 3D-model is een peptidegel, die we eerder hebben beschreven als een optimalisatie van een eenvoudige zelfassemblerende octapeptide-hydrogel 5,15,16. Door af te stappen van complexe, van dieren afgeleide matrices biedt dit systeem een aanzienlijk voordeel van verbeterde batch-tot-batch consistentie en verbeterde verwerking. In zijn eenvoudige staat bevat het peptide geen van de matrix afgeleide motieven en biedt het in feite een 'schone lei' waarop de gebruiker functionaliteit kan bouwen.
We tonen aan hoe de mechanische eigenschappen van de peptidegel onafhankelijk kunnen worden gereguleerd, naast de incorporatie van matrixeiwitten/glycanen. Het systeem is in hoge mate afstembaar, waardoor een reeks celtypen in verschillende formaten kan worden ingekapseld. Belangrijk voor het bouwen van een kankermodel is dat stromale cellen ook kunnen worden opgenomen: in directe co-cultuur of gescheiden om specifieke analyse van indirecte kankercel-stroma-interacties mogelijk te maken. Het belangrijkste is dat het hier beschreven protocol geen complexe kennis van chemie vereist en in elk celkweeklaboratorium kan worden gereproduceerd zonder dat er gespecialiseerde chemische kennis of apparatuur nodig is.
We hebben geoptimaliseerde methoden voor de studie van het celgedrag in de peptidegels, waaronder beeldvorming, reologische analyse, extractie van materiaal voor PCR5 en inbedding voor histologische beoordeling. Een duidelijk voordeel van het eenvoudige hydrogelsysteem is de mogelijkheid om de matrix die door ingekapselde cellen wordt afgezet, te visualiseren en te bestuderen. Het belang van cel-afgeleide matrices en de voordelen van een beter begrip van hoe cellen hun lokale micro-omgeving herontwerpen, werd onlangs benadrukt17 en weerspiegelt een groeiend bewustzijn van het belang van het vangen van door cellen uitgescheiden matrixcomponenten, op een vergelijkbare manier als in vivo. Het benutten van het vermogen om dergelijke processen te modelleren kan een van de fundamentele drijfveren zijn van de verbeterde relevantie voor de patiënt van op hydrogel gebaseerde ziektemodellen.
Protocol
1. Oplossen van peptide
- Voeg in een weefselkweekkap 800 μL steriel water toe aan een tube van 15 ml met behulp van een P1000 pipet.
- Weeg het peptidepoeder met een fijne balans af in een niet-statische weegboot. Gebruik een massa (in mg) van 1,25x de gewenste uiteindelijke peptidegelconcentratie (in mg/ml, tabel 1).
OPMERKING: De hier beschreven methode produceert een volume van ongeveer 1,25 ml peptidegel per tube op het punt van de uiteindelijke geleering. Er kunnen meerdere buizen tegelijk worden bereid, of als alternatief kan het volume per buis worden verhoogd wanneer de gebruiker ervaring heeft met de gepresenteerde methode.
| Peptideconcentratie (na uiteindelijke geleering) | Massa peptide | Eerste NaOH-toevoeging |
| 6 mg/ml | 7,5 mg | 30 μL |
| 10 mg/ml | 12,5 mg | 60 μL |
| 15 mg/ml | 18,75 mg | 100 μL |
Tabel 1: Peptidemassa en voorgestelde initiële NaOH-toevoeging voor typische uiteindelijke gelconcentraties. De vermelde peptideconcentraties kunnen in beide richtingen worden uitgebreid, maar het is waarschijnlijker dat lagere peptideconcentraties geen stabiele gels vormen, terwijl bij hoge concentraties de resulterende gel te dicht kan zijn om voldoende uitwisseling van voedingsstoffen en cellevensvatbaarheid mogelijk te maken. De juiste concentratie vereist optimalisatie voor verschillende celtypen en peptidebatches.
- Voeg de afgewogen peptide toe aan de tube van 15 ml. Beweeg met de weegboot om ervoor te zorgen dat er geen poeder achterblijft.
OPMERKING: Het peptidepoeder kan erg statisch zijn, zorg ervoor dat het verlies van poeder tot een minimum wordt beperkt. Het is niet nodig om steriele omstandigheden te handhaven tijdens de stappen 1.2 en 1.3 (of voor pH-metingen), aangezien sterilisatie plaatsvindt tijdens de incubatie bij 80 °C later in het proces. - Vortex gedurende 3 min, centrifugeer vervolgens 3 minuten op 200 x g .
- Incubeer de peptideoplossing in een oven op 80 °C gedurende ten minste 2 uur. Als er na incubatie onopgelost peptide aanwezig is, herhaal dan stap 1.4.
OPMERKING: Omdat een gelijkmatige verwarming essentieel is, is een heatblock niet geschikt voor deze stap. We hebben echter ontdekt dat hybridisatieovens goed werken, net als een waterbad, zolang de peptide-oplossing volledig is ondergedompeld.
2. Vorming van gelprecursoren
- Bereid een steriele 0,5 M natriumhydroxide (NaOH)-oplossing met steriel water.
OPMERKING: Vers verdunde NaOH-oplossing wordt aanbevolen voor de meest consistente resultaten. - Voeg in een weefselkweekkap 0,5 M NaOH toe aan het midden van het opgeloste peptide en meng door langzaam te roeren met de pipetpunt (tabel 1).
- Draai de buis gedurende 10 s en centrifugeer op 200 x g gedurende 10 s om luchtbellen te verwijderen.
- Als de gelprecursor troebel is, herhaalt u stap 2.2 en 2.3 en voegt u stappen van 5 μl NaOH toe.
OPMERKING: pH-meting kan helpen bepalen of er voldoende NaOH is toegevoegd: de optimale pH ligt tussen 9-10,5 en het verdient de voorkeur dit niet te overschrijden, omdat het gebruik van zuren om de pH weer te verlagen kan leiden tot gelinhomogeniteit. Het precieze volume NaOH dat nodig is, kan variëren afhankelijk van de peptidebron. - Zodra de gelprecursor optisch helder en zelfdragend is (of nog maar net vloeit) bij inversie van de tube van 15 ml, voegt u 100 μl steriel 10x PBS toe in een weefselkweekkap. Vortex gedurende 10 s en centrifugeren op 200 x g gedurende 10 s.
OPMERKING: Als de gelprecursor troebel is, herhaalt u stap 2.4 totdat deze helder en halfvast wordt. Als de gelprecursor vloeibaar is (boven pH ~10,5), vormt deze geen stabiele gel en moet deze worden weggegooid. - Incubeer een nacht in een oven bij 80 °C.
- Controleer de gelprecursor visueel om er zeker van te zijn dat deze volledig vloeibaar is bij 80 °C.
- Als de gelprecursor bij 80 °C niet volledig vloeibaar is of niet voldoende is geneutraliseerd, voeg dan NaOH toe na stap 2.4.
- Als de gelprecursor vloeibaar is, maar er luchtbellen of kleine neerslag aanwezig zijn, tik dan scherp op de tube om ze te verspreiden. Als er luchtbellen of neerslag aanhouden na het tikken van de buis, draai dan de gelprecursor en centrifugeer op 200 x g gedurende elk 10 s.
- Na het volgen van een van de stappen 2.7.1 of 2.7.2 worden de precursorgels nog 2 uur bij 80 °C geïncubeerd alvorens over te gaan tot de definitieve geleering.
- Bewaar de gelprecursoren op 80 °C tot ze nodig zijn (maximaal 48 uur).
LET OP: Het protocol kan hier gepauzeerd worden, bewaar gel precursoren maximaal 4 weken bij 4 °C. Als u vanaf dit pauzepunt opnieuw begint, incubeer dan de gelprecursoren gedurende ten minste 2 uur bij 80 °C en start u opnieuw vanaf stap 2.7. Het wordt sterk aanbevolen om gelprecursoren ruim voordat ze nodig zijn voor de uiteindelijke geleering te bereiden, om ervoor te zorgen dat er voldoende tijd is voor de bovenstaande aanpassingen indien nodig.
3. Voorbereiding van matrixcomponenten voor zaaien
OPMERKING: Een voorbeeldberekening voor stap 3-5 wordt weergegeven in afbeelding 1. Stap 3 en stap 4 kunnen worden weggelaten om respectievelijk een matrixvrije en/of een celvrije gel te produceren.
- Bereken het totale gecombineerde volume van cellen, matrix en media dat nodig is voor het zaaien, waarbij 250 μL kan worden toegevoegd aan elke 1 ml precursorgel. Vermenigvuldig dit volume met 1,1 om rekening te houden met pipetteerfouten. Dit is het zaaivolume, VS.
- Bereken voor elke matrixcomponent het volume van de stamoplossing dat aan het zaaivolume moet worden toegevoegd met behulp van vergelijking 1:
(1)
OPMERKING: VS komt overeen met het totale volume zaaimedium dat nodig is voor het zaaien van alle gels (stap 3.1). Zorg ervoor dat de som van alle volumes van matrixcomponenten niet groter is dan VS. - Ontdooi alle matrixcomponenten grondig (raadpleeg de instructies van de fabrikant) en bewaar ze op ijs tot ze nodig zijn.
OPMERKING: Sommige matrixcomponenten zijn erg gevoelig voor gelering. Raadpleeg de instructies van de fabrikant om dit te voorkomen. - Als een zure collageenstockoplossing moet worden toegevoegd die moet worden geneutraliseerd (raadpleeg de instructies van de fabrikant), bereid de neutralisatieoplossing dan als volgt:
- Bereken het benodigde volume collageenvoorraadoplossing, VC, met behulp van vergelijking 1.
- Bepaal een geschikt volume voor de neutralisatieoplossing, VN. Dit moet zo worden gekozen dat het gecombineerde volume van alle matrixtoevoegingen niet groter is dan het zaaivolume, VS.
OPMERKING: Over het algemeen is een verstandige waarde voor VN = 2 x Vc, maar dit kan worden aangepast aan het aantal en het volume van andere matrixcomponenten die moeten worden toegevoegd. - Bereken het volume van 1 M NaOH dat nodig is voor neutralisatie met behulp van vergelijking 2.
(2) - Bereken het volume van 10x PBS dat nodig is in de neutralisatieoplossing met behulp van vergelijking 3.
(3) - Combineer de berekende volumes van 1 M NaOH en 10x PBS en vul vervolgens aan tot VN met steriel water. Meng goed en bewaar op ijs tot het nodig is.
OPMERKING: Voeg het zure collageen op dit punt niet toe. Voortijdige vermenging van het collageen met de neutralisatieoplossing zal leiden tot het starten van collageenfibrillogenese, wat inconsistentie kan veroorzaken in de eigenschappen van de uiteindelijke peptidegel.
4. Voorbereiding van cellen voor het zaaien
- Als het nog niet is voltooid, bereken dan het zaaivolume, VS volgens stap 3.1.
- Bereken de celdichtheid die nodig is in deze celsuspensie door de gewenste celdichtheid in de uiteindelijke peptidegel te nemen en te vermenigvuldigen met 5.
OPMERKING: De celsuspensie is 5x de gewenste eindconcentratie om rekening te houden met verdunning bij menging met de gelprecursor. De celdichtheid moet worden geoptimaliseerd voor elke nieuwe cellijn die wordt overwogen. Afhankelijk van het celtype kunnen dichtheden tussen 1 x 104 en 1 x 106 cellen/ml in de uiteindelijke peptidegel geschikt zijn. - Bereken het totale aantal cellen dat nodig is voor het zaaien (vermenigvuldig de celdichtheid met het zaaivolume VS berekend in stap 4.1.).
- Bereid met behulp van de standaard kweek-/passagemethoden voor de gebruikte cellen een celpellet voor die de vereiste hoeveelheid cellen bevat, zoals berekend in stap 4.3.
5. Uiteindelijke gelering/celinkapseling
- Wanneer u klaar bent om met de laatste geleering te beginnen, brengt u de gelprecursoren uit de oven van 80 °C over in een waterbad van 37 °C.
OPMERKING: De gelprecursoren moeten zelfdragend zijn bij 37 °C. Als ze vloeibaar zijn, is het onwaarschijnlijk dat volledige geling zal optreden en moeten de gelprecursoren worden weggegooid. - Bereid een plaat met 96 putjes voor, of als alternatief een plaat met 24 putjes (of iets dergelijks) met celkweekinzetstukken.
OPMERKING: Zorg ervoor dat er een opening is tussen de basis van het inzetstuk en de putplaat bij het plateren van peptidegels in inzetstukken met 24 putjes. Dit zorgt ervoor dat de gel in contact komt met media. - Als matrix moet worden toegevoegd, combineer dan alle matrixcomponenten en neutralisatieoplossingen (stap 3). Vul aan tot VS (stap 3.1) met behulp van celkweekmedium en meng grondig. Als er cellen moeten worden toegevoegd, suspendeer dan de celpellet die in stap 4 is bereid met het zaaivolume VS.
OPMERKING: Als er in stap 3 geen matrixcomponenten zijn voorbereid, gebruik dan het celkweekmedium voor het zaaivolume. Dit is over het algemeen het standaard kweekmedium voor het gebruikte celtype, hoewel dit mogelijk moet worden gevalideerd als een mengsel van celtypen wordt gebruikt. - Voeg met behulp van een P1000-pipet voorzichtig 250 μL van het cel/matrixmengsel toe aan de gelprecursor.
OPMERKING: Matrixcomponenten, met name basaalmembraanextract, kunnen beginnen te polymeriseren zodra ze aan de gelprecursor zijn toegevoegd. Het is daarom belangrijk om zo snel mogelijk over te gaan naar de volgende stap. - Meng voorzichtig door de gecombineerde werking van pipetteren en roeren. De gel is dunner door afschuiving, dus het wordt gemakkelijker te mengen door voorzichtig te pipetteren/roeren. Als het goed gemengd is, voeg dan 100 μL toe aan elk putje van een plaat met 96 putjes, of 200 μL aan elke celkweekinsert.
OPMERKING: Bij het mengen kan omgekeerd pipetteren met een P1000 ingesteld op 200 μl nuttig zijn om het introduceren van luchtbellen te voorkomen. De gel kan in het begin moeilijk te mengen zijn, maar als je verder mengt, zou het gemakkelijker moeten worden - dit geeft aan dat het mengen efficiënt is. - Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 °C in 5% CO2 en een bevochtigde atmosfeer.
OPMERKING: Deze stap is niet nodig als de peptidegel geen matrixtoevoegingen bevat. - Voeg 200 μL media toe aan elk putje van de plaat met 96 putjes, of 1 ml aan de buitenkant van de celkweekinzet met een paar druppels op de bovenkant van de gel. Incubeer bij 37 °C in 5% CO2 en een bevochtigde atmosfeer.
- Verander de media twee keer binnen het volgende uur en opnieuw na enkele uren (of de volgende dag).
OPMERKING: Wees hier voorzichtig, want de gels zullen enkele uren onstabiel zijn. - Vervang de media elke 2-3 dagen (of volgens het standaard kweekprotocol voor de gebruikte cellen).
6. Indirecte co-cultuur
OPMERKING: Deze methode is alleen van toepassing wanneer de peptidegels worden gezaaid in inzetstukken met 24 putjes, of vergelijkbare formaten waarin de gel boven een celmonolaag kan worden ondersteund. Indirecte co-cultuur kan in dit geval worden geïntroduceerd door een 2D-feederlaag van cellen op de bodem van de putplaat voor te bereiden.
- Maak een plaat met 24 putjes klaar om te zaaien. Dit moet een aparte plaat zijn naast de peptidegels, maar moet van hetzelfde merk zijn om compatibiliteit met de gebruikte inserts te garanderen (zie stap 5.2).
- Bereken de celdichtheid die nodig is voor het zaaien van de indirecte co-cultuur, afhankelijk van het celtype in kwestie.
OPMERKING: De dichtheid van het zaaien van cellen moet worden geoptimaliseerd voor elke nieuwe cellijn die wordt overwogen. Cellen moeten worden geplateerd om ongeveer 30-50% samenvloeiing te geven. De menselijke borstfibroblastcellijn HMFU19 wordt bijvoorbeeld doorgaans geplateerd met een dichtheid van 1-5 x 104 cellen/putje. - Bereid met behulp van standaard kweek-/passagemethoden voor de gebruikte cellen een celsuspensie voor die geschikt is om te zaaien bij 1 ml/putje, met behulp van het typische groeimedium voor deze cellen.
- Zaai de celsuspensie in de putplaat, 1 ml per putje.
- Incubeer bij 37 °C in 5% CO2 en een bevochtigde atmosfeer om zich enkele uren of een nacht te hechten. Verwijder vervolgens het medium uit de putjes.
- Breng met een steriele tang de 24 putjes met de peptidegels over in de nieuwe putjes met de voorgezaaide cellen in 2D. Voeg 1 ml medium druppelsgewijs toe aan de buitenkant van het inzetstuk en een paar druppels op het oppervlak van de gel.
OPMERKING: Doorgaans is het medium dat op dit punt wordt gebruikt het medium dat geschikt is voor de cellen die in de gel zijn ingekapseld, maar de geschiktheid van dit medium voor de cellen in 2D moet mogelijk worden geverifieerd of geoptimaliseerd voor het specifieke experiment in kwestie. - Bereid regelmatig verse feederlagen voor om overmatige samenvloeiing te voorkomen en breng peptidegels over naar deze nieuwe putten volgens dezelfde methode als hierboven.
OPMERKING: Doorgaans worden cellen voor indirecte co-cultuur tegelijkertijd met het zaaien van de peptidegel bereid. Peptidegels kunnen vervolgens na een paar uur of een nacht incubatie worden overgebracht naar co-cultuur op het punt van mediaverandering, zie stap 5.8.
7. Bulk oscillerende reologie van peptidegels
OPMERKING: Standaard wordt de reologische karakterisering 24 uur na het zaaien van de gel uitgevoerd, wat moet gebeuren in inzetstukken met 24 putjes.
- Stel de reometer in en kalibreer hem volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik een parallelle plaatgeometrie met een plaatdiameter die zo dicht mogelijk bij de diameter van de celcultuurinsert ligt.
OPMERKING: Proeven kunnen desgewenst worden uitgevoerd bij 37 °C, waarbij de omgeving tijdens de teelt wordt nagebootst. - Verwijder het eerste te testen peptidegelmonster uit de celkweekinzet door de inleg om te keren en het plastic membraan met een scalpel uit te snijden.
NOTITIE: Zorg ervoor dat de plaat met de peptidegels zich zo kort mogelijk buiten de celcultuurincubator bevindt voordat u gaat testen. Media met een bicarbonaatbuffersysteem zijn afhankelijk van de aanwezigheid van CO2 om de pH te behouden. Gels die te lang buiten de couveuse hebben gelegen, zullen in pH afdrijven, wat de reologische beoordeling kan beïnvloeden. Het kan nuttig zijn om de gels te onderhouden met 10 mM HEPES toegevoegd aan de media om dit effect te voorkomen. - Breng de gel voorzichtig over op de reometerplaat. Snijd vervolgens met een scalpel de hoogte van de gel in tot ongeveer 1 mm om gelvervorming te minimaliseren wanneer deze onder de reometerplaat wordt geladen.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u de reometerplaat niet aanraakt of beschadigt wanneer u het scalpel gebruikt. - Stel de afstand tussen de parallelle platen in op 1 mm. Knip overtollige gel af die niet door de reometerplaten wordt bedekt.
- Voer de gewenste testinstellingen uit op de reometer, volgens de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: Voor elke nieuwe monsterconditie wordt geadviseerd om een amplitude-sweep uit te voeren van 0.1-100% rek om ervoor te zorgen dat alle tests worden uitgevoerd op een rekniveau binnen het lineaire visco-elastische gebied van het monster.
8. Levende/dode kleuring van ingekapselde cellen
- Verwijder het medium uit de putjes en was de peptidegels twee keer met 1x PBS, met dezelfde techniek als voor een mediawissel (stap 5.7).
- Verwijder peptidegels die zijn gekweekt in inzetstukken met 24 putjes volgens stap 7.2. Bewaar gels in 1x PBS in de originele putplaat tot ze klaar zijn om te bevlekken.
OPMERKING: Wees voorzichtig, want de gels kunnen op dit punt kwetsbaar zijn, vooral na langdurige kweek. - Bereid een levend/dood kleuringsoplossing voor, rekening houdend met 500 μL kleuring per inzetstuk van de plaat met 24 putjes, of 50 μL per putje van een plaat met 96 putjes. Een typische kleuring is 4 μM ethidiumhomodimeer en 2 μM calceïne AM in 1x PBS. Bescherm de resulterende oplossing tegen licht.
OPMERKING: Concentraties van levende/dode reagentia moeten mogelijk verder worden geoptimaliseerd, afhankelijk van het gebruikte celtype en de leverancier van de reagentia. - Verwijder PBS voorzichtig van elke gel en vervang door een paar druppels van de kleuroplossing, zorg ervoor dat elke gel goed bedekt is.
- Incubeer de gels in de kleuringsoplossing in het donker gedurende 10-15 minuten en visualiseer ze vervolgens met een confocale/fluorescerende microscoop.
OPMERKING: Voor afbeeldingen van hogere kwaliteit kan het nuttig zijn om de gels over te brengen naar schalen met glazen bodem van dekglaasjesdikte.
9. Fixeren van peptidegels voor beeldvorming van het eindpunt
- Was peptidegels volgens stap 8.1.
- Voeg 4% paraformaldehyde (PFA) toe in 1x PBS: 100 μL voor elk putje van een plaat met 96 putjes en 1 ml voor elke gel in een inzetstuk van een plaat met 24 putjes (een paar druppels moeten bovenop de gel in het inzetstuk worden toegevoegd).
LET OP: Paraformaldehyde (PFA) is zeer giftig en wordt gemakkelijk door de huid opgenomen. Het is uiterst destructief voor de huid, ogen, slijmvliezen en de bovenste luchtwegen. PFA moet worden behandeld in een zuurkast en gebruikers moeten beschermende kleding en handschoenen dragen. Alternatieve chemische fixeermiddelen kunnen op dezelfde manier worden gebruikt, afhankelijk van de eindtoepassing. - Incubeer peptidegels in PFA-fixatief gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Verwijder PFA-fixeermiddel en was peptidegels twee keer met 1x PBS.
OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd, bewaar vaste peptidegels bij 4 °C in 1x PBS gedurende maximaal 4 weken, zorg ervoor dat de plaat goed is afgesloten met paraffinefilm.
10. Inbedding van peptidegels voor secties
OPMERKING: Het inbedden van peptidegels in 4% agar is een cruciale stap voorafgaand aan het inbedden van paraffine voor immunohistochemie. Als alternatief kunnen gels worden ingebed in 2% agar en worden doorgesneden met behulp van een vibratoom (meestal geven secties van 500 μm goede resultaten). Dit is een optionele stap, het produceren van gehydrateerde gelsecties die gunstig kunnen zijn voor het kleuren van extracellulaire matrixlokalisatie in de gel, met behulp van de methoden in sectie 11.
- Bereid gesmolten 2% of 4% agar-oplossing in 1x PBS (zie opmerking hierboven), door te koken in een magnetron. Laat een paar minuten afkoelen voor gebruik.
OPMERKING: Gesmolten agar vormt een gevaar voor hitte - ga voorzichtig om met hand- en gelaatsbescherming. Na bereiding kan de agaroplossing bij 4 °C worden bewaard totdat deze nodig is. - Verwijder de peptidegel uit de celcultuurbijsluiter volgens stap 7.2.
- Bedek met een plastic pasteurpipet de basis van een histologische inbeddingsvorm met een dunne laag agar-oplossing. Laat enkele seconden afkoelen bij 20 °C.
- Plaats met een spatel de peptidegel in het midden van de agar. Bedek vervolgens de peptidegel volledig met agar.
OPMERKING: De gel mag niet in de agar zinken. Als dit het geval is, verwijder dan de gel en wacht nog een paar seconden tot de agar meer is gestold en probeer het opnieuw. Probeer niet te veel stolling te laten plaatsvinden, anders ontstaat er een zwakke verbinding tussen de twee lagen. - Laat de ingebedde gel 1 uur afkoelen bij 4 °C voordat u deze uit de histologische vorm haalt.
OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd, bewaar ingebedde gels bij 4 °C in 1x PBS gedurende maximaal 4 weken. - Als immunohistochemie moet worden uitgevoerd, plaatst u ingebedde gels in een weefselverwerker en gaat u verder met behulp van standaard laboratoriummethoden.
OPMERKING: Als alternatief kunnen ingebedde gels met behulp van een vibratoom in gehydrateerde secties worden gesneden. Gehydrateerde secties moeten maximaal 4 weken in afgesloten platen bij 4 °C in 1x PBS worden bewaard.
11. Kleuring van cellen in gels met behulp van immunocytochemie
- Verwijder de 1x PBS die de peptidegels/gelsecties bedekt. Verwijder alle gels die nog in de inzetstukken van de plaat met 24 putjes zitten volgens stap 7.2.
- Dek de gels/gelsecties af in een blokkerende buffer en incubeer gedurende 30 minuten bij 20 °C.
OPMERKING: Een typische blokkeerbuffer bestaat uit 0,5% runderserumalbumine (BSA) in 1x PBS met 0,1% Triton X-100. Triton X-100 is giftig en veroorzaakt ernstig oogletsel, huidirritatie en is zeer giftig voor in het water levende organismen. Gebruikers dienen beschermende kleding, oogbescherming en handschoenen te dragen. - Bereid primaire antilichamen voor in een blokkerende buffer bij geoptimaliseerde werkconcentraties. Sta 200 μL per plaatgel met 24 putjes, 100 μL per gelsectie en 50 μL per bordje met 96 putjes toe.
OPMERKING: Doorgaans moeten de antilichaamconcentraties die worden gebruikt voor 3D-kleuring in gels het dubbele zijn van de concentratie die in 2D wordt gebruikt. - Verwijder de blokkerende buffer en voeg druppelsgewijs antilichaamoplossing toe aan de gels.
- Sluit de plaat af met paraffinefilm en broed een nacht bij 4 °C.
- Verwijder de antilichaamoplossing en was twee keer met een blokkeerbuffer.
- Voeg secundair antilichaam toe volgens dezelfde procedures als beschreven in de stappen 11.3 en 11.4.
- Incubeer in het donker een nacht bij 4 °C of gedurende 3 uur bij 20 °C.
- Verwijder de antilichaamoplossing en was twee keer met 1x PBS.
- Bedek de monsters met een DAPI-oplossing van 1:1.000 en incubeer gedurende 1 uur in het donker bij 4 °C.
- Breng de gel over op een glazen dekglaasje en afbeelding door middel van fluorescerende/confocale microscopie.
12. RNA-extractie
OPMERKING: De volumes die in deze methode worden gebruikt, zijn van toepassing wanneer de peptidegels worden gezaaid in plaatinzetstukken met 24 putjes. Andere gelformaten kunnen worden gebruikt en de volumes kunnen dienovereenkomstig worden aangepast.
- Verwijder het medium uit de putjes en was de peptidegels twee keer met 1x PBS, met dezelfde techniek als voor een mediawissel (stap 5.7).
- Verwijder peptidegels die zijn gekweekt in inzetstukken met 24 putjes volgens stap 7.2. Plaats elke gel in een aparte centrifugebuis van 15 ml.
OPMERKING: Wees voorzichtig, want de gels kunnen op dit punt kwetsbaar zijn, vooral na langdurige kweek. - Voeg met behulp van een P1000 500 μL trypsine-EDTA (0,25%) toe aan elke buis en pipetteer op en neer om te mengen en verstoor de gel.
- Incubeer de gels in de trypsine-EDTA bij 37 °C gedurende 3-5 minuten.
OPMERKING: Incubatietijden moeten mogelijk worden geoptimaliseerd, afhankelijk van het gebruikte celtype. - Voeg 5 ml 1x PBS toe om de trypsine-EDTA te verdunnen.
- Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten tot pelletcellen.
- Verwijder de supernatant.
OPMERKING: Wees voorzichtig, want er kan zich een gellaag hebben gevormd tussen de celpellet en de supernatant. - Resuspendeer de celpellet in lysisbuffer, volgens de instructies van de fabrikant, en ga verder met het volgen van de standaardprotocollen voor RNA-extractie.
Resultaten
De hier beschreven methode voor de fabricage van peptidegel stelt de gebruiker in staat om een op maat gemaakte 3D-cultuuromgeving te definiëren en te creëren. Hoewel de mechanische omgeving voornamelijk wordt bepaald door de peptideconcentratie, kunnen interessante matrixcomponenten ook worden toegevoegd met gecontroleerde dichtheden, zoals blijkt uit de voorbeeldberekening in figuur 1. In zijn eenvoudigste vorm biedt het peptidegelprotocol echter een methode om cellen in te kapselen in een matrixvrije 3D-omgeving. Figuur 2 laat zien hoe deze benadering kan worden gecombineerd met een breed scala aan kankermodellen, waaronder fluorescerend gelabelde kankercellijnen (Figuur 2A) en van de patiënt afgeleid xenotransplantaatmateriaal (PDX) (Figuur 2B,C). Belangrijk is dat cellijnen en PDX-materiaal beide in de gels kunnen worden gekweekt in serumvrije omstandigheden (Figuur 2C,D), waardoor een 3D-kweeksysteem ontstaat met een volledig gedefinieerde samenstelling.
Omdat het peptide zelf geen celbindende motieven bevat, vertonen ingekapselde cellen doorgaans een afgeronde morfologie in de ongemodificeerde peptidegels. Figuur 3A toont dit aan voor menselijke borstfibroblasten in een peptidegel van 6 mg/ml, vergeleken met hun klassieke langwerpige morfologie die wordt gezien in pure Matrigel en een pure collageengel. Belangrijk is echter dat het peptidegelprotocol de opname van interessante matrixcomponenten mogelijk maakt. Figuur 3A laat zien hoe toevoeging van 200 μg/ml collageen I de langwerpige fibroblastmorfologie in de peptidegels kan herstellen.
Matrixtoevoegingen kunnen ook de groei en organisatie van andere celtypen ondersteunen, bijvoorbeeld MCF10A, zoals weergegeven in Figuur 3B. In dit geval zorgt toevoeging van 100 μg/ml collageen I aan een peptidegel van 6 mg/ml ervoor dat acinaire structuren op dag 7 worden gevormd. Verdere complexiteit kan ook worden geïntroduceerd door opname van een ondersteunende cellaag in indirecte co-cultuur. Figuur 3C laat zien hoe de gecombineerde aanpak van matrixincorporatie en indirecte co-cultuur met menselijke borstfibroblasten de groei en organisatie van MCF10A kan verbeteren.
Een andere belangrijke parameter is de concentratie peptide die wordt gebruikt bij de fabricage van peptidegel. Figuur 4A toont een voorbeeld van hoe het beheersen van de peptideconcentratie, in dit geval tussen 4 en 10 mg/ml, resulteert in een stijfheid tussen 100s en 1000s Pa. Deze gels kunnen matrixvrij worden vervaardigd of kunnen worden gemaakt met matrixtoevoegingen om gelijktijdige controle van zowel stijfheid als samenstelling mogelijk te maken. Peptidegels met matrixtoevoegingen kunnen worden doorgesneden en gekleurd om de verdeling van deze toevoegingen te visualiseren. Figuur 4B, C tonen twee benaderingen om dit te doen: inbedding in 4% agar gevolgd door standaard weefselverwerking en paraffine-inbedding voor immunohistochemie (Figuur 4B) of inbedding in 2% agar gevolgd door vibratoomdoorsnede en fluorescerende kleuring (Figuur 4C).
Bij het wijzigen van de samenstelling van de peptidegels is het van cruciaal belang ervoor te zorgen dat deze veranderingen geen invloed hebben op de mechanische omgeving die aanvankelijk aan de cellen werd gepresenteerd. Figuur 4D laat zien hoe wijzigingen in de peptideconcentratie kunnen worden gebruikt om eventuele veranderingen in de stijfheid van de peptidegel bij matrixopname te compenseren. Bulk oscillerende reologische metingen van gelstijfheid (opslagmodulus, G') kunnen dan onderscheid maken tussen de effecten van gelsamenstelling en stijfheid op de celmorfologie. Zoals te zien is in de helderveldbeelden, ontwikkelen MDA MB 231-cellen een langwerpige morfologie op collageentoevoeging aan peptidegels van 10 mg/ml of 15 mg/ml. Figuur 4E laat zien dat deze langwerpige cellen positief kleuren voor pFAK, wat wijst op een interactie met hun omringende matrix. De aanvankelijk matrixvrije omgeving van de peptidegels maakt ze ook een ideaal platform voor het bestuderen van cellulaire synthese en afzetting van interessante matrixcomponenten. Figuur 4F toont de gelokaliseerde afzetting van collageen I door MCF7-cellen ingekapseld in peptidegels van 10 mg/ml.
Een van de belangrijkste voordelen van de peptidegels is het gemak waarmee standaard laboratoriummethoden kunnen worden toegepast op hun analyse. Materiaal kan worden geëxtraheerd voor qRT-PCR om genexpressieprofielen te bepalen (zoals getoond in onze recente publicatie5). Beeldvorming door middel van helderveldmicroscopie maakt bovendien real-time visualisatie van celgroei mogelijk. Figuur 5 toont enkele van de typische problemen bij het oplossen van problemen die kunnen optreden bij mislukte peptidegels: onvolledige menging van de gelprecursor (Figuur 5A,B); onjuiste optimalisatie van de peptideconcentratie (Figuur 5C,D) of zaaidichtheid (Figuur 5E,F); en onjuiste neutralisatie van zuur collageen voorafgaand aan opname in de peptidegels (Figuur 5G,H). Met name de peptideconcentratie en de zaaidichtheid moeten voor elke cellijn en peptidebron worden geoptimaliseerd om ervoor te zorgen dat de kweekomgeving op de juiste manier wordt gedefinieerd en representatief is voor de toepassing van belang.
Figuur 1: Een voorbeeldberekening voor matrixsamenstelling en zaaidichtheid. Deze voorbeeldworkflow beschrijft de procedure die zou worden gevolgd om twee peptidegelprecursoren te zaaien met toevoegingen van 100 μg/ml collageen, bij een uiteindelijke celdichtheid van 1 x 105 cellen/ml. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Matrixvrije peptidegels bieden een geschikt 3D-kweekplatform voor cellijn- en patiëntafgeleide kankermodellen. (A) HCT116 colorectale kanker en MCF7 borstkankercellijnen, die respectievelijk de fluorescerende markers mCherry en tdTomato constitutief tot expressie brengen, vormen celclusters in gels van 6 mg/ml op dag 9 (links), en kunnen live worden afgebeeld met behulp van fluorescerende microscopie (rechts, schaalbalk 50 μm); (B) Patiënt-afgeleide xenotransplantaatcellen (PDX) van een triple-negatieve borstkankerpatiënt (BR8) vormen celclusters op dag 7 in peptidegels van 10 mg/ml; (C) PDX-cellen van oestrogeenreceptorpositieve borsttumoren (BB3RC31) kunnen worden gekweekt in serumvrije omstandigheden18, aangetoond met controle van de basaalmembraanmatrix (bijv. Matrigel) bij gematchte passage ter vergelijking; (D) MCF7-borstkankercellen zijn levensvatbaar in peptidegels van 6 mg/ml in matrixvrije en serumvrije omstandigheden, zoals beoordeeld met behulp van een LIVE/DEAD-celtest op dag 7. KSR = knock-out serumvervanging, MS medium = mammosfeer medium19. Schaalbalk 100 μm tenzij anders aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: De complexiteit van peptidegel kan worden verhoogd door introductie van matrixtoevoegingen en co-cultuur. (A) Humane borstfibroblastcellijn HMFU19 vereist collageentoevoegingen om een langwerpige morfologie te herstellen in een peptidegel van 6 mg/ml, weergegeven met zuivere basaalmembraanmatrix (bijv. Matrigel) en 1,5 mg/ml collageen I-gel van rattenstaart ter vergelijking, schaalbalk 50 μm; (B) MCF10A normale borstcellen vormen acinaire structuren op dag 7 in peptidegels van 6 mg/ml na toevoeging van 100 μg/ml humaan collageen I, schaalbalk 100 μm; (C) Gecombineerde toevoeging van matrixcomponenten fibronectine/HA (hyaluronzuur, molecuulgewicht 804 kDa) en HMFU19 in indirecte cocultuur vergroten de grootte en organisatie van MCF10A acini in peptidegels van 10 mg/ml, zoals beoordeeld door gesplitste caspase 3-kleuring, schaalbalk 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Peptidegels maken onafhankelijke controle van stijfheid en samenstelling mogelijk, en beoordeling van de door cellen afgezette matrix. (A) Bulkreologische metingen die een typisch stijfheidsbereik (opslagmodulus, G') aantonen dat kan worden bereikt door controle van de peptideconcentratie, * geeft p < 0,05 aan; (B) Immunohistochemie met kleuring van 150 μg/ml collageen I in een peptidegel van 10 mg/ml met ingekapseld MCF7 (dag 7, schaalbalk 100 μm); (C) Immunofluorescentie van collageen I-distributie in een peptidegel van 6 mg/ml met 200 μg/ml humaan collageen I, door agar-inbedding en vibratoomsecties, schaalbalk 25 μm; (D) Toevoeging van 200 μg/ml collageen I geeft een bescheiden afname van de opslagmodulus, G', van 10 mg/ml peptidegels (bulk oscillerende reologie), gecompenseerd door een verhoging van de peptideconcentratie tot 15 mg/ml. MDA MB 231 triple-negatieve borstkankercellen worden getoond in elke aandoening (dag 7, schaalbalk 50 μm); (E) MDA MB 231 in peptidegels van 15 mg/ml met 200 μg/ml humaan collageen I vertonen rek en interactie met de matrix via pFAK-kleuring (dag 14, schaalbalk 50 μm); (F) In situ kleuring van MCF7 collageen I-afzetting in een aanvankelijk matrixvrije peptidegel van 10 mg/ml (dag 10, schaalbalk 100 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 5: Veelvoorkomende problemen met het oplossen van problemen met peptidegel kunnen worden opgelost met behulp van helderveldmicroscopie. De getoonde cellen zijn MCF10A normale borstepitheelcellen, op dag 7, tenzij anders aangegeven. (A) Een correct gemengde gelprecursor moet optisch helder zijn zonder inconsistenties, terwijl (B) onvoldoende menging/neutralisatie zichtbare inhomogeniteiten/strepen in de peptidegel kan veroorzaken (witte pijlen); (C) MCF10A vormt acinaire structuren in peptidegels van 6 mg/ml na toevoeging van indirecte HMFU19-cocultuur, maar (D) bij 15 mg/ml is de peptideconcentratie te hoog om acinaire vorming mogelijk te maken; (E) MCF10A gezaaid bij 5 x 105 cellen/ml vormen acinaire structuren in gels van 6 mg/ml na toevoeging van 100 μg/ml collageen I, maar (F) bij 2 x 105 cellen/ml celdichtheid is te laag om acinaire vorming mogelijk te maken; (G) Collageentoevoegingen kunnen op dag 14 grote celclusters produceren, maar (H) onjuiste toevoeging (collageenneutralisatie te vroeg in het proces) kan clustergroei voorkomen. Schaalbalk 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussie
We hebben ontdekt dat de hier beschreven peptidegels een eenvoudige, kosteneffectieve en flexibele oplossing zijn om de 3D-cultuur van meerdere celtypen te ondersteunen. Door volledige controle te bieden over de concentratie van het gebruikte peptide en de gemaakte eiwit- of glycaantoevoegingen, maakt deze methode het mogelijk om de peptidegels zorgvuldig af te stemmen op hun toepassing.
Het cruciale voordeel van de peptidegels ten opzichte van bestaande methoden is dat de matrixsamenstelling en mechanische eigenschappen onafhankelijk van elkaar kunnen worden gecontroleerd, met behulp van een eenvoudige methode die geen complexe chemische procedures vereist. De mechanische eigenschappen van de peptidegel worden voornamelijk bepaald door de peptideconcentratie in de initiële gelprecursor. Door vervolgens cellen en/of matrixcomponenten toe te voegen, kan een volledig door de gebruiker gedefinieerde in-vitro-omgeving worden gecreëerd. Hoewel matrixtoevoegingen de initiële mechanische eigenschappen van de gel kunnen veranderen, kan dit gemakkelijk worden gecompenseerd door de onafhankelijke variatie van peptideconcentratie5. Dit biedt een tastbaar voordeel ten opzichte van bestaande systemen, bijvoorbeeld collageengels, waarin parameters die de stijfheid regelen ook vaak resulteren in een verandering in integrinebindingsmotieven20,21.
We hebben de toepassing van de peptidegel gedemonstreerd voor in vitro kweek van kankercellijnen en van patiënten afgeleid materiaal5. Het stijfheidsbereik dat toegankelijk is met de peptidegel (in het bereik van 100 tot 1000 Pa) is bij uitstek geschikt om normale en tumormatrixomgevingen te repliceren in zachte weefsels zoals borst. We erkennen echter dat andere toepassingen aanzienlijk stijvere omgevingen vereisen, bijvoorbeeld in het bereik van 10-20 kPa voor botregeneratie. Verdere aanpassing van het hier gepresenteerde protocol zou nodig zijn om de haalbare stijfheid uit te breiden tot dit bereik, wat meer typerend is voor alternatieve benaderingen zoals alginaatgels22. Op dezelfde manier hebben we hier een eenvoudige methode beschreven voor functionalisering door fysieke insluiting van matrixeiwitten/glycanen in de peptidegel. Voor de hier beschreven toepassingen werkt deze aanpak goed en kan deze gemakkelijk worden aangepast voor gebruik door niet-gespecialiseerde groepen die 3D in vitro ziektemodellen willen gebruiken. Net als veel andere hydrogels11, kan het peptide dat hier wordt gebruikt worden uitgebreid met celbindende of andere biologische motieven en voor sommige toepassingen kan deze benadering de voorkeur hebben.
We hebben een paar belangrijke punten geïdentificeerd die zorgvuldige aandacht nodig hebben om succes te garanderen. De vorming van de gelprecursor is een cruciale tussenstap die de gebruiker in staat stelt om te controleren of de gebruikte omstandigheden correct zijn voordat cellen worden opgenomen. Deze precursor kan enkele weken worden bewaard (bij 4 °C), maar moet vóór gebruik bij 80 °C en vervolgens bij 37 °C worden geïncubeerd. Een geschikte precursor is volledig vloeibaar bij 80 °C en zelfdragend bij 37 °C. Deze controles zijn essentieel om ervoor te zorgen dat de geleerling correct verloopt. Cellen en/of matrix kunnen dan onder fysiologische omstandigheden worden opgenomen.
Labs die al 3D-matrices gebruiken, zullen bekend zijn met de zorgvuldige behandeling die nodig is om cellen in de peptidegels in te kapselen. Er moet voor worden gezorgd dat het roeren van cellen voor en tijdens de inkapselingsstappen wordt beperkt. We hebben geconstateerd dat specifieke celtypen tijdens dit proces differentieel gevoelig zijn voor schade en dit moet zorgvuldig worden geëvalueerd door de gebruiker. De concentraties van de hier beschreven peptidegel zorgen ervoor dat de gelering kan doorgaan in een tijdsbestek dat, voor de genoemde cellen, cellen in staat stelt te worden ingekapseld voordat ze goed maar langzaam genoeg naar de bodem van het gietstuk zinken zodat ze niet door dit proces worden beschadigd. Het is echter opmerkelijk dat sommige gevoelige celtypen mogelijk een snellere neutralisatie nodig hebben om langdurige blootstelling aan een verhoogde pH te voorkomen. In dit geval kan de toevoeging van 10 mM HEPES aan het medium rond de peptidegel gunstig zijn.
Bij het toepassen van de methode die in dit protocol wordt beschreven, is het erg belangrijk om de kwaliteit van de peptidebron zorgvuldig te overwegen. In plaats van te worden gebruikt als een functioneel motief of coating, is het peptide hier het geheel van het niet-oplosbare deel van de hydrogel. Daarom zullen eventuele verontreinigingen of variaties in de peptidestructuur waarschijnlijk een aanzienlijke invloed hebben op de integriteit of het vermogen om de levensvatbaarheid van de cellen in de uiteindelijke hydrogel te ondersteunen. Bij het overstappen op een nieuwe batch peptide moet ervoor worden gezorgd dat er een goede batch-tot-batch consistentie is van de leverancier en moet het gedrag van de peptide worden gecontroleerd bij het vormen van de gelprecursor.
Samenvattend beschrijft dit protocol een 3D-kweeksysteem met een cruciale focus op de onafhankelijke controle van mechanische en biologische eigenschappen. De eenvoud en het aanpassingsvermogen van de methode maken het geschikt voor toepassing door elk celkweeklaboratorium en voor een breed scala aan toepassingen5. In de toekomst kan dit protocol worden uitgebreid om de covalente modificatie van de peptidesequentie mogelijk te maken. Dit kan worden gecombineerd met geavanceerde microscopiemethoden om de trekkrachten te onderzoeken die worden uitgeoefend door cellen op hun omringende matrix. Van cruciaal belang is echter het vermogen om onderscheid te maken tussen kunstmatig opgenomen matrix en matrix die door de ingekapselde cellen zelf wordt gesynthetiseerd. Dit vermogen om matrixveranderingen in de loop van de tijd te controleren en te volgen, zal ongekende inzichten mogelijk maken in de rol van cel-matrixinteracties bij de ontwikkeling van kanker en andere ziekten.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We willen graag de financiering van het National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research NC/N0015831/1 erkennen aan JCA, GF en CLRM, NC/T001267/1 aan RBC, CLRM, JCA, KL-S en KS, NC/T001259/1 aan JCA, KL-S en CLRM en NC/P002285/1 aan AMG, SJ en CLRM. Ook financiering van de Engineering and Physical Sciences Research Council EP/R035563/1 tot KL-S en CLRM en EP/N006615/1 tot JLT en CLRM. Figuur 1 is gemaakt met behulp van aangepaste afbeeldingen van Servier Medical Art. Servier Medical Art by Servier is gelicenseerd onder een Creative Commons Attribution 3.0 Unported License.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Gel fabricage - Reagentia | |||
| FEFEFKFK | Pepceuticals | n/a | Polypeptide; verkrijgbaar bij verschillende leveranciers. Pepceuticals is onze aanbevolen leverancier vanwege de kwaliteit van het product. |
| PBS 10X | Gibco | 70011-036 | |
| Natriumhydroxide (1 M) | Sigma-Aldrich | S2770 | NaOH; verdun tot 0,5 M voor gebruik |
| Water | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Gel fabricage - Uitrusting en verbruiksartikelen | |||
| 15 mL falconbuisjes | Greiner | 188261 | Als u een andere merk gebruikt, zorg er dan voor dat het materiaal temperaturen tot 90°C kan weerstaan |
| 24 well plaat | Corning Costar | 3524 | Alternatieve merken/leveranciers kunnen worden gebruikt zolang er een opening is tussen de insertbasis en het plaatoppervlak |
| Centrifuge | Elke | 200 x g gedurende 3 minuten | |
| Klasse II Microbiologische Veiligheidskast | Elke | ||
| Fijne balans | Elke | Leesbaarheid 0,1 mg | |
| Hangende insert voor 24 well plaat | Millipore | MCRP24H48 | Alternatieve merken/leveranciers kunnen worden gebruikt zolang er een opening is tussen de insertbasis en het plaatoppervlak |
| Incubator | Elke | 37°C, 5% CO2, bevochtigde omgeving | |
| Oven | Elke | instelling 80°C | |
| P1000/200/20/10 pipet | Elke | Het is essentieel dat de pipetten die voor de procedure worden gebruikt, gekalibreerd zijn | |
| P1000/200/20/10 tips | Elke | ||
| pH meter met microprobe | Elke | ||
| Spatspaan | Elke | ||
| Vortex | Elke | ||
| Matrix toevoeging | |||
| Collageen I (mens) | Stem Cell Technologies | 07005 | |
| Collageen I (rattenstaart) | Gibco | A10483 | |
| Fibronectine | Stem Cell Technologies | 07159 | |
| Hyaluronzuur | Iduron | HA804 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Cel incapsulatie/kweek | |||
| B27 Supplement (geen retinoïnezuur) | Gibco | 12587010 | Media toevoeging voor serumvrije culturen (Figuur 2D) |
| Cholera toxine | Sigma-Aldrich | C-8052 | Media toevoeging voor MCF10A cellen (Figuur 3, 5) |
| DMEM | Gibco | 21969-035 | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D8062 | Media toevoeging voor MCF10A cellen (Figuur 3, 5) |
| DMEM/F12 Fenol Rood Vrij | Gibco | 21041-025 | Media toevoeging voor serumvrije culturen (Figuur 2D) |
| DPBS | Gibco | 14190-094 | |
| EGF | SourceBiosciences | ABC016 | Media toevoeging voor MCF10A cellen (Figuur 3, 5) |
| Fetal bovien serum | Gibco | 10500-064 | |
| Paarden serum | Gibco | 26050-070 | Media toevoeging voor MCF10A cellen (Figuur 3, 5) |
| Menselijke kanker/epitheliale cellijnen | bijv. MCF7/tdTomato MCF7/MCF10a/HCT116-mCherry | ||
| Menselijke mammaire fibroblasten | bijv. HMFU19 | ||
| Hydrocortison | Sigma-Aldrich | H-0888 | Media toevoeging voor MCF10A cellen (Figuur 3, 5) |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | Media toevoeging voor MCF10A cellen (Figuur 3, 5) |
| Knockout serum vervanging | Gibco | 10828-028 | Media toevoeging voor serumvrije culturen (Figuur 2D) |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| RPMI | Gibco | 21875-034 | |
| RPMI Fenol Rood Vrij | Sigma-Aldrich | R7509 | |
| Beeldvorming en andere assays | |||
| 4% paraformaldehyd | Polysciences | 18814 | |
| Agar | SLS | CHE1070 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | 5482 | |
| Confocal en/of fluorescente microscoop | Elke | bijv. Leica TCS SPE confocale laserscanningmicroscoop (Figuur 2-4) | |
| DAPI oplossing | Invitrogen | D3571 | 300 uM werkoplossing |
| DPX montagemedium | ThermoFisher Scientific | ||
| Glas dekglasjes | Elke | Geen1 dekglasjes 0,13 - 0,17 mm dik | |
| Glasbodem schalen | MatTek | ||
| Gezeten Anti-Konijn IgG H&L (HRP polymeer) | Abcam | ab214880 | |
| Haematoxyline en Eosine | Elke | ||
| Histologie mallen (wegwerp, plastic) | Elke | ||
| Beeldanalysesoftware | ImageJ | ||
| Live/Dead assay kit | Invitrogen | L3224 |
Referenties
- Hynes, R. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).
- Tian, C., et al. Cancer-cell-derived matrisome proteins promote metastasis in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Research. 80 (7), 1461-1474 (2020).
- Hebert, J. D., et al. Proteomic profiling of the ECM of xenograft breast cancer metastases in different organs reveals distinct metastatic niches. Cancer Research. 80 (7), 1475-1485 (2020).
- Vennin, C., et al. CAF hierarchy driven by pancreatic cancer cell p53-status creates a pro-metastatic and chemoresistant environment via perlecan. Nature Communication. 10 (1), 3637(2019).
- Ashworth, J. C., et al. Peptide gels of fully-defined composition and mechanics for probing cell-cell and cell-matrix interactions in vitro. Matrix Biology. 85, 15-33 (2020).
- Toniatti, C., Jones, P., Graham, H., Pagliara, B., Draetta, G. Oncology drug discovery: Planning a turnaround. Cancer Discovery. 4 (4), 397-404 (2014).
- Mak, I. W., Evaniew, N., Ghert, M. Lost in translation: animal models and clinical trials in cancer treatment. American Journal of Translational Research. 6 (2), 114-118 (2014).
- Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nature Reviews Materials. 5, 539-551 (2020).
- Onion, D., et al. 3-Dimensional patient-derived lung cancer assays reveal resistance to standards-of-care promoted by stromal cells but sensitivity to histone deacetylase inhibitors. Molecular Cancer Therapy. 15 (4), 753-763 (2016).
- Saunders, J. H., et al. Individual patient oesophageal cancer 3D models for tailored treatment. Oncotarget. 8 (15), 24224-24236 (2017).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Kühn, S., et al. Cell-instructive multiphasic gel-in-gel materials. Advanced Functional Materials. 30, 1908857(2020).
- Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
- Gjorevski, N., Lutolf, M. P. Synthesis and characterization of well- defined hydrogel matrices and their application to intestinal stem cell and organoid culture. Nature Protocols. 12 (11), 2263-2274 (2017).
- Saiani, A., et al. Self assembly and gelation properties of α-helix versus β-sheet forming peptides. Soft Matter. 5 (1), 193-202 (2008).
- Wan, S., et al. Self-assembling peptide hydrogel for intervertebral disc tissue engineering. Acta Biomaterialia. 46, 29-40 (2016).
- Blache, U., Stevens, M. M., Gentleman, E. Harnessing the secreted extracellular matrix to engineer tissues. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 357-363 (2020).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
- Barcus, C. E., Keely, P. J., Eliceiri, K. W., Schule, L. A. Stiff collagen matrices increase tumorigenic prolactin signaling in breast cancer cells. Journal of Biological Chemistry. 288, 12722-12732 (2013).
- Bax, D. V., et al. Impact of UV- and carbodiimide-based crosslinking on the Integrin-binding properties of collagen-based materials. Acta Biomaterialia. 100, 280(2019).
- Huang, B. P., et al. Multi-peptide presentation and hydrogel mechanics jointly enhance therapeutic duo-potential of entrapped stromal cells. Biomaterials. 245, 119973(2020).
Herprints en machtigingen
