Dit protocol biedt experimentele in vitro tools om de transformatie van menselijke borstcellen te evalueren. Gedetailleerde stappen naar de follow-up cel proliferatie tarief, verankering-onafhankelijke groeicapaciteit, en de distributie van cellijnen in 3D-culturen met kelder membraan matrix worden beschreven.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
In Vitro Evaluatie van Oncogene Transformatie in Human Mammary Epithelial Cells
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Tumorigenese is een proces in meerdere stappen waarin cellen mogelijkheden verwerven die hun groei, overleving en verspreiding onder vijandige omstandigheden mogelijk maken. Verschillende tests zijn gericht op het identificeren en kwantificeren van deze kenmerken van kankercellen; echter, ze richten zich vaak op een enkel aspect van cellulaire transformatie en, in feite, meerdere tests nodig zijn voor hun juiste karakterisering. Het doel van dit werk is om onderzoekers te voorzien van een reeks instrumenten om cellulaire transformatie in vitro vanuit een breed perspectief te beoordelen, waardoor het mogelijk is om goede conclusies te trekken.
Een aanhoudende proliferative signaling activatie is het belangrijkste kenmerk van tumorweefsels en kan gemakkelijk worden gecontroleerd onder in vitro omstandigheden door het berekenen van het aantal populatieverdubbelingen bereikt in de tijd. Bovendien maakt de groei van cellen in 3D-culturen hun interactie met omringende cellen mogelijk, die lijkt op wat er in vivo gebeurt. Dit maakt de evaluatie van cellulaire aggregatie mogelijk en, samen met immunofluorescente etikettering van onderscheidende cellulaire markers, om informatie te verkrijgen over een ander relevant kenmerk van tumorale transformatie: het verlies van een goede organisatie. Een ander opmerkelijk kenmerk van getransformeerde cellen is hun vermogen om te groeien zonder gehechtheid aan andere cellen en aan de extracellulaire matrix, die kan worden geëvalueerd met de verankeringstest.
Gedetailleerde experimentele procedures om de groei van cellen te evalueren, om immunofluorescente etikettering van cellijnmarkers in 3D-culturen uit te voeren en om verankering-onafhankelijke celgroei in zachte agar te testen, worden verstrekt. Deze methoden zijn geoptimaliseerd voor borst primary epitheelcellen (BPEC) vanwege de relevantie ervan bij borstkanker; Na enkele aanpassingen kunnen echter procedures worden toegepast op andere celtypen.
Inleiding
Meerdere opeenvolgende gebeurtenissen zijn vereist voor de ontwikkeling van het neoplasma. In 2011 beschreven Hanahan en Weinberg 10 vermogens die de groei, overleving en verspreiding van getransformeerde cellen mogelijk maken: de zogenaamde "Hallmarks of Cancer"1. De hier beschreven methodologie stelt drie verschillende instrumenten samen om in vitro cellulaire transformatie te evalueren door zich te concentreren op enkele onderscheidende kenmerken van de tumorcellen. Deze technieken beoordelen de celproliferatiesnelheid, het gedrag van cellen wanneer gekweekt in 3D en hun vermogen om kolonies met ankerveronafhankelijkheid te vormen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Menselijke monsters gebruikt in de volgende experimenten werden verkregen uit vermindering mammoplasties uitgevoerd bij Clínica Pilar Sant Jordi (Barcelona) onder standaard procedure toestemming. Alle procedures worden uitgevoerd in een klasse II Biological Safety Cabinet, tenzij anders vermeld.
1. In vitro cultuur van menselijke borstpitheelcellen en groeicurve plot opbouw
-
In vitro cultuur van borst primaire epitheelcellen (BPC's): cel doorgeven
OPMERKING: Voor BPEC afleiding en celcultuur volgen instructies beschreven door Ince et al., 20076.- Gemiddelde voorbereiding.....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Er werd gekozen voor een experimenteel model van cellulaire transformatie met de introductie van drie genetische elementen in BPC's om representatieve resultaten van oncogene transformatie te genereren6,7 (figuur 3). Niet-getransformeerde BPC's(N)werden afgeleid van ziektevrij borstweefsel zoals beschreven door Ince en collega's6 en gekweekt volgens het hier aangegeven protocol. Na he.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De experimentele protocollen beschreven in dit document bieden nuttige instrumenten om de oncogene transformatie van in vitro gekweekte cellen te beoordelen. Elke techniek evalueert specifieke aspecten van het transformatieproces, en daarom moet bijzondere aandacht worden besteed aan het trekken van conclusies uit een enkele analyse. Groeicurven opbouw is een aanpak die informatie die al beschikbaar is bij het kweken van cellen voor andere doeleinden vereist. Dat maakt deze techniek goedkoper en gemakkelijker toe te pass.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Het AG-laboratorium wordt gefinancierd door de Spaanse Raad voor nucleaire veiligheid. T.A. en A.G. zijn lid van een door Generalitat de Catalunya erkende onderzoeksgroep (2017-SGR-503). MT heeft een contract gefinancierd door de Wetenschappelijke Stichting Asociación Española Contra el Cáncer [AECC-INVES19022TERR]. G.F. contract wordt gefinancierd door een subsidie van Cellex Foundation.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1 ml Serologische Pipetten | Labclinics | PLC91001 | |
| 1.5 ml Eppendorfs | Thermo Fisher Scientific | 3451 | Donkere eppendorfs worden bij voorkeur gebruikt voor langdurige opslag van MTT |
| 10 µl Pipet tips zonder filter | Biologix | 20-0010 | |
| 100 ml glazen fles | Met dop, autoklaveerbaar | ||
| 1000 µl Pipet tips met filter | Labclinics | LAB1000ULFNL | |
| 1000 µl Pipet tips zonder filter | Biologix | 20-1000 | |
| 15 ml Conische buisjes | VWR | 525-0400 | |
| 2 ml Serologische Pipetten | Labclinics | PLC91002 | |
| 200 µl Pipet tips met filter | Labclinics | FTR200-96 | |
| 5 ml Serologische Pipetten | Labclinics | PLC91005 | |
| 50 ml Conische buisjes | VWR | 525-0304 | |
| Aceton | PanReac AppliChem | 211007 | Wordt gebruikt voor fixatie van 3D-structuren voorafgaand aan immunofluorescente markering |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | Wordt gebruikt voor verankeringstest |
| Anti-Claudin 4 antilichaam | Abcam | 15104, RRID:AB_301650 | Werkverdunning 1:100, gastheer: konijn |
| Anti-Cytokeratin 14 [RCK107] antilichaam | Abcam | 9220, RRID:AB_307087 | Werkverdunning 1:100, gastheer: muis |
| Anti-muis Cyanine Cy3 antilichaam | Jackson ImmunoResearch Inc. | 115-165-146, RRID:AB_2338690 | Werkverdunning 1:500, gastheer: geit |
| Anti-konijn Alexa Fluor 488 antilichaam | Thermo Fisher Scientific | A-11034, RRID:AB_2576217 | Werkverdunning 1:500, gastheer: geit |
| Autoclaaf | |||
| BioVoxxel Toolbox | RRID:SCR_015825 | ||
| Celcultuur 24-well Plaat | Labclinics | PLC30024 | Wordt gebruikt voor 3D-culturen in Matrigel. Platte bodem |
| Celcultuur 6-well Plaat | Labclinics | PLC30006 | Wordt gebruikt voor verankeringstest |
| Cel incubator (37 ºC en 5 % CO2) | |||
| Cel zeefjes | Fisherbrand | 11587522 | Maaswijdte: 40 µm |
| CellSense software | Olympus | Wordt gebruikt voor beeldacquisitie | |
| Centrifuge | |||
| Cholera Toxin van Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | Wordt gebruikt om celcultuurmedium aan te vullen |
| Biologische veiligheidskast Klasse II | Herasafe | HAEREUS HS12 | |
| Confocale omgekeerde microscoop | Leica | TCS SP5 | |
| Dekglaasjes | Witeg Labortechnik GmbH | 4600122 | 22 X 22 mm, dikte 0,13 - 0,17 mm |
| DAPI | 2-(4-amidinofenyl)-1H -indole-6-carboxamide | ||
| Foetaal runderserum | Biowest | S1810 | Wordt gebruikt om trypsinewerking te inactiveren |
| Fiji software (ImageJ) | National Institutes of Health | RRID:SCR_002285 | Gratis download, geen licentie nodig |
| Glazen Pasteur Pipetten | |||
| Glazen schuifjes | Fisherbrand | 11844782 | |
| Geitenserum | Biowest | S2000 | Wordt gebruikt voor immunofluorescentie van 3D-structuren |
| Hittebestendige handschoenen | Wordt gebruikt voor agarmanipulatie na autoclaaf | ||
| Verwarmingsbad (37 ºC) | Wordt gebruikt om oplossingen te temperen voorafgaand aan celsubcultuur | ||
| Verwarmingsbad (42 ºC) | Wordt gebruikt om agar warm te houden | ||
| Verwarmingsplaat | Wordt gebruikt voor Matrigel-dehydratie | ||
| Vochtigheidskamer | Wordt gebruikt voor de incubatie van antilichamen tijdens immunofluorescentie | ||
| IJs | Wordt gebruikt tijdens Matrigel-manipulatie | ||
| IJsbox | |||
| Omgekeerde optische microscoop | Olympus | IX71 | |
| Matrigel Matrix | Becton Dickinson | 354234 | Bewaar bij -20 ºC en koel houden wanneer in gebruik. Wordt ook wel basement membrane matrix genoemd |
| Methanol | PanReac AppliChem | 131091 | Wordt gebruikt voor fixatie van 3D-structuren voorafgaand aan immunofluorescente markering |
| Micropipet | p1000, p200 en p10 | ||
| Microsoft Office Excel | Microsoft | RRID:SCR_016137 | Wordt gebruikt om de populatiedubbeling te berekenen en om de groeiversnellingsvergelijking te verkrijgen |
| MilliQ water | Wordt ook wel ultrapuur water genoemd | ||
| Nail Polish | Wordt gebruikt om monsters te verzegelen na montage | ||
| Parafilm M | Bemis | PM-999 | Wordt gebruikt om antilichaamoplossing tijdens incubatie te bedekken |
| PBS pH 7,4 (zonder calcium & magnesium) | Gibco | 10010-056 | Steriel. Wordt gebruikt voor celsubcultuur |
| PBS tabletten | Sigma-Aldrich | P4417 | Verdun in milliQ water. Geen steriliteit vereist. Wordt gebruikt voor immunofluorescentie |
| Pipet hulpmiddel | |||
| Primaria T25 kolven | Corning | 353808 | Wordt gebruikt voor BPEC-cultuur |
| Scepter Geautomatiseerde Celteller | Millipore | PHCC20060 | Gebruik alternatief een hemocytometer |
| Schaar | Wordt gebruikt om pipet tips en parafilm te snijden | ||
| Steriele |
Referenties
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Stampfer, M. R., Yaswen, P. Culture models of human mammary epithelial cell transformation. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (4), 365-378 ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
