Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In Vitro Evaluatie van Oncogene Transformatie in Human Mammary Epithelial Cells

4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61716

⸱

24 september 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, Physiology and Immunology, Universitat Autònoma de Barcelona, 2Optical Microscopy Core Facilities, IDIBELL, 3Hereditary Cancer Program, Catalan Institute of Oncology, IDIBELL, 4Program in Molecular Mechanisms and Experimental Therapy in Oncology (Oncobell), IDIBELL, 5New Therapeutic Strategies in Cancer Group. Department of Biochemistry and Molecular Biomedicine, School of Biology, Institute of Biomedicine, University of Barcelona (IBUB), 6Department of Biochemistry & Physiology, School of Pharmacy and Food Sciences, University of Barcelona, 7Department of Biosciences, Faculty of Sciences and Technology, University of Vic

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol biedt experimentele in vitro tools om de transformatie van menselijke borstcellen te evalueren. Gedetailleerde stappen naar de follow-up cel proliferatie tarief, verankering-onafhankelijke groeicapaciteit, en de distributie van cellijnen in 3D-culturen met kelder membraan matrix worden beschreven.

Samenvatting

Tumorigenese is een proces in meerdere stappen waarin cellen mogelijkheden verwerven die hun groei, overleving en verspreiding onder vijandige omstandigheden mogelijk maken. Verschillende tests zijn gericht op het identificeren en kwantificeren van deze kenmerken van kankercellen; echter, ze richten zich vaak op een enkel aspect van cellulaire transformatie en, in feite, meerdere tests nodig zijn voor hun juiste karakterisering. Het doel van dit werk is om onderzoekers te voorzien van een reeks instrumenten om cellulaire transformatie in vitro vanuit een breed perspectief te beoordelen, waardoor het mogelijk is om goede conclusies te trekken.

Een aanhoudende proliferative signaling activatie is het belangrijkste kenmerk van tumorweefsels en kan gemakkelijk worden gecontroleerd onder in vitro omstandigheden door het berekenen van het aantal populatieverdubbelingen bereikt in de tijd. Bovendien maakt de groei van cellen in 3D-culturen hun interactie met omringende cellen mogelijk, die lijkt op wat er in vivo gebeurt. Dit maakt de evaluatie van cellulaire aggregatie mogelijk en, samen met immunofluorescente etikettering van onderscheidende cellulaire markers, om informatie te verkrijgen over een ander relevant kenmerk van tumorale transformatie: het verlies van een goede organisatie. Een ander opmerkelijk kenmerk van getransformeerde cellen is hun vermogen om te groeien zonder gehechtheid aan andere cellen en aan de extracellulaire matrix, die kan worden geëvalueerd met de verankeringstest.

Gedetailleerde experimentele procedures om de groei van cellen te evalueren, om immunofluorescente etikettering van cellijnmarkers in 3D-culturen uit te voeren en om verankering-onafhankelijke celgroei in zachte agar te testen, worden verstrekt. Deze methoden zijn geoptimaliseerd voor borst primary epitheelcellen (BPEC) vanwege de relevantie ervan bij borstkanker; Na enkele aanpassingen kunnen echter procedures worden toegepast op andere celtypen.

Inleiding

Meerdere opeenvolgende gebeurtenissen zijn vereist voor de ontwikkeling van het neoplasma. In 2011 beschreven Hanahan en Weinberg 10 vermogens die de groei, overleving en verspreiding van getransformeerde cellen mogelijk maken: de zogenaamde "Hallmarks of Cancer"1. De hier beschreven methodologie stelt drie verschillende instrumenten samen om in vitro cellulaire transformatie te evalueren door zich te concentreren op enkele onderscheidende kenmerken van de tumorcellen. Deze technieken beoordelen de celproliferatiesnelheid, het gedrag van cellen wanneer gekweekt in 3D en hun vermogen om kolonies met ankerveronafhankelijkheid te vormen.

Celmodellen zijn cruciaal om hypothese in vitro te testen. Er zijn verschillende benaderingen ontwikkeld om experimentele modellen van cellulaire transformatie te genereren voor de studie van kanker2,3,4. Aangezien borstkanker is de meest voorkomende kanker onder vrouwen wereldwijd en is verantwoordelijk voor ongeveer 15% van de sterfgevallen door kanker onder vrouwen5, het verstrekken van geschikte cellulaire modellen van borstepitheelcellen is van het grootste belang voor verder onderzoek. In dit artikel hebben we het potentieel van drie technieken geïllustreerd om cellulaire transformatie te evalueren met behulp van een experimenteel model van borstwerkelijke epitheelcellen (BPC's) transformatie aanvankelijk beschreven door Ince en collega's in 20076 en later geïmplementeerd in ons laboratorium7. Dit experimentele model is gebaseerd op de sequentiële wijziging van drie gerichte genen (SV40 Large T en kleine t-antigenen hierin aangeduid als Ttag, hTERTen HRAS) op het genoom van niet-getransformeerde BBC's. Bovendien, de methode die wordt gebruikt voor BPECs afleiding bevordert het behoud van borstepileliale cellen met luminale of myoepithelial markers, wat resulteert in een heterogene celcultuur die een aantal van de borstklier fysiologische eigenschappen behoudt.

In de borstklier bevinden zich borstlichaamcellen, die verantwoordelijk zijn voor de melkproductie, in de buurt van het lumen, terwijl myoepitheliale cellen rond luminale cellen worden verwijderd en zorgen voor samentrekkingsbewegingen die de melk naar de tepel leiden. Het verlies van de juiste organisatie tussen deze cellijnen is een kenmerk van tumorale transformatie8 die in vitro kan worden beoordeeld na immunofluorescente detectie van onderscheidende afstammingmarkers in 3D-celculturen. Een ander belangrijk kenmerk van tumorcellen is hun vermogen om te groeien zonder gehechtheid aan andere cellen en aan de extracellulaire matrix1. Wanneer gezonde cellen worden gedwongen om te groeien in suspensie, mechanismen zoals anoikis \u2012 een soort celdood geïnduceerd in reactie op detachement van de extracellulaire matrix \u2012 worden geactiveerd9. De ontduiking van celdood is een van de kenmerkende kenmerken van kanker en dus zijn getransformeerde cellen in staat om anoikis te activeren en op een ankeronafhankelijke manier te overleven. Deze capaciteit kan in vitro worden geëvalueerd met de verankering-onafhankelijke test met behulp van zachte agar. Bovendien is een inherent kenmerk van tumorweefsels hun aanhoudende proliferative signaleringscapaciteit, die gemakkelijk kan worden gecontroleerd onder in vitro omstandigheden door de toename van het aantal cellen langs de tijd te meten, niet alleen in suspensietesten, maar ook door het toezicht op de groeisnelheid van monolaagaanhangende culturen.

Ondanks het beste model om tumorigenic potentieel te testen is de inenting van tumorcellen in murinemodellen en evaluatie van tumorontwikkeling in situ, is het belangrijk om het aantal dieren dat in experimentele procedures wordt aangewend zo veel mogelijk te minimaliseren. Daarom is het hebben van geschikte tests om transformatie in vitro te beoordelen een topprioriteit. Hier bieden we een reeks tools om het tumorigenic potentieel van gedeeltelijk en volledig getransformeerde borsteptropelial cellen te evalueren die gemakkelijk kunnen worden geïmplementeerd in de meeste laboratoria die werken met cellulaire transformatiemodellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Menselijke monsters gebruikt in de volgende experimenten werden verkregen uit vermindering mammoplasties uitgevoerd bij Clínica Pilar Sant Jordi (Barcelona) onder standaard procedure toestemming. Alle procedures worden uitgevoerd in een klasse II Biological Safety Cabinet, tenzij anders vermeld.

1. In vitro cultuur van menselijke borstpitheelcellen en groeicurve plot opbouw

  1. In vitro cultuur van borst primaire epitheelcellen (BPC's): cel doorgeven
    OPMERKING: Voor BPEC afleiding en celcultuur volgen instructies beschreven door Ince et al., 20076.
    1. Gemiddelde voorbereiding.
      1. Supplement WIT basaal gedefinieerd medium met P of T supplementen, verstrekt door de fabrikant, afhankelijk van de vraag of primaire of getransformeerde BBC's zijn gekweekt.
      2. Voeg choleratoxine toe aan het bijgevulde WIT-medium tot een uiteindelijke concentratie van 100 ng/mL voor primaire of 25 ng/mL voor getransformeerde BBC's.
        LET OP: Cholera toxine is fataal bij inslikken. Gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen. Vermijd de afgifte ervan aan het milieu.
    2. Celcultuur onderhoud en passaging.
      OPMERKING: Houd er bij de volgende stappen rekening mee dat cellen groeien in een T25-kolf. Niettemin kunnen volumes worden aangepast aan andere celkweekformaten, waarbij de evenredigheid in termen van oppervlakte behouden blijft.
      1. Controleer de cel samenvloeiing elke dag. Wanneer de cultuur is 90% confluent, uit te voeren cel passaging.
      2. Verkrijg 1x PBS, 3x trypsine, medium en een 15 mL conische buis met 2 ml Foetale Runderserum (FBS) voor elke kolf.
      3. Haal het medium uit de kolf en bewaar het in de 15 mL conische buis met FBS.
      4. Spoel cellen af met 1x PBS.
      5. Maak cellen los van het oppervlak door 1 mL van 3x trypsine toe te voegen. Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C.
      6. Controleer of de cellen zijn losgemaakt. Breng krachtig schudden als de cellen niet volledig los.
      7. Activeer trypsine door het gereserveerde medium aangevuld met FBS toe te voegen.
      8. Oogst de cellulaire suspensie en plaats deze in de 15 mL conische buis.
      9. Centrifuge op 500 x g gedurende 5 min, elimineren van de supernatant, en resuspend de pelleted cellen door flicking de onderkant van de buis met een vinger.
      10. Voeg 1-2 mL verse media toe aan de pellet en meet de celconcentratie met behulp van een automatische celteller of een hemocytometer. Deze gegevens zullen later worden gebruikt om de bevolkingsverdubbelingen te berekenen en de groeicurve te trekken. Zaad 12.000 cellen/cm2 (bijvoorbeeld 300.000 cellen voor een T25-kolf) in gemodificeerde celkweekoppervlakkolven (zie Tabel van materialen).
        OPMERKING: Verdun de celsuspensieoplossing als de concentratie te hoog is om een goede kwantificering te garanderen.
      11. Voeg medium toe aan een eindvolume van 5 mL en broed de cellen uit bij 37 °C en 5% CO2 atmosfeer.
      12. Vervang het celkweekmedium om de 48 uur.
  2. Populatieverdubbelingsberekening en gegevensvisualisatie
    1. Met behulp van gegevens van het aantal cellen dat in stap 1.1.2.10 is verkregen, past u de volgende formule toe om de geaccumuleerde populatieverdubbeling (PD)-waarden te verkrijgen:
      figure-protocol-1
      Wanneer PDi het aantal populatieverdubbelingen aangeeft dat de cellen tot de vorige subcultuur hebben bereikt (het verwijst naar de PD die zich op de vorige subcultuur heeft verzameld), is Nh het aantal geoogste cellen en Ns is het aantal gezaaide cellen.
    2. Gegevens vertegenwoordigen voor een specifiek tijdsinterval met behulp van een XY-grafiek waarin het aantal dagen in cultuur(x-as)en de geaccumuleerde PD(y-as)worden weergegeven.
    3. Krijg de best passende lijn en de passende vergelijking:
      figure-protocol-2
      OPMERKING: Een verhoogde helling (b) betekent een verhoogd proliferatiepercentage.

2. Driedimensionale (3D) cultuur in keldermembraanmatrix en immunofluorescente eiwitdetectie

  1. 3D-cultuur in keldermembraanmatrix
    LET OP: Dit protocol is aangepast van Debnath et al., 200310 en is geoptimaliseerd voor 24 putplaten (zie Tabel van Materialen).
    1. Bereid het materiaal een dag voor het experiment: pre-chill kelder membraan matrix 's nachts bij 4 °C en laat pipet tips, microcentrifuge buizen, en goed platen afkoelen in de vriezer.
      LET OP: De matrix moet op -20 °C worden bewaard voor langdurige opslag. Maak aliquots om te voorkomen dat meerdere vries-dooi cycli.
    2. Plaats op de dag van het experiment voorgekoeld materiaal op ijs.
    3. Spoel putten met koude steriele 1x PBS om de oppervlaktespanning te verminderen.
    4. Bedek de bodem van elke put met 100 μL keldermembraanmatrix.
      LET OP: Doe de matrix langzaam af en verspreid deze over de put; het is van cruciaal belang om bellenvorming in de onderste laag te voorkomen om de groei van de monolaagcelkweek af te wenden.
    5. Plaats de plaat in de couveuse, op 37 °C, om de matrixlaag te laten stollen.
      LET OP: Het duurt meestal ongeveer 20 minuten om te stollen.
    6. Probeer cellen ondertussen zoals eerder uitgelegd in stap 1.1. Centrifugeren de cellen op 500 x g gedurende 5 min en resuspend in medium. Bereid een 400.000 cellen / mL suspensie en voorzichtig uiteen elke cel klomp door pipetten.
    7. Bereid het medium met 8% keldermembraanmatrix en meng 1:1 (v/v) met cellulaire suspensie om een 200.000 cellen/mL-oplossing in 4% matrix te verkrijgen.
      OPMERKING: Bereken de hoeveelheid medium die nodig is om matrix onnodig afval te voorkomen.
    8. Plaats 500 μL celsuspensie in matrixoplossing bovenop de reeds gestolde matrixlaag om een totale hoeveelheid van 100.000 cellen in medium met 4% keldermembraanmatrix te zaaien.
    9. Incubeercellen bij 37 °C gedurende een paar minuten en voeg vervolgens 500 μL van het medium toe met 4% keldermembraanmatrix. Incubeer de cellen bij 37 °C in een couveuse met 5% CO2 gedurende 14 dagen. Gezaaide cellen zullen groeperen en zich vermenigvuldigen om de acini-achtigestructuren te ontstaan.
      OPMERKING: Celmotiliteit en aggregatie kunnen worden gecontroleerd door time-lapse tijdens het 3D-vormingsproces. Gebruik software voor beeldanalyse (bijvoorbeeld Fiji/ImageJ of Imaris) om deze gebeurtenissen te evalueren. Het aantal en de grootte van de acini zijn afhankelijk van het aggregatieproces en de proliferatiesnelheid en kunnen variëren tussen celtypen. Pas de keldermembraanmatrixconcentratie en gezaaide cellen aan om de gewenste 3D-structuren te verkrijgen.
    10. Voeg 500 μL van het medium toe met 4% keldermembraanmatrix 2-3 keer per week.
      OPMERKING: Voorkom verstoring van de lagen die de plaat voorzichtig dragen tijdens manipulatie.
    11. Indien gewenst kunnen het aantal en de grootte van acini worden gemeten tijdens de cultuurperiode. Om dit te doen, neem willekeurige foto's op verschillende tijdstippen na het zaaien met behulp van een fase contrast of DIC omgekeerde microscoop. Gebruik beeldanalysesoftware om de diameter van 100-200 3D-structuren te meten.
  2. Immunostaining
    LET OP: Steriele omstandigheden zijn niet vereist tijdens dit deel van het protocol.
    1. Verwijder het cultuurmedium.
    2. Scheur de kelder membraan matrix met behulp van een p200 pipet tip met het einde afgesneden. Plaats ~50 μL uitgesplitste matrix bovenop een glazen schuif en smeer deze in een gebied van 1-2 cm2.
    3. Laat het monster volledig drogen bij kamertemperatuur of gebruik een verwarmingsplaat bij 37 °C om het proces te versnellen. Fix monsters met methanol:aceton (1:1, v/v) op -20 °C gedurende 30 min.
      OPMERKING: Fluorescerend signaal van eerdere markers, zoals die van fluorescerende eiwitten uitgedrukt door de cellen, zal worden gewist.
      LET OP: Methanol is ontvlambaar, giftig bij inademing, ingeslikt of in geval van contact met de huid. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen en werk in een rookkap.
    4. Gooi de fixatieoplossing weg en verwijder het eventuele overtollige risico door de schuif op filterpapier te plaatsen.
      LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken. Eenmaal droog kunnen dia's enkele maanden bij -20 °C worden bewaard.
    5. Blokkeer monsters epitopes met 5% normaal geitenserum en 0,1% triton-X-100 in 1x PBS (blokkeeroplossing) voor 2 uur bij kamertemperatuur.
    6. Bereid ondertussen antilichamen voor door primaire of secundaire antilichamen te verdunnen bij de gewenste concentratie in blokkeringsoplossing.
      OPMERKING: De concentratie van antilichamen moet nauwkeurig worden aangepast, afhankelijk van het celtype en de referentie van het antilichaam. Als leidraad kunnen primaire anti-Cytokeratine 14- en anti-Claudin-IV-antilichamen (zie Tabel van materialen)worden gebruikt om cellen van luminale en myopitheliale afstammingen in BPEC te identificeren. De aanbevolen concentratie van werkoplossing is 1:100 voor deze primaire antilichamen en 1:500 voor anti-muis- en anti-konijn secundaire antilichamen (zie tabel met materialen).
    7. Voeg 30 μL primaire antilichamen werkoplossing toe en bedek deze met een strook laboratoriumverpakkingsfolie om verdamping te voorkomen. Incubeer 's nachts bij 4 °C in een vochtige kamer.
    8. Was drie keer met 1x PBS voor 1 uur per stuk.
    9. Herhaal stap 2.2.7 voor secundaire antilichamen. Incubatie moet worden uitgevoerd in het donker.
    10. Was met 1x PBS voor 2 uur.
      OPMERKING: Pas de concentratie van antilichamen, incubatietijd en washardheid aan om de signaal-ruisverhouding voor specifieke monsters te verbeteren.
    11. Verwijder de resterende PBS en, eenmaal droog, counterstain met DAPI op 0,25 μg/mL verdund in antifade montagemedium. Bedek dia's met een coverslip door het te laten bezinken zonder druk uit te oefenen. Verzegel met nagellak.
      LET OP: Monsters kunnen enkele weken bij 4 °C worden bewaard. Voor langdurige opslag, houd ze op -20 °C.
    12. Analyseer fluorescerende signaalverdeling voor elke acinus met behulp van een confocale microscoop.
      OPMERKING: De confocale microscoopconfiguratie moet nauwkeurig worden bepaald, afhankelijk van de gebruikte apparatuur en de antilichamen die op het monster worden aangebracht. Als een gids, met de apparatuur en reagentia beschreven in de tabel van materialen, gebruik maken van een 40x doelstelling en de volgende laser en detector instellingen: voor DAPI gebruik excitatie met een 405 laser (3%-5%), detectie met een PMT detector (800V, Offset: -9) en een spectrale band van 410 nm tot 500 nm; voor A488 (Claudin-IV) gebruik excitatie met een 488 laser (7%-10%), detectie met een PMT detector (800V, Offset: -20) en een spectrale band van 490 nm tot 550 nm; en voor Cy3 (Cytokeratin 14) gebruik excitatie met een 555 laser (2%-10%), detectie met een PMT detector (800V, Offset: -35) en een spectrale band van 560 nm tot 600 nm.

3. Anchorage-onafhankelijke test, MTT-kleuring en automatische koloniekwantificering

  1. Anchorage-onafhankelijke test: agar en cellulaire vering beplating
    OPMERKING: Protocol is aangepast van Borowicz et al., 201411 om experimenten in BPC's uit te voeren.
    1. Bereid een 1,2% agar-oplossing verdund in ultrazuiver water in een steriele fles. Autoclave de oplossing en onderhoud het op 42 °C tijdens het experiment. De agar-oplossing kan bij 4 °C worden opgeslagen; verwarm de agar-oplossing indien nodig totdat deze weer vloeibaar is.
      LET OP: Gebruik hittebestendige handschoenen om te voorkomen dat branden na autoclave.
      LET OP: Vanaf nu moeten steriele omstandigheden worden gehandhaafd.
    2. Bereid een 0,6% agar-oplossing door 1:1 (v/v) volledig voorverwarmd medium te mengen met 1,2% agar-oplossing. Handhaven op 42 °C om voortijdige verharding te voorkomen.
      LET OP: Medium kan eerder dubbel worden aangevuld om een volledig aangevulde 0,6% agar + medium oplossing te verkrijgen eenmaal gemengd.
    3. Bedek de onderkant van een 35 mm goed met 1,5 mL van 0,6% agar in medium oplossing en laat het stollen bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de bodem van de plaat volledig is afgedekt vóór agar stolling, anders kunnen cellen zich aan de plaat hechten en in monolaag groeien.
      OPMERKING: Aanhangende en niet-aanhangende oppervlakteplaten kunnen worden gebruikt.
    4. Ondertussen proberen cellen te stoppen en, eenmaal centrifuged en opnieuw op te stellen in medium, bereiden een 50.000 cellen / ml oplossing en zachtjes desaggen een cel klomp door herhaaldelijk pipetteren.
    5. Bereid een 0,3% agar + celsuspensie in het medium voor bij een uiteindelijke concentratie van 25.000 cellen/mL.
      OPMERKING: Optimale celconcentratie kan verschillen tussen celtypen. Probeer verschillende concentraties totdat geïndividualiseerde kolonies worden gevormd.
      1. Plaats een 40 μm zeeffilter bovenop een steriele buis van 50 mL en filter de 50.000 cellen/mL-oplossing waardoor het in de bodem van de buis kan vallen.
      2. Haal het filter uit de steriele buis van 50 mL, kantel de celhoudende buis naar een hoek van 45° en laat hetzelfde volume van 0,6% agar + medium oplossing door de binnenwand van de buis gieten. Hierdoor kan de agar-oplossing net genoeg afkoelen om de cellen niet te beschadigen en de voortijdige verharding ervan te voorkomen.
    6. Homogenize het mengsel en deponeren 1 mL van 0,3% agar + cel suspensie in het medium (met 25.000 cellen) op de top van de eerder gestolde bodem agar laag.
    7. Visualiseer gezaaide cellen met behulp van een omgekeerde microscoop om ervoor te zorgen dat de cellen worden geïndividualiseerd. Anders moet het experiment worden herhaald.
    8. Wacht tot de agarlaag volledig gestold is en voeg vervolgens voorzichtig 1 mL van het verse medium toe aan de bovenkant zonder de delicate agarlagen eronder te verstoren.
    9. Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 3 weken in een couveuse.
      OPMERKING: De tijd die nodig is voor kolonievorming kan variëren tussen verschillende celtypen, maar meestal zijn 3 weken voldoende.
    10. Wissel twee keer per week van medium. Om dit te doen, voorzichtig kantelen van de plaat naar je toe, aanzuigen medium in de onderste hoek, en voeg 1 mL van vers medium.
      OPMERKING: Raak de agarlagen niet aan omdat ze gemakkelijk loskomen van de plaat.
  2. MTT-kleuring
    1. Bereid de thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) voorraadoplossing op 6 mg/mL in ultrazuiver water in een steriele fles en filteroplossing met 0,2 μm filters. Deze MTT-oplossing kan maximaal 6 maanden bij -20 °C worden bewaard.
      LET OP: MTT kan irritatie veroorzaken en wordt verdacht van het veroorzaken van genetische afwijkingen. Gebruik een veiligheidsbril, handschoenen en een ademhalingsfilter.
      OPMERKING: Vermijd herhaalde vriesdooicycli.
    2. Bereid een werkoplossing van MTT op 1 mg/mL door de voorraadoplossing te verdunnen met steriel ultrazuiver water.
    3. Zodra de kolonievormingsperiode is afgelopen, verwijder het medium van de plaat en voeg 1 mL van 1 mg/mL MTT toe aan elke put.
    4. Incubeer voor 24 uur in de couveuse. Verwijder de MTT-oplossing door deze voorzichtig te aspireren. Platen kunnen enkele weken bij 4 °C worden bewaard.
      OPMERKING: Vermijd blootstelling aan licht om niet-specifieke kristalvorming te voorkomen.
  3. Koloniekwantificering
    1. Verkrijg beelden van elke plaat met behulp van een omgekeerde microscoop. Pas de vergroting aan om het maximale gezichtsveld te verkrijgen met minder afbeeldingen en nog steeds in staat om kleine kolonies te detecteren (meestal 4x of 10x doelstellingen).
      OPMERKING: Zorg ervoor dat afbeeldingen een homogene achtergrond vertonen. Er is geen fasecontrast of differentieel interferentiecontrast vereist, omdat niet-gekleurde kolonies niet zullen worden gekwantificeerd.
    2. Upload afbeeldingen naar ImageJ/Fiji software12 om het aantal kolonies en het gebied van elke MTT-positieve kolonie te tellen.
      OPMERKING: Een script voor automatische kwantificering wordt verstrekt als een aanvullend bestand. Als u de code wilt uitvoeren, plakt u deze op de macro-editor(Plugins | Nieuwe | Macro) en volg de instructies.
      1. Een binair masker verkrijgen door de oorspronkelijke afbeelding te thresholderen(afbeelding | | aanpassen drempel) om goed afgebakende kolonies te verkrijgen (figuur 1).
        OPMERKING: 8- of 16-bits afbeeldingen zijn meestal vereist om deze stap uit te voeren. De methode "Minimumdrempel" wordt aanbevolen.
      2. Voer de Extended Particle Analyzer uit Biovoxxel plugin13 (Plugins | BioVoxxel | Extended Particle Analyzer) om MTT positieve kolonies te identificeren(figuur 2). Eerste leidende voorwaarden: Grootte (μm2) = 250–Oneindigheid; Degelijkheid = 0,75–1,00.
    3. Schat de gemiddelde diameter (D) van elke waarde van het koloniegebied (A) volgens de formule:
      figure-protocol-3
    4. Filterresultaten door het uitsluiten van lage proliferative kolonies (bijvoorbeeld lage diameter).
      1. Kies een minimum aantal divisies per week(m)dat in aanmerking moet worden genomen (bijv. 1).
      2. Schat de straal van een kolonie(R) met n cellen volgens de volgende formule:
        figure-protocol-4
        Wanneer, r is de gemiddelde straal van individuele cellen in suspensie, n is het aantal cellen die een kolonie die leed m divisies elke week tijdens w weken in de cultuur. In exponentiële groei: n = 2(m*w). ρ is de verpakkingsefficiëntie. Merk op dat, in willekeurige beweging, de verpakkingsefficiëntie ~0,64 is en de dichtst mogelijke verpakkingsfractie voor identieke bollen 0,7414is.
      3. Gooi alle kolonies die een diameter lager dan 2R als hun cellen hebben niet bereikt het minimum aantal divisies beschouwd in stap 3.3.4.1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Er werd gekozen voor een experimenteel model van cellulaire transformatie met de introductie van drie genetische elementen in BPC's om representatieve resultaten van oncogene transformatie te genereren6,7 (figuur 3). Niet-getransformeerde BPC's(N)werden afgeleid van ziektevrij borstweefsel zoals beschreven door Ince en collega's6 en gekweekt volgens het hier aangegeven protocol. Na he...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De experimentele protocollen beschreven in dit document bieden nuttige instrumenten om de oncogene transformatie van in vitro gekweekte cellen te beoordelen. Elke techniek evalueert specifieke aspecten van het transformatieproces, en daarom moet bijzondere aandacht worden besteed aan het trekken van conclusies uit een enkele analyse. Groeicurven opbouw is een aanpak die informatie die al beschikbaar is bij het kweken van cellen voor andere doeleinden vereist. Dat maakt deze techniek goedkoper en gemakkelijker toe te pass...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Het AG-laboratorium wordt gefinancierd door de Spaanse Raad voor nucleaire veiligheid. T.A. en A.G. zijn lid van een door Generalitat de Catalunya erkende onderzoeksgroep (2017-SGR-503). MT heeft een contract gefinancierd door de Wetenschappelijke Stichting Asociación Española Contra el Cáncer [AECC-INVES19022TERR]. G.F. contract wordt gefinancierd door een subsidie van Cellex Foundation.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 ml Serologische PipettenLabclinicsPLC91001
1.5 ml EppendorfsThermo Fisher Scientific3451Donkere eppendorfs worden bij voorkeur gebruikt voor langdurige opslag van MTT
10 µl Pipet tips zonder filterBiologix20-0010
100 ml glazen flesMet dop, autoklaveerbaar
1000 µl Pipet tips met filterLabclinicsLAB1000ULFNL
1000 µl Pipet tips zonder filterBiologix20-1000
15 ml Conische buisjesVWR525-0400
2 ml Serologische PipettenLabclinicsPLC91002
200 µl Pipet tips met filterLabclinicsFTR200-96
5 ml Serologische PipettenLabclinicsPLC91005
50 ml Conische buisjesVWR525-0304
AcetonPanReac AppliChem211007Wordt gebruikt voor fixatie van 3D-structuren voorafgaand aan immunofluorescente markering
AgarSigma-AldrichA1296Wordt gebruikt voor verankeringstest
Anti-Claudin 4 antilichaamAbcam15104, RRID:AB_301650Werkverdunning 1:100, gastheer: konijn
Anti-Cytokeratin 14 [RCK107] antilichaamAbcam9220, RRID:AB_307087Werkverdunning 1:100, gastheer: muis
Anti-muis Cyanine Cy3 antilichaamJackson ImmunoResearch Inc.115-165-146, RRID:AB_2338690Werkverdunning 1:500, gastheer: geit
Anti-konijn Alexa Fluor 488 antilichaamThermo Fisher ScientificA-11034, RRID:AB_2576217Werkverdunning 1:500, gastheer: geit
Autoclaaf
BioVoxxel ToolboxRRID:SCR_015825
Celcultuur 24-well PlaatLabclinicsPLC30024Wordt gebruikt voor 3D-culturen in Matrigel. Platte bodem
Celcultuur 6-well PlaatLabclinicsPLC30006Wordt gebruikt voor verankeringstest
Cel incubator (37 ºC en 5 % CO2)
Cel zeefjesFisherbrand11587522Maaswijdte: 40 µm
CellSense softwareOlympusWordt gebruikt voor beeldacquisitie
Centrifuge
Cholera Toxin van Vibrio choleraeSigma-AldrichC8052Wordt gebruikt om celcultuurmedium aan te vullen
Biologische veiligheidskast Klasse IIHerasafeHAEREUS HS12
Confocale omgekeerde microscoopLeicaTCS SP5
DekglaasjesWiteg Labortechnik GmbH460012222 X 22 mm, dikte 0,13 - 0,17 mm
DAPI2-(4-amidinofenyl)-1H -indole-6-carboxamide
Foetaal runderserumBiowestS1810Wordt gebruikt om trypsinewerking te inactiveren
Fiji software (ImageJ)National Institutes of HealthRRID:SCR_002285Gratis download, geen licentie nodig
Glazen Pasteur Pipetten
Glazen schuifjesFisherbrand11844782
GeitenserumBiowestS2000Wordt gebruikt voor immunofluorescentie van 3D-structuren
Hittebestendige handschoenenWordt gebruikt voor agarmanipulatie na autoclaaf
Verwarmingsbad (37 ºC)Wordt gebruikt om oplossingen te temperen voorafgaand aan celsubcultuur
Verwarmingsbad (42 ºC)Wordt gebruikt om agar warm te houden
VerwarmingsplaatWordt gebruikt voor Matrigel-dehydratie
VochtigheidskamerWordt gebruikt voor de incubatie van antilichamen tijdens immunofluorescentie
IJsWordt gebruikt tijdens Matrigel-manipulatie
IJsbox
Omgekeerde optische microscoopOlympusIX71
Matrigel MatrixBecton Dickinson354234Bewaar bij -20 ºC en koel houden wanneer in gebruik. Wordt ook wel basement membrane matrix genoemd
MethanolPanReac AppliChem131091Wordt gebruikt voor fixatie van 3D-structuren voorafgaand aan immunofluorescente markering
Micropipetp1000, p200 en p10
Microsoft Office ExcelMicrosoftRRID:SCR_016137Wordt gebruikt om de populatiedubbeling te berekenen en om de groeiversnellingsvergelijking te verkrijgen
MilliQ waterWordt ook wel ultrapuur water genoemd
Nail PolishWordt gebruikt om monsters te verzegelen na montage
Parafilm MBemisPM-999Wordt gebruikt om antilichaamoplossing tijdens incubatie te bedekken
PBS pH 7,4 (zonder calcium & magnesium)Gibco10010-056Steriel. Wordt gebruikt voor celsubcultuur
PBS tablettenSigma-AldrichP4417Verdun in milliQ water. Geen steriliteit vereist. Wordt gebruikt voor immunofluorescentie
Pipet hulpmiddel
Primaria T25 kolvenCorning353808Wordt gebruikt voor BPEC-cultuur
Scepter Geautomatiseerde CeltellerMilliporePHCC20060Gebruik alternatief een hemocytometer
SchaarWordt gebruikt om pipet tips en parafilm te snijden
Steriele

Referenties

  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  2. Stampfer, M. R., Yaswen, P. Culture models of human mammary epithelial cell transformation. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (4), 365-378 (2000).
  3. Schinzel, A. C., Hahn, W. C. Oncogenic transformation and experimental models of human cancer. Frontiers in Bioscience : A Journal and Virtual Library. 13 (13), 71(2008).
  4. Balani, S., Nguyen, L. V., Eaves, C. J. Modeling the process of human tumorigenesis. Nature Communications. 8 (1), 15422(2017).
  5. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
  6. Ince, T. A., et al. Transformation of different human breast epithelial cell types leads to distinct tumor phenotypes. Cancer Cell. 12 (2), 160-170 (2007).
  7. Repullés, J., et al. Radiation-induced malignant transformation of preneoplastic and normal breast primary epithelial cells. Molecular Cancer Research. , 1-13 (2019).
  8. Weigelt, B., Bissell, M. J. Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer. Seminars in Cancer Biology. 18 (5), 311-321 (2008).
  9. Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
  10. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), San Diego, California. 256-268 (2003).
  11. Borowicz, S., et al. The soft agar colony formation assay. Journal of Visualized Experiments. (92), (2014).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  13. Brocher, J. The BioVoxxel Image Processing and Analysis Toolbox. European BioImage Analysis Symposium. 8 (2), 67112(2015).
  14. Torquato, S., Truskett, T. M., Debenedetti, P. G. Is random close packing of spheres well defined. Physical Review Letters. 84 (10), 2064-2067 (2000).
  15. LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
  16. Zubeldia-Plazaola, A., et al. Glucocorticoids promote transition of ductal carcinoma in situ to invasive ductal carcinoma by inducing myoepithelial cell apoptosis. Breast Cancer Research. 20 (1), 65(2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Populatieverdubbelingen3D celkweekimmunofluorescente labelinganchorage onafhankelijke assaykolonievorming in soft agarconfocale microscopieMTT assaycelproliferatiesnelheid
In Vitro Evaluatie van Oncogene Transformatie in Human Mammary Epithelial Cells
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.