We ontwikkelden een lumbaal tussenwervelschijfdegeneratiemuismodel door resectie van L3-L5 spineuze processen samen met supra- en inter-spineuze ligamenten en loslating van paraspinous spieren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een muismodel van lumbale wervelkolominstabiliteit
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Tussenwervelschijfdegeneratie (IDD) is een veel voorkomende pathologische verandering die leidt tot lage rugpijn. Geschikte diermodellen zijn gewenst voor het begrijpen van de pathologische processen en het evalueren van nieuwe geneesmiddelen. Hier introduceerden we een chirurgisch geïnduceerd LSI-muismodel (Lumbar Spine Instability) dat IDD ontwikkelt vanaf 1 week na de operatie. In detail werd de muis onder narcose geopereerd door lage rughuidincisie, L3-L5 spineuze processen blootstelling, loslating van paraspinous spieren, resectie van processen en ligamenten, en huidsluiting. L4–L5 IVD's werden gekozen voor de observatie. Het LSI-model ontwikkelt lumbale IDD door porositeit en hypertrofie in eindplaten in een vroeg stadium, afname van het tussenwervelschijfvolume, krimp in nucleus pulposus in een tussenstadium en botverlies in lumbale wervels (L5) in een later stadium. Het LSI-muismodel heeft de voordelen van sterke bedienbaarheid, geen behoefte aan speciale apparatuur, reproduceerbaarheid, goedkoop en relatief korte periode van IDD-ontwikkeling. LSI-operatie is echter nog steeds een trauma dat ontsteking veroorzaakt binnen de eerste week na de operatie. Dit diermodel is dus geschikt voor studie van lumbale IDD.
Inleiding
Tussenwervelschijfdegeneratie (IDD) wordt vaak gezien bij veroudering en zelfs jongeren veroorzaakt door vele factoren1. Chirurgie voor patiënten die lijden aan IDD, die lage rugpijn en verminderde beweging veroorzaken, wordt meestal in een later stadium of in ernstige gevallen uitgevoerd en heeft potentiële risico's zoals nonunion of infectie2. Ideale niet-operatieve behandeling vereist een uitgebreid begrip van het IDD-mechanisme. Het IDD-diermodel dient als een cruciaal instrument voor studies van het IDD-mechanisme en de evaluatie van IDD-behandeling.
Grotere dieren zijn gekozen voor IDD-modellen zoals primaten, schapen, geiten, honden en konijnen vanwege hun gelijkenis met de menselijke anatomische structuur in grote mate en de sterke bedienbaarheid in termen van grootte van tussenwervelschijven (IVD's)3,4,5,6,7,8. Deze diermodellen zijn echter tijdrovend en kostenintensief9. Muis IVD is een slechte weergave van de menselijke IVD op basis van geometrische metingen van de beeldverhouding, nucleus pulposus tot schijfgebiedsverhouding en genormaliseerde hoogte10. Ondanks het verschil in grootte vertoont het IVD-segment van de muis lumbale mechanische eigenschappen die vergelijkbaar zijn met menselijke IVD, zoals compressie en torsiestijfheid11. Bovendien heeft het muis-IDD-model het voordeel van lage kosten, relatief korte IDD-ontwikkeling en meer opties voor genetisch gemodificeerde dieren en antilichamen die worden gebruikt in verdere mechanistische studies12,13,14,15.
Experimenteel geïnduceerde IDD-modellen verschillen van de inductoren en toepassingen. Collageenase-geïnduceerde extracellulaire matrix (ECM) degeneratie is bijvoorbeeld geschikt voor ECM regeneratie onderzoek16. Genetisch gemodificeerd fenotype is geschikt voor het bestuderen van de genfunctie in het IDD-proces en in genetische therapieën17. Annulus fibrosus incisie- en rookmodellen bootsen trauma en niet-ontsteking geïnduceerde IDD12,18na .
Spinale instabiliteit (SI) leidt tot een onstabiele wervelkolom die zich niet in een optimale evenwichtstoestand bevindt. Het kan worden veroorzaakt door abnormale beweging van een lumbaal bewegingssegment als gevolg van de zwakte van het omliggende ondersteunende weefsel zoals ligamenten en spieren. Het wordt ook vaak gezien na spinale fusie operatie19. SI wordt beschouwd als de belangrijkste oorzaak van IDD. Daarom streven we ernaar om een SI-muizenmodel te ontwikkelen (gericht op lumbale wervelkolom) dat het menselijke IDD-procesnabootst 20,21.
In het protocol introduceerden we de procedure voor het vaststellen van lumbale spinale instabiliteit (LSI) muismodel door de resectie van lumbale derde (L3) naar lumbale vijfde (L5) spineuze processen samen met de supraspinous en interspinous ligamenten (Figuur 1A,B). Het diermodel ontwikkelt IDD al 1 week na de operatie, zoals blijkt uit hypertrofie en porositeit in eindplaten (EP's). IVD-volume begint 2 weken na de operatie te dalen tot 16 weken, samen met een verhoogde IVD-score, wat de mate van IDD aangeeft. Wij zijn van mening dat de gedetailleerde en gevisualiseerde procedure nuttig is voor onderzoekers om het LSI-muismodel in hun laboratorium vast te stellen en indien nodig toe te passen op IDD-onderzoek.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De beschreven onderzoeken voldoen aan de richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health en zijn goedgekeurd door de Shanghai University of Traditional Chinese Medicine Animal Care and Use Committee. Alle chirurgische manipulaties werden uitgevoerd onder diepe anesthesie en de dieren ondervonden in geen enkel stadium pijn tijdens de procedure.
1. Voorbereiding vóór de operatie
- Instrumentsterilisatie: Stoomsteriliseren van chirurgische instrumenten in een autoclaaf (121 °C gedurende 15 minuten) voorafgaand aan de operatie. Verpak instrumenten in een metalen container en onderhoud ze totdat ze tijdens de operatie worden gebruikt.
- Instelling operatieplatform: Wijs een bankoppervlak van ten minste 60 cm x 60 cm toe voor de operatie. Reinig het oppervlak met 75% alcohol en bedek met een wegwerp medische handdoek. Plaats een steriele chirurgische instrumentenverpakking, reagentia, chirurgische items op een wegwerp medische handdoek binnen de bovenste 1/3 van het gebied. Laat de resterende 2/3 van het gebied schoon voor chirurgische ingreep. Voeg een hotpad toe onder de chirurgische pad voor thermische ondersteuning.
- Dierlijke voorbereiding
- Plaats het dier (C57BL/6J muizen, mannetje, 8 weken oud) in de inductiekamer. Zet de vaporizer aan op een inductieniveau van 4% voor isofluraan en 4 L/min voor zuurstof. Nadat het dier volledig is verdoofd, houdt u het verdovingsmiddel met de neuskegel en de verdoving op een niveau van 1,5% voor isofluraan en 0,4 L/min voor zuurstof tijdens de operatie. Controleer het dier op ademhaling.
- Breng chloortetracycline hydrochloride oogzalf aan om uitdroging van het hoornvlies tijdens de operatie te voorkomen.
- Scheer het operatiegebied op het dorsale oppervlak van het onderste thoracale gebied naar de bovenkant van het sacrale gebied met behulp van een kleine dierentrimmer. Verwijder de geschoren vacht met tissuedoekjes.
- Breng ontharingscrème aan op het geschoren gebied en laat het daar niet langer dan 3 minuten staan. Verwijder de crème met gaas en spoel met 2 ml steriele zoutoplossing van 0,9%.
- Plaats een op maat gemaakte chirurgische cilindrische pad(figuur 2A)onder de buik van de muis om de lumbale wervelkolom op te tillen en de chirurgische operatie te vergemakkelijken.
2. Blootstelling van het lumbale derde aan lumbale vijfde (L3–L5) spineuze processen
- Gebruik de wijsvinger om de onderhuidse spineuze processen van de lumbale wervels aan te raken, die meer naar buiten zijn gericht, en vergelijk met thoracale wervels en sacrale wervels om het lumbale gebied te identificeren.
- Spoel de huid af met 75% alcohol. Voer een midline huidincisie van 3-4 cm uit over het lumbale gebied van het midden-thoracale gebied tot de heup met behulp van een scalpelblad om de fascia bloot te leggen.
- Identificeer de lumbale wervelkolom door de morfologie van de achterste fascia die op de uiteinden van de spineuze processen is ingebracht. In detail onderscheidt de derde lumbale (L3) tot de eerste sacrale (S1) fasciae zich van andere fasciae door hun "V" vormen. De laatste "V"-punt sluit aan op de eerste sacrale (S1) fascia en de eerste "V"-punt komt overeen met het spineuze proces L3 (figuur 2B).
- Maak de achterste paraspinous spierincisies langs de spineuze processen van L3 tot L5 aan beide zijden lateraal met een scalpelblad (Figuur 2C). Controleer de incisiediepte naar de facetten om een bloeding te verminderen.
- Scheid de spierlagen met behulp van twee oftalmische tangen om L3 tot L5 spineuze processen en supraspinous ligamenten bloot te stellen.
3. Resectie van L3–L5 spineuze processen samen met de ligamenten
- Afzonderlijke spineuze processen door interspinous ligamenten af te snijden met behulp van Venusscharen (Figuur 2D).
- Resect de L3–L5 spineuze processen samen met de interspinous ligamenten met Venus scharen (Figuur 2E).
- Hecht de huidincisie met steriele zijde gevlochten (hechtingsgrootte 5.0) zonder herbevestiging van de paravertebrale spieren.
- Breng chloortetracycline hydrochloride oogzalf aan op de chirurgische plaats.
- Dien Buprenorfine-SR (25 uL per gram muisgewicht) toe onmiddellijk na een LSI-operatie voor analgesie.
- Plaats de dieren in een warme kamer en controleer tijdens het herstel van de anesthesie. Controleer de voedsel- en waterinname voordat u de dieren terugstlaat naar de thuiskooi.
- Bewaak het dier eenmaal daags gedurende de eerste 3 dagen na gebruik. Het dier moet een normale eetlust kunnen hebben en moet genezen zonder tekenen van pus, bloeding of zwelling. Ze kunnen een kleine beperking hebben in de voortbeweging.
- Voer schijnoperaties alleen uit door de achterste paravertebrale spieren los te maken van deL 3-L5 wervels.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het LSI-muismodel wordt toegepast in de studies van IDD-mechanisme, IDD-behandeling, endplate (EP) degeneratie zoals sclerose en sensorische innervatie in EP20,21,22,23. De LSI-muis ontwikkelt IDD- en EP-degeneratieve veranderingen, zoals geïdentificeerd, door verminderd IVD-volume en -hoogte, verhoogd EP-volume en verhoogde IVD- en EP-scores.
De ontleedde en vaste o...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We ontwikkelden het lumbale wervelkolominstabiliteitsmuismodel op basis van het cervicale spondylosemuismodel waarbij de achterste paravertebrale spieren van de wervels werden losgemaakt en de spineuze processen samen met de supraspinous en interspinous ligamenten werden gereseceerd25. We voerden een vergelijkbare operatie uit op de lumbale wervelkolom, die meer prominente spineuze processen heeft. Het LSI-muismodel ontwikkelde vergelijkbare IDD in de lumbale wervelkolom.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (81973607) en Essential Drug Research and Development (2019ZX09201004-003-032) van het Ministerie van Wetenschap en Technologie van China.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Chlortetracycline Hydrochloride Eye Ointment | Shanghai General Pharmaceutical Co., Ltd. | H31021931 | Voorkom droge ogen, Voorkom wondinfectie |
| C57BL/6J mannelijke muizen | Tian-jiang Pharmaceuticals Company (Jiangsu, CN) | SCXK2018-0004 | Diermodel |
| Medische wegwerphanddoek | Henan Huayu Medical Devices Co., Ltd. | 20160090 | Platform voor chirurgische operatie |
| Inhalatieanesthesiegereedschap | MIDMARK | Matrx 3000 | Anesthesie |
| Isofluraan | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd. | 1903715 | Anesthesie |
| Lidocaïnehydrochloride | Shandong Hualu Pharmaceutical Co., Ltd. | H37022839 | Pijnverlichting |
| Medische hechtnaald | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | 20S0401J | Huid hechten |
| Oogheelkundige pincet | Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Surgical Instruments Factory | JD1050 | De huid klemmen |
| Oogheelkundige schaar(10cm) | Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Surgical Instruments Factory | Y00030 | Huidincisie |
| Zijde gevlochten | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | 11V0820 | Huid hechten |
| Trimmer voor kleine dieren | Shanghai Feike Electric Co., Ltd. | FC5910 | Haarverwijdering |
| Steriele chirurgische klingen(12#) | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | 35T0707 | Spier incisie |
| Veet haarverwijderingscrème | RECKITT BENCKISER (India) Ltd | NA | Haarverwijdering |
| Venus-schaar | Mingren medisch apparatuur | Lengte:12,5cm | De spier en doornuitsteeksel klemmen |
Referenties
- Makino, H., et al. Lumbar disc degeneration progression in young women in their 20's: a prospective ten-year follow up. Journal of Orthopaedic Science: Official Journal of the Japanese Orthopaedic Association. 22 (4), 635-640 (2017).
- Lee, Y. C., Zotti, M. G. T., Osti, O. L. Operative management of lumbar degenerative disc disease. Asian Spine Journal. 10 (4), 801-819 (2016).
- Wei, F., et al. In vivo experimental intervertebral disc degeneration induced by bleomycin in the rhesus monkey. BMC Musculoskeletal Disorders. 15, 340(2014).
- Lim, K. Z., et al. Ovine lumbar intervertebral disc degeneration model utilizing a lateral retroperitoneal drill bit injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55753(2017).
- Zhang, Y., et al. Histological features of the degenerating intervertebral disc in a goat disc-injury model. Spine. 36 (19), 1519-1527 (2011).
- Bergknut, N., et al. The dog as an animal model for intervertebral disc degeneration. Spine. 37 (5), 351-358 (2012).
- Kong, M. H., et al. Rabbit Model for in vivo Study of Intervertebral Disc Degeneration and Regeneration. Journal of Korean Neurosurgical Society. 44 (5), 327-333 (2008).
- Gullbrand, S. E., et al. A large animal model that recapitulates the spectrum of human intervertebral disc degeneration. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (1), 146-156 (2017).
- Jin, L., Balian, G., Li, X. J. Animal models for disc degeneration-an update. Histology and Histopathology. 33 (6), 543-554 (2018).
- O'Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparative intervertebral disc anatomy across several animal species. 52nd Annual Meeting of the Orthopaedic Research Society. , (2006).
- Elliott, D. M., Sarver, J. J. Young investigator award winner: validation of the mouse and rat disc as mechanical models of the human lumbar disc. Spine. 29 (7), 713-722 (2004).
- Ohnishi, T., et al. In vivo mouse intervertebral disc degeneration model based on a new histological classification. Plos One. 11 (8), 0160486(2016).
- Vo, N., et al. Accelerated aging of intervertebral discs in a mouse model of progeria. Journal of Orthopaedic Research. 28 (12), 1600-1607 (2010).
- Oichi, T., et al. A mouse intervertebral disc degeneration model by surgically induced instability. Spine. 43 (10), 557-564 (2018).
- Ohnishi, T., Sudo, H., Tsujimoto, T., Iwasaki, N. Age-related spontaneous lumbar intervertebral disc degeneration in a mouse model. Journal of Orthopaedic Research. 36 (1), 224-232 (2018).
- Stern, W. E., Coulson, W. F. Effects of collagenase upon the intervertebral disc in monkeys. Journal of Neurosurgery. 44 (1), 32-44 (1976).
- Silva, M. J., Holguin, N. LRP5-deficiency in OsxCreERT2 mice models intervertebral disc degeneration by aging and compression. bioRxiv. , (2019).
- Nemoto, Y., et al. Histological changes in intervertebral discs after smoking and cessation: experimental study using a rat passive smoking model. Journal of Orthopaedic Science: Official Journal of the Japanese Orthopaedic Association. 11 (2), 191-197 (2006).
- Mulholland, R. C. The myth of lumbar instability: the importance of abnormal loading as a cause of low back pain. European Spine Journal. 17 (5), 619-625 (2008).
- Bian, Q., et al. Mechanosignaling activation of TGFβ maintains intervertebral disc homeostasis. Bone Research. 5, 17008(2017).
- Bian, Q., et al. Excessive activation of tgfβ by spinal instability causes vertebral endplate sclerosis. Scientific Reports. 6, 27093(2016).
- Ni, S., et al. Sensory innervation in porous endplates by Netrin-1 from osteoclasts mediates PGE2-induced spinal hypersensitivity in mice. Nature Communications. 10 (1), 5643(2019).
- Liu, S., Cheng, Y., Tan, Y., Dong, J., Bian, Q. Ligustrazine prevents intervertebral disc degeneration via suppression of aberrant tgfβ activation in nucleus pulposus cells. BioMed Research International. 2019, 5601734(2019).
- Boos, N., et al. Classification of age-related changes in lumbar intervertebral discs: 2002 Volvo Award in basic science. Spine. 27 (23), 2631-2644 (2002).
- Miyamoto, S., Yonenobu, K., Ono, K. Experimental cervical spondylosis in the mouse. Spine. 16, 10 Suppl 495-500 (1991).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
