MS2-Affinity Zuivering in combinatie met RNA Sequencing in Gram-Positieve Bacteriën

Samenvatting

MAPS-technologie is ontwikkeld om het targetoom van een specifiek regulerend RNA in vivo te onderzoeken. De sRNA van belang is gelabeld met een MS2 aptamer die de co-zuivering van zijn RNA-partners en hun identificatie door RNA-sequencing mogelijk maakt. Dit gewijzigde protocol is bijzonder geschikt voor Gram-positieve bacteriën.

Samenvatting

Hoewel kleine regelgevende RNA's (sRNAs) wijdverspreid zijn onder het bacteriële domein van het leven, blijven de functies van veel van hen slecht gekarakteriseerd, met name vanwege de moeilijkheid om hun mRNA-doelen te identificeren. Hier beschreven we een aangepast protocol van de MS2-Affinity Purification in combinatie met RNA Sequencing (MAPS) technologie, met als doel alle RNA-partners van een specifieke sRNA in vivo te onthullen. In grote lijnen is de MS2 aptamer versmolten met het 5' uiteinde van het sRNA van belang. Deze constructie wordt vervolgens in vivo uitgedrukt, waardoor de MS2-sRNA kan communiceren met zijn cellulaire partners. Na het oogsten van bacteriën worden cellen mechanisch gelyseerd. Het ruwe extract wordt geladen in een op amylose gebaseerde chromatografiekolom die eerder was bedekt met het MS2-eiwit dat is gesmolten met het maltosebindende eiwit. Dit maakt het mogelijk om MS2-sRNA specifiek vast te leggen en RNA's te gebruiken. Na elutie worden co-gezuiverde RNA's geïdentificeerd door RNA-sequencing met hoge doorvoer en daaropvolgende bio-informatische analyse. Het volgende protocol is geïmplementeerd in de Gram-positieve menselijke ziekteverwekker Staphylococcus aureus en is in principe transponeerbaar op grampositieve bacteriën. Kortom, MAPS-technologie is een efficiënte methode om het regelgevende netwerk van een bepaalde sRNA diep te verkennen en biedt een momentopname van het hele doeloom. Het is echter belangrijk om in gedachten te houden dat putatieve doelstellingen die door MAPS zijn geïdentificeerd, nog steeds moeten worden gevalideerd door aanvullende experimentele benaderingen.

Inleiding

Honderden, misschien zelfs duizenden kleine regelgevende RNA's (sRNAs) zijn geïdentificeerd in de meeste bacteriële genomen, maar de functies van de overgrote meerderheid van hen blijven niet gekarakteriseerd. Over het algemeen zijn sRNAs korte niet-coderende moleculen, die een belangrijke rol spelen in de bacteriële fysiologie en aanpassing aan fluctuerende omgevingen^1,2,3. Inderdaad, deze macromoleculen staan centraal in tal van ingewikkelde regulerende netwerken, die van invloed zijn op metabolische routes, stressreacties, maar ook virulentie en antibioticaresistentie. Logischerwijs wordt hun synthese geactiveerd door specifieke omgevingsprikkels (bijv. nutriëntenhongering, oxidatieve of membraanspanningen). De meeste sRNAs reguleren meerdere doel-mRNAs op posttranscriptieniveau door middel van korte en niet-aaneengesloten basiskoppeling. Zij verhinderen gewoonlijk de initiatie van vertalingen door te concurreren met ribosomen voor regio 's voor het initiëren van vertalingen⁴. De vorming van sRNA:mRNA duplexen resulteert ook vaak in de actieve afbraak van de doel mRNA door rekrutering van specifieke RNases.

De karakterisering van een sRNA-doeloom (d.w.z. de hele set van zijn doel-RNA's) maakt het mogelijk om de metabolische routes te identificeren waarin het ingrijpt en het potentiële signaal waarop het antwoordt. Bijgevolg kunnen de functies van een specifiek sRNA in het algemeen worden afgeleid uit het doeloom. Hiervoor zijn verschillende in silico voorspellingstools ontwikkeld zoals IntaRNA en CopraRNA^5,6,7. Ze vertrouwen met name op sequentie complementariteit, koppelingsenergie en toegankelijkheid van de potentiële interactiesite om putatieve sRNA-partners te bepalen. Voorspellingsalgoritmen integreren echter niet alle factoren die van invloed zijn op base-pairing in vivo, zoals de betrokkenheid van RNA-chaperonnes⁸ die suboptimale interacties of de co-expressie van beide partners bevorderen. Vanwege hun inherente beperkingen blijft het vals-positieve percentage voorspellingstools hoog. De meeste experimentele grootschalige benaderingen zijn gebaseerd op de co-zuivering van sRNA:mRNA-paren die interageren met een gelabeld RNA-bindend eiwit (RBP)^6,9. De RNA Interaction by Ligation and sequencing (RIL-seq) methode identificeerde bijvoorbeeld RNA duplexen die samen met RNA-chaperonnes zoals Hfq en ProQ werden gezuiverd in Escherichia coli^10,11. Een vergelijkbare technologie genaamd UV-Crosslinking, Ligation And Sequencing of Hybrids (CLASH) werd toegepast op RNase E- en Hfq-geassocieerde sRNAs in E. coli^12,13. Ondanks de goed beschreven rollen van Hfq en ProQ in sRNA-gemedieerde regulatie bij meervoudige bacteriën^8,14,15, lijkt sRNA-gebaseerde regulatie RNA-chaperonne-onafhankelijk te zijn in verschillende organismen zoals S. aureus^16,17,18. Zelfs als de zuivering van RNA-duplexen in combinatie met RNases haalbaar is, zoals aangetoond door Waters en collega's^13,blijft dit lastig omdat RNases hun snelle afbraak veroorzaken. Daarom vormt de MS2-Affinity Purification in combinatie met RNA Sequencing (MAPS) benadering^19,20 een solide alternatief in dergelijke organismen.

In tegenstelling tot bovengenoemde methoden gebruikt MAPS een specifieke sRNA als lokaas om alle interacterende RNA's vast te leggen en vertrouwt daarom niet op de betrokkenheid van een RBP. Het hele proces is weergegeven in figuur 1. Kortom, de sRNA wordt op de 5' getagd met de MS2 RNA aptamer die specifiek wordt herkend door het MS2 coat eiwit. Dit eiwit wordt gefuseerd met het maltosebindende eiwit (MBP) dat geïmmobiliseerd moet worden op een amylosehars. Daarom blijven MS2-sRNA en haar RNA-partners behouden op de kolom affiniteitschromatografie. Na elutie met maltose worden co-gezuiverde RNA's geïdentificeerd met behulp van RNA-sequencing met hoge doorvoer, gevolgd door bio-informatische analyse (figuur 2). De MAPS-technologie tekent uiteindelijk een interacterende kaart van alle mogelijke interacties die in vivo plaatsvinden.

MAPS-technologie werd oorspronkelijk geïmplementeerd in de niet-pathogene gramnegatieve bacterie E. coli²¹. Opmerkelijk genoeg hielp MAPS bij het identificeren van een tRNA-afgeleid fragment dat specifiek interageert met zowel RyhB- als RybB-sRNAs en het voorkomen van sRNA-transcriptieruis om mRNA-doelen te reguleren in niet-inducerende omstandigheden. Daarna is MAPS met succes toegepast op andere E. coli sRNAs zoals DsrA²², RprA²³, CyaR²³ en GcvB²⁴ (Tabel 1). Naast het bevestigen van eerder bekende doelen, breidde MAPS het targetome van deze bekende sRNAs uit. Onlangs is MAPS uitgevoerd in Salmonella Typhimurium en onthulde dat SraL sRNA bindt aan rho mRNA, codering voor een transcriptie beëindiging factor²⁵. Door deze koppeling beschermt SraL rho mRNA tegen de voortijdige transcriptie-beëindiging die door Rho zelf wordt geactiveerd. Interessant is dat deze technologie niet beperkt is tot sRNAs en kan worden toegepast op elk type cellulaire RNA's, zoals blijkt uit het gebruik van een tRNA-afgeleid fragment²⁶ en een 5'-onvertaald gebied van mRNA²² (Tabel 1).

Maps methode is ook aangepast aan de pathogene Gram-positieve bacterie S. aureus¹⁹. In het bijzonder is het lysisprotocol op grote schaal aangepast om cellen efficiënt te breken als gevolg van een dikkere celwand dan gramnegatieve bacteriën en om de RNA-integriteit te behouden. Dit aangepaste protocol ontrafelde reeds het interactoom van RsaA²⁷, RsaI²⁸ en RsaC²⁹. Deze aanpak gaf inzicht in de cruciale rol van deze sRNAs in regulerende mechanismen van celoppervlakeigenschappen, glucoseopname en oxidatieve stressreacties.

Het protocol dat in 2015 in E. coli is ontwikkeld en geïmplementeerd, is onlangs uitvoerig beschreven³⁰. Hier bieden we het aangepaste MAPS-protocol, dat bijzonder geschikt is voor het bestuderen van sRNA-regulerende netwerken in Gram-positieve (dikkere celwand) bacteriën, of ze nu niet-pathogeen of pathogeen zijn (veiligheidsmaatregelen).

Protocol

1. Buffers en media

1. Bereid voor MAPS-experimenten de volgende buffers en media voor:
   - Buffer A (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl₂ en 1 mM DTT)
   - Buffer E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 mM maltose, 0,1% Triton, 1 mM MgCl₂ en 1 mM DTT)
   - RNA-laadbuffer (0,025% xyleencyaan en 0,025% bromoffenolblauw in 8 M ureum)
   - Brain Heart Infusion (BHI) medium (12,5 g kuithersenen, 10 g pepton, 5 g runderhart, 5 g NaCl, 2,5 g Na₂HPO₄ en 2 g glucose voor 1 L)
   - Lysogeny Broth (LB) medium (10 g pepton, 5 g gistextract en 10 g NaCl voor 1 L)
2. Bereid voor noordelijke vlektesten de volgende buffers voor:
   - Blokkerende oplossing (1x maleïnezuur en 1% blokkerend reagens)
   - Hybridisatieoplossing (50% formamide, 5x SSC, 7% SDS, 1% blokkerende oplossing en 0,2% N-lauryl sarcosine, 50 mM natriumfosfaat). Verwarm met agitatie om op te lossen.
   LET OP: Volg zorgvuldig de veiligheidsmaatregelen met betrekking tot elk product.
   - 1 M natriumfosfaat (58 mM natriumfosfaatdibasic en 42 mM natriumfosfaatmonobasisch)
   - Zoutoplossing, natriumcitraatbuffer (SSC), 20x concentraat (3 M NaCl en 300 mM trinatriumcitraat)

2. Veiligheidskwesties

1. Voer alle stappen uit met levensvatbare pathogene bacteriën in een niveau 2-insluitingslaboratorium.
   OPMERKING: Na de lysis mogen alleen celextracten naar buiten worden gebracht (stap 5).
2. Trek een labjas en handschoenen aan.
3. Zorg ervoor dat de polsen bedekt zijn.
4. Reinig de biologische veiligheidskast (klasse II) met een desinfecterende oplossing.
5. Gooi vast afval dat aan bacteriën is blootgesteld in de daarvoor bestemde biomedische bak.
6. Behandel kolven die verontreinigde vloeistoffen bevatten met een desinfecterende oplossing. Gooi het vervolgens weg in een gootsteen.
7. Was de handen en polsen zorgvuldig met zeep en verwijder de labjas voordat u het niveau 2-insluitingslab verlaat.

3. Plasmide bouw

OPMERKING: Voor kloondoeleinden is het van cruciaal belang om eerst de grenzen van het endogene sRNA te identificeren. De pCN51-P3 en pCN51-P3-MS2 plasmiden worden beschreven in Tomasini et al. (2017)²⁷. De P3-promotor maakt een hoge expressie van het sRNA mogelijk op een celdichtheidsafhankelijke manier (d.w.z. wanneer bacteriën de stationaire groeifase ingaan). Veel stafylokokken sRNAs accumuleren tijdens deze groeifase.

1. Versterk de sRNA-sequentie door PCR met behulp van een high-fidelity DNA-polymerase en een PCR-machine. Volg de instructies van de fabrikant zorgvuldig op en lees Garibyan en Avashia (2013)³¹ voor meer informatie.
2. Gebruik de volgende sjablonen om de specifieke primers te ontwerpen:
   
   en 5'-CGCGGATCC(N)-3' voor respectievelijk voorwaartse en omgekeerde primers.
   OPMERKING: Deze oligonucleotiden maken het mogelijk om de MS2-reeks (vetgedrukt) te fuseren tot het 5'-uiteinde van het sRNA van belang. Pst I en BamHI restrictie sites (onderstreept) worden toegevoegd aan de 5' en 3' extremiteiten van de MS2-sRNA constructie om het amplicon te klonen in de pCN51-P3 plasmide²⁷. (N) komt overeen met de genspecifieke sequentie (15-20 nucleotiden).
3. Verteer 1 μg pCN51-P3 plasmide en 1 μg van het MS2-sRNA PCR-product met 2 U PstI en 1 U BamHI in de juiste buffer volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
4. Incubeer 1 uur bij 37 °C en zuiver DNA met behulp van een PCR-zuiveringskit (zie tabel met materialen).
5. Meng de verteerde pCN51-P3 plasmide (300 ng) en MS2-sRNA amplicon (molaire verhouding voor vector:insert = 1:3) in een buis van 1,5 ml. Zie Revie et al. (1988)³² om de ligatie-efficiëntie te maximaliseren. Voeg 1 μL ligasebuffer en 10 U T4-ligase toe aan elke buis. Stel het volume in op 10 μL met ultrapure water.
6. Incubeer bij 22 °C gedurende ten minste 2 uur.
7. Voeg 5 μL ligatiemengsel toe aan 50 μL bevroren DH5α chemisch competente E. coli-cellen. Lees Seidman et al. (2001)³³ voor meer informatie over plasmidetransformatie en chemisch competente cellen.
8. Incubeer 30 minuten op ijs.
9. Hitteschok (45 s bij 42 °C) de transformatiebuis met behulp van een warmteblok of waterbad.
10. Voeg 900 μL LB medium toe en incubeer bij 37 °C gedurende 30 min.
11. Plaat 100 μL van de bacteriële suspensie op een LB-agarplaat aangevuld met ampicilline (100 μg/μL).
    OPMERKING: de pCN51-P3 vector codeert voor een ampicilline resistentie gen, waarmee alleen E. coli klonen met de pCN51-P3-MS2-sRNA plasmide kunnen worden geselecteerd.
12. Extracteer de pCN51-P3-MS2-sRNA plasmide uit een nachtelijke bacteriecultuur (5 ml) gekweekt in aanwezigheid van ampicilline (100 μg/μL) met behulp van een plasmide DNA miniprep kit (zie tabel met materialen).
13. Controleer de constructie door Sanger sequencing³⁴ met behulp van de volgende primer, 5'-TCTCGAAAATAATAGAGGG-3'.
14. Transformeer de pCN51-P3-MS2-sRNA plasmide in DC10B chemisch competente E. coli cellen. Herhaal stap 3.7 tot en met 3.11.
15. Extracteer de pCN51-P3-MS2-sRNA plasmide (zie stap 3.12) en transformeer 1-5 μg plasmide-DNA in HG001 ΔsRNA-elektrocompetente S. aureuscellen met behulp van een elektroporatieapparaat. Volg de instructies van de fabrikant zorgvuldig op. Lees Grosser en Richardson (2016)³⁵ voor meer informatie over methoden voor het voorbereiden van elektrocompetente S. aureus.
    LET OP: Deze stap omvat de behandeling van pathogene bacteriën (zie stap 2).
16. Voeg 900 μL BHI-medium toe en incubeer bij 37 °C gedurende 3 uur.
17. Centrifugeer 1 min bij 16.000 x g. Gooi het supernatant weg.
18. Resuspend de pellet in 100 μL BHI en plaat de bacteriële suspensie op BHI agar platen aangevuld met erytromycine (10 μg/μL).
    OPMERKING: De pCN51-P3 vector codeert ook voor een erytromycine resistentie gen, waarmee alleen S. aureus klonen met de pCN51-P3-MS2-sRNA plasmide kunnen worden geselecteerd.

4. Bacteriën oogsten

LET OP: Deze stap omvat de behandeling van pathogene bacteriën (zie stap 2).

1. Kweek één kolonie stammen met pCN51-P3-MS2-sRNA of pCN51-P3-MS2²⁷ plasmiden in 3 ml BHI-medium aangevuld met erytromycine (10 μg/μL) in duplicaten.
2. Verdun elke nachtcultuur in 50 ml (≈1/100) vers BHI-medium aangevuld met erytromycine (10 μg/μL) om een OD_600nm van 0,05 te bereiken. Gebruik gesteriliseerde kolven van 250 ml (verhouding 5:1 kolf-gemiddelde verhouding).
   OPMERKING: De gemiddelde en groeiomstandigheden moeten worden vastgesteld volgens het expressiepatroon van het onderzochte sRNA.
3. Kweek culturen bij 37 °C met schudden bij 180 tpm gedurende 6 uur.
4. Breng elke cultuur over in een centrifugebuis van 50 ml.
5. Centrifugeer bij 2.900 x g gedurende 15 min bij 4 °C. Gooi het supernatant weg.
6. Houd pellets op ijs en voer direct mechanische cellysis uit (stap 5) of vries en bewaar pellets bij -80 °C.

5. Mechanische cellysis

LET OP: De volgende stappen moeten op ijs worden uitgevoerd en buffers moeten bij 4 °C zijn. Gebruik handschoenen en neem alle voorzorgsmaatregelen om monsters tegen RNases te beschermen.

1. Resuspend pellets (stap 4.6) in 5 ml buffer A.
2. Breng de geresuspendeerde cellen over in centrifugebuizen van 15 ml met 3,5 g silicaparels (0,1 mm).
3. Plaats buizen in een mechanisch cellyse-instrument (zie tabel met materialen). Loop een cyclus van 40 s bij 4,0 m/s.
   OPMERKING: Als één cyclus niet genoeg is om cellen te breken, laat het apparaat dan 5 minuten afkoelen terwijl u monsters op ijs houdt. Herhaal vervolgens een andere cyclus van 40 s bij 4,0 m/s. De efficiëntie van cellysis kan worden getest door het supernatant op BHI-agarplaat te plateren.
4. Centrifugeer op 15.700 x g gedurende 15 min. Herstel het supernatant en houd het op ijs.

6. Kolomvoorbereiding

LET OP: Zorg ervoor dat de amylosehars niet droogt. Sluit de kolom indien nodig af met een eindkap. Bereid alle oplossingen voor voordat u begint met de affiniteitszuivering.

1. Plaats een chromatografiekolom in een kolomrek (zie Materiaaltabel).
2. Verwijder de kolomtip en was de kolom met ultrapure water.
3. Voeg 300 μL amylosehars toe.
4. Was de kolom met 10 ml buffer A.
5. Verdun 1.200 pmol MBP-MS2-eiwit in 6 ml buffer A en laad het in de kolom.
6. Was de kolom met 10 ml buffer A.

7. MS2-affiniteit zuivering (Figuur 1)

1. Laad het cellysaat in de kolom.
   OPMERKING: Houd 1 ml van het cellysaat (ruw extract, CE) om het totale RNA (stap 8) te extraheren en de noordelijke vlek (stap 9) en transcriptomische (stap 10) analyse uit te voeren.
2. Verzamel de doorstroomfractie (FT) in een schone opvangbuis.
3. Was de kolom 3 keer met 10 ml buffer A. Verzamel de wasfractie (W).
4. Eluteer de kolom met 1 ml buffer E en verzamel de elutiefractie (E) in een microbuis van 2 ml.
5. Bewaar alle verzamelde fracties op ijs tot RNA-extractie (stap 8) of vries ze in bij -20 °C voor later gebruik.

8. RNA-extractie van verzamelde fracties (CE, FT, W en E)

1. Gebruik 1 ml van elke fractie (inclusief FT en W) voor RNA-extractie.
2. Voeg 1 volume fenol toe. Meng krachtig.
   LET OP: Fenol is vluchtig en corrosief, let op en werk veilig onder een zuurkast.
3. Centrifugeer bij 16.000 x g gedurende 10 min bij 20 °C.
4. Breng de bovenste fase over in een schone microbuis van 2 ml.
5. Voeg 1 volume chloroform/isoamylalcohol (24:1) toe en herhaal stap 8.3 tot 8.4.
   LET OP: Werk veilig onder een zuurkast.
6. Voeg 2,5 volume koude ethanol 100% en 1/10 volume 3 M natriumacetaat (NaOAc) pH 5,2 toe.
7. 's Nachts neerslaan bij -20 °C.
   OPMERKING: Neerslag kan ook worden uitgevoerd in een ethanol/droogijsbad gedurende 20 minuten of bij -80 °C gedurende 2 uur.
8. Centrifugeer bij 16.000 x g gedurende 15 min bij 4 °C. Verwijder langzaam ethanol met een pipet terwijl u voorzichtig bent om de pellet niet te verstoren.
   LET OP: De RNA pellet is niet altijd zichtbaar en zit soms los in aanwezigheid van ethanol.
9. Voeg 500 μL 80% koude ethanol toe.
10. Centrifugeer bij 16.000 x g gedurende 5 min bij 4 °C.
11. Gooi ethanol weg door het langzaam te pipetten. Droog de pellet met behulp van een vacuümconcentrator, 5 minuten in de run-modus.
12. Resuspend de pellet in een geschikt volume (15-50 μL) ultrapure water. Vries de pellet in bij -20 °C voor later gebruik.
13. Beoordeel de RNA-hoeveelheid (260 nm) en kwaliteit (260/280 en 260/230 golflengteverhoudingen) met behulp van een spectrofotometer/fluorometer (zie tabel met materialen). Volg de instructies van de fabrikant zorgvuldig op.
    OPMERKING: 3-4 μg wordt over het algemeen verkregen in de elutiefractie (E). Dit hangt vooral af van geteste omstandigheden.

9. Analyse van MS2-affiniteitszuivering door Noordelijke^{vlek 36}

1. Verdun 5 μg RNA van CE, FT, W fracties en 500 ng E fractie in 10 μL ultrapure water en meng met 10 μL RNA laadbuffer.
2. Incubeer 3 min bij 90 °C.
3. Laad monsters in putten van een 1% agarose gel aangevuld met 20 mM guanidium thiocyanaat en voer de gel uit op 100-150 V in TBE 1x buffer bij 4 °C. Lees Koontz (2013)³⁷ voor meer informatie.
4. Breng RNA's over op een nitrocellulosemembraan door vacuümoverdracht gedurende 1 uur of capillariteitsoverdracht 's nachts.
   OPMERKING: De capillariteitsmethode is efficiënter voor grote RNA's.
5. UV cross-link RNA's op het membraan (120 mJ bij 254 nm) met behulp van een ultraviolette crosslinker.
6. Steek het membraan in een hybridisatiefles met de RNA-kant naar boven gericht.
7. Voeg 10-20 ml voorverwarmde hybridisatieoplossing toe. Incubeer 30 min bij 68 °C.
8. Gooi de oplossing weg en voeg 10-20 ml verse hybridisatieoplossing toe, aangevuld met 1 μL van de sRNA-specifieke sonde. Incubeer 's nachts bij 68 °C.
   OPMERKING: De RNA-sonde met DIG-label wordt gesynthetiseerd met behulp van een DIG RNA-etiketteringskit en volgens de instructies van de fabrikant. Als alternatief kan een radioactief gelabelde sonde worden gebruikt.
9. Was het membraan met 10-20 ml wasoplossing 1 (2x SSC en 0,1% SDS) gedurende 5 minuten bij 20 °C. Herhaal dit één keer.
10. Was het membraan met 10-20 ml wasoplossing 2 (0,2x SSC en 0,1% SDS) gedurende 15 minuten bij 68 °C. Herhaal dit één keer.
11. Incubeer met 10-20 ml blokkeeroplossing gedurende ten minste 30 minuten bij 20 °C.
12. Gooi de oplossing weg en voeg 10-20 ml van de blokkerende oplossing toe, aangevuld met het polyklonale anti-digoxigenine-antilichaam (1/1000), geconjugeerd aan alkalische fosfatase. Incubeer 30 min bij 20 °C.
13. Was het membraan met 10-20 ml van de wasoplossing 3 (1x maleïnezuur en 0,3% Tween 20) gedurende 15 minuten bij 20 °C. Herhaal dit één keer.
14. Incubeer het membraan met 10-20 ml van de detectieoplossing (0,1 M Tris HCl en 0,1 M NaCl pH 9,5) 5 min bij 20 °C.
15. Leg het membraan op een plastic folie en week het met het substraat (zie Tabel met materialen). Incubeer 5 minuten in het donker.
16. Sluit het membraan af in een plastic folie. Doe het membraan in een autoradiografiecassette.
17. Stel het membraan bloot aan een autoradiografiefilm in de speciale donkere kamer.
    OPMERKING: De expositietijd is afhankelijk van de signaalsterkte, van enkele seconden tot minuten.
18. Onthul de blootgestelde film in een automatisch ontwikkelapparaat.

10. Bereiding van de monsters voor RNA-sequencing

OPMERKING: Deze stap heeft alleen betrekking op RNA's die worden geëxtraheerd uit E- en CE-fracties.

1. Voeg aan elk monster 10 μL 10x DNase buffer en DNase I (1 U/μg behandelde RNA's) toe. Voeg water toe voor een eindvolume van 100 μL.
2. Incubeer 1 uur bij 37 °C.
3. RNA's extraheren en zuiveren zoals eerder beschreven (stappen 8.2 tot en met 8.11).
4. Resuspend de RNA pellet in 20 μL ultrapure water.
   OPMERKING: De aanwezigheid van het resterende DNA kan worden gecontroleerd met behulp van PCR en specifieke primers (bijv. 16S-gen).
5. Beoordeel de hoeveelheid en kwaliteit van RNA met behulp van een elektroforeseanalysesysteem op basis van microfluïdica (zie tabel met materialen).
   OPMERKING: 1 μg wordt over het algemeen verkregen in de elutiefractie (E) na behandeling met DNase.
6. Verwijder ribosomale RNA's met een bacteriële rRNA-uitputtingskit.
   OPMERKING: Grote en overvloedige RNA's (d.w.z. rRNAs) hebben de neiging om niet specifiek te communiceren met de affiniteitskolom. 500 ng geëxtraheerd RNA is vereist om deze stap uit te voeren.
7. Beoordeel opnieuw de hoeveelheid en kwaliteit van RNA met behulp van een op microfluïdica gebaseerd elektroforeseanalysesysteem.
8. Bereid cDNA-bibliotheken voor met 10-20 ng ribodepleted RNA met behulp van een cDNA-bibliotheekvoorbereidingskit en volgens de instructies van de fabrikant.
9. Volg de verkregen bibliotheken met behulp van een sequencing-instrument (bijv. single-end, 150 bp; zie Tabel met materialen).
   OPMERKING: 5-10 miljoen keer lezen per monster is over het algemeen voldoende.

11. RNAseq-gegevensanalyse (Figuur 2)

1. Download de FastQ-sequencingbestanden van het sequencingplatform.
2. Toegang tot het Galaxy-exemplaar van het biologische station Roscoff(https://galaxy.sb-roscoff.fr/)en inloggen.
   OPMERKING: Elk genoemd algoritme is gemakkelijk te vinden via de zoekbalk. Voor elke tool is een gebruikershandleiding beschikbaar.
   LET OP: De versie van de vereiste tools kan afwijken van de openbare Galaxy-server³⁸.
3. Klik op het pictogram Gegevens ophalen en upload vervolgens Bestand vanaf uw computer. Upload FastQ-sequencingbestand van elk MS2-besturingselement en MS2-sRNA-voorbeelden. Upload ook FASTA referentie genoombestand en GFF annotatiebestand.
4. Voer FastQC Read Quality-rapporten uit (Galaxy versie 0.69).
   OPMERKING: Deze tool biedt een kwaliteitsbeoordeling van onbewerkte sequenties (bijv. kwaliteitsscore, aanwezigheid van adaptersequenties).
5. Voer trimmomatische flexibele leessnijgereedschappen uit (Galaxy versie 0.36.6) om met name adaptersequenties en leesprogramma's van slechte kwaliteit te verwijderen. Geef adaptersequenties aan die worden gebruikt voor de voorbereiding van de bibliotheek (bijv. TruSeq 3, single-ended). Voeg de volgende trimmomatische bewerkingen toe: SLIDINGWINDOW (Aantal bases=4; Gemiddelde kwaliteit=20) en MINLEN (Min lengte van reads=20).
6. Voer fastqc read quality rapporten (Galaxy versie 0.69) opnieuw uit.
7. Run Bowtie2 - kaart leest tegen referentiegenoom (Galaxy Versie 2.3.2.2). Gebruik het FASTA-bestand Genome Reference uit de geschiedenis om lees bewerkingen met standaardinstellingen (zeer gevoelig lokaal) toe te kaarten.
   OPMERKING: BAM-bestand gegenereerd door Bowtie2 tool kan worden gevisualiseerd met behulp van de Integrative Genomics Viewer (IGV). Gekoppeld BAI-bestand is ook vereist.
8. Voer eventueel Flagstat uit, waarmee statistieken worden gecompileerd voor bam-gegevensset (Galaxy versie 2.0).
9. Voer htseq-count - Count (Galaxy Versie 0.6.1) uit die leesoverlappende functies in het GFF-annotatiebestand uitlijnt. Gebruik de modus Snijpunt (niet leeg).
10. Archiveer alle raw-tellingsbestanden van htseq-count-analyse in één Zip-bestand.
11. Voer SARTools DESeq2 uit om gegevens te vergelijken (Galaxy Versie 1.6.3.0). Geef het Zip-bestand op met onbewerkte tellingsbestanden en het ontwerpbestand, een door tabbladen gescheiden bestand dat het experiment beschrijft. Volg de meegeleverde instructies om het ontwerpbestand te genereren zorgvuldig op.

Resultaten

De representatieve resultaten zijn afkomstig van het onderzoek naar RsaC-doeloom bij S. aureus²⁹. RsaC is een onconventionele 1.116 nt-lange sRNA. Het 5'-uiteinde bevat verschillende herhaalde regio's, terwijl het 3'-uiteinde (544 nt) structureel onafhankelijk is en alle voorspelde interactiesites bevat met zijn mRNA-doelstellingen. De expressie van dit sRNA wordt geïnduceerd wanneer mangaan (Mn) schaars is, wat vaak wordt aangetroffen in de context van immuunrespons van de gastheer. Met ...

Discussie

Een aangepast protocol voor Gram-positieve bacteriën
Het initiële protocol van MAPS werd ontwikkeld om sRNA interactoom te bestuderen in het modelorganisme E. coli^20,30. Hier beschrijven we een aangepast protocol dat geschikt is voor de karakterisering van sRNA-afhankelijke regulerende netwerken in de opportunistische menselijke pathogene S. aureus en zeker kan worden omgezet naar andere grampositieve bacteriën, pathogeen of ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1.5 mL microcentrifuge tube	Sarstedt	72.690.001
15 mL centrifuge tubes	Falcon	352070
2 mL microcentrifuge tube	Starstedt	72.691
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2939BA	RNA quantity and quality
250 mL culture flask	Dominique Dutscher	2515074	Bacterial cultures
50 mL centrifuge tubes	Falcon	352051	Culture centrifugation
Absolute ethanol	VWR Chemicals	20821.321	RNA extraction and purification
Allegra X-12R Centrifuge	Beckman Coulter		Bacterial pelleting
Ampicilin (amp)	Sigma-Aldrich	A9518-5G	Growth medium
Amylose resin	New England BioLabs	E8021S	MS2-affinity purification
Anti-dioxigenin AP Fab fragment	Sigma Aldrich	11093274910	Northern blot assays
Autoradiography cassette	ThermoFisher Scientific	50-212-726	Northern blot assays
BamHI	ThermoFisher Scientific	ER0051	Plasmid construction
BHI (Brain Heart Infusion) Broth	Sigma-Aldrich	53286	Growth medium
Blocking reagent	Sigma Aldrich	11096176001	Northern blot assays
CDP-Star	Sigma Aldrich	11759051001	Northern blot assays (substrate)
Centrifuge 5415 R	Eppendorf		RNA extraction and purification
Chloroform	Dominique Dutscher	508320-CER	RNA extraction and purification
DIG-RNA labelling mix	Sigma-Aldrich	11277073910	Northern blot assays
DNase I	Roche	4716728001	DNase treatment
Erythromycin (ery)	Sigma-Aldrich	Fluka 45673	Growth medium
FastPrep device	MP Biomedicals	116004500	Mechanical lysis
Guanidium Thiocyanate	Sigma-Aldrich	G9277-250G	Northern blot assays
Hybridization Hoven Hybrigene	Techne	FHB4DD	Northern blot assays
Hybridization tubes	Techne	FHB16	Northern blot assays
Isoamyl alcohol	Fisher Scientific	A/6960/08	RNA extraction and purification
LB (Lysogeny Broth)	Sigma-Aldrich	L3022	Growth medium
Lysing Matrix B Bulk	MP Biomedicals	6540-428	Mechanical lysis
MicroPulser Electroporator	BioRad	1652100	Plasmid construction
Milli-Q water device	Millipore	Z00QSV0WW	Ultrapure water
NanoDrop spectrophotometer	ThermoFisher Scientific		RNA/DNA quantity and quality
Nitrocellulose membrane	Dominique Dutsher	10600002	Northern blot assays
Phembact Neutre	PHEM Technologies	BAC03-5-11205	Cleaning and decontamination
Phenol	Carl Roth	38.2	RNA extraction and purification
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530	Plasmid construction
pMBP-MS2	Addgene	65104	MS2-MBP production
Poly-Prep chromatography column	BioRad	7311550	MS2-affinity purification
PstI	ThermoFisher Scientific	ER0615	Plasmid construction
Qubit 3 Fluorometer	Invitrogen	15387293	RNA quantity
RNAPro Solution	MP Biomedicals	6055050	Mechanical lysis
ScriptSeq Complete Kit	Illumina	BB1224	Preparation of cDNA libraries
Spectrophotometer Genesys 20	ThermoFisher Scientific	11972278	Bacterial cultures
SpeedVac Savant vacuum device	ThermoFisher Scientific	DNA120	RNA extraction and purification
Stratalinker UV Crosslinker 1800	Stratagene	400672	Northern blot assays
T4 DNA ligase	ThermoFisher Scientific	EL0014	Plasmid construction
TBE (Tris-Borate-EDTA)	Euromedex	ET020-C	Northern blot assays
ThermalCycler T100	BioRad	1861096	Plasmid construction
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416-100ML	Northern blot assays
X-ray film processor	hu.q	HQ-350XT	Northern blot assays
X-ray films Super RX-N	FujiFilm	4741019318	Northern blot assays