In dit artikel beschrijven we isolatie van van resusapen afgeleide vetweefsel-afgeleide stamcellen (ADSC's) met behulp van een enzymatisch weefselverteringsprotocol. Vervolgens beschrijven we ADSC-proliferatie, waaronder celonthechting, tellen en plating. Ten slotte wordt ADSC-differentiatie beschreven met behulp van specifieke adipogene inducerende middelen. Daarnaast beschrijven we kleuringstechnieken om differentiatie te bevestigen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie, proliferatie en differentiatie van rhesus makaken vet-afgeleide stamcellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Vetweefsel biedt een rijke en toegankelijke bron van multipotente stamcellen, die zichzelf kunnen vernieuwen. Deze van vetweefsel afgeleide stamcellen (ADSC's) bieden een consistent ex vivo cellulair systeem dat functioneel lijkt op dat van in vivo adipocyten. Het gebruik van ADSC's in biomedisch onderzoek maakt cellulair onderzoek van metabole regulatie en functie van vetweefsel mogelijk. ADSC-differentiatie is noodzakelijk voor adequate adipocytenexpansie en suboptimale differentiatie is een belangrijk mechanisme van vetdisfunctie. Het begrijpen van veranderingen in ADSC-differentiatie is cruciaal voor het begrijpen van de ontwikkeling van metabole disfunctie en ziekte. De protocollen die in dit manuscript worden beschreven, zullen, wanneer ze worden gevolgd, volwassen adipocyten opleveren die kunnen worden gebruikt voor verschillende in vitro functionele tests om de ADSC-metabole functie te beoordelen, inclusief maar niet beperkt tot testen die glucoseopname, lipolyse, lipogenese en secretie meten. Resusapen (Macaca mulatta) zijn fysiologisch, anatomisch en evolutionair vergelijkbaar met mensen en als zodanig zijn hun weefsels en cellen op grote schaal gebruikt in biomedisch onderzoek en voor de ontwikkeling van behandelingen. Hier beschrijven we ADSC-isolatie met behulp van vers subcutaan en omentieel vetweefsel verkregen van 4-9-jarige resusapen. Vetweefselmonsters worden enzymatisch verteerd in collagenase gevolgd door filtratie en centrifugatie om ADSC's te isoleren van de stromale vasculaire fractie. Geïsoleerde ADSC's worden verspreid in stromale media, gevolgd door ongeveer 14-21 dagen differentiatie met behulp van een cocktail van 0,5 μg / ml dexamethason, 0,5 mM isobutylmethylxanthine en 50 μM indomethacine in stromale media. Rijpe adipocyten worden waargenomen na ongeveer 14 dagen differentiatie. In dit manuscript beschrijven we protocollen voor ADSC-isolatie, proliferatie en differentiatie in vitro. Hoewel we ons hebben gericht op ADSC's van resusaap vetweefsel, kunnen deze protocollen worden gebruikt voor vetweefsel verkregen van andere dieren met minimale aanpassingen.
Inleiding
Vetweefsel bestaat uit een heterogeen mengsel van cellen, overwegend volwassen adipocyten en een stromale vasculaire fractie, waaronder fibroblasten, immuuncellen en van vetweefsel afgeleide stamcellen (ADSC's)1,2,3. Primaire ADSC's kunnen rechtstreeks uit wit vetweefsel worden geïsoleerd en gestimuleerd om te differentiëren tot adipocyten, kraakbeen of botcellen4. ADSC's vertonen klassieke stamcelkenmerken zoals het behoud van multipotentie in vitro en zelfvernieuwing; en houden zich aan plastic in cultuur 5,6
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle verkregen weefsels en procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van het Louisiana State University Health Sciences Center en werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het National Institute of Health (NIH-publicatie nr. 85-12, herzien 1996).
1. Bereiding van buffers en oplossingen
- Bereid steriele 5-fosfaat-gebufferde zoutoplossing (5-PBS) oplossing door 5% penicilline / streptomycine (pen / streptop) en 0,25 μg / ml schimmelremmer toe te voegen aan 1x PBS. Bereid steriele 2-PBS wasbuffer (2-PBS) oplossing door toevoeging van 2% pen/streptokokken en 0,25 μg/ml schimmelr....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De ADSC's geïsoleerd uit rhesus makaken vetweefselmonsters werden gezaaid op kweekplaten en is weergegeven in figuur 1. Op de dag van plating zijn cellen niet-hechtend en drijven ze in de kweekschaal zoals weergegeven in figuur 1A. Binnen 72 uur worden ADSC's voor 80% confluent en zijn ze klaar voor adipocytendifferentiatie (figuur 1B). ADSC's vertonen sterke adipogene eigenschappen na chemische inductie. Na 14 dagen differentiatie .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
ADSC-isolatie-, proliferatie- en differentiatieprotocollen zijn eenvoudig en reproduceerbaar, maar ze vereisen een zorgvuldige techniek om adequate isolatie, gezonde expansie en efficiënte differentiatie te garanderen. Een steriele werkomgeving is van cruciaal belang voor alle celkweekexperimenten. Bacteriën of schimmels kunnen in celculturen worden geïntroduceerd via besmette gereedschappen, media of werkomgeving. Schimmelbesmetting wordt aangegeven door sporengroei in de cultuur, terwijl bacteriële besmetting wordt aan.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
De auteurs willen Curtis Vande Stouwe bedanken voor zijn technische assistentie. Het onderliggende onderzoek naar de ontwikkeling van de protocollen werd ondersteund door subsidies van het National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (5P60AA009803-25, 5T32AA007577-20 en 1F31AA028459-01).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0,4 % trypan blauw | Thermo-Fisher | 15250061 | |
| 1,5-ml microcentrifugebuisje | Dot Scientific | 707-FTG | |
| 100 % isopropanol | Sigma-Aldrich | PX1838-P | |
| 100-mm celkweekschaal | Corning | 430167 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 50-ml plastic conische buis | Fisher Scientific | 50-465-232 | |
| 70-µm celzeef | Corning | CLS431751 | |
| a-MEM | Thermo-Fisher | 12561056 | |
| Aluminiumfolie | Reynolds Wrap | ||
| BODIPY | Thermo-Fisher | D3922 | |
| Rundsersalbumine (BSA) | Sigma-Aldrich | 05470 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Collageenase, Type I | Thermo-Fisher | 17100017 | |
| Dexamethason-wateroplosbaar | Sigma-Aldrich | D2915 | |
| Dimethylsulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Gedestilleerd water | Thermo-Fisher | 15230162 | |
| Foetaal runds serum, USDA-goedgekeurd | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fungizone/Amphotericin B (250 ug/mL) | Thermo-Fisher | 15290018 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14175095 | |
| Hemacytometer met dekglas | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Indomethacine | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Omgekeerd lichtmicroscoop | Nikon | DIAPHOT-TMD | |
| L-glutamine (200 mM) | Thermo-Fisher | 25030081 | |
| Laboratorium slinger, 0,5 tot 1,0 Hz | Reliable Scientific | Model 55 Rocking | |
| Neutraal gebufferd formaline (10 %) | Pharmco | 8BUFF-FORM | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicilline-streptomycine (10.000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | |
| Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4 | Thermo-Fisher | 10010023 | |
| Rode bloedcel (RBC) lyse buffer | Qiagen | 158904 | |
| Serologische pipetten, 2 tot 25 mL | Costar Stripettes | ||
| Standaard bevochtigde celkweekincubator, 37 °C, 5 % CO2 | Sanyo | MCO-17AIC | |
| Trypsine-EDTA (0,25%) | Thermo-Fisher | 25200056 |
Referenties
- Fain, J. N. Release of interleukins and other inflammatory cytokines by human adipose tissue is enhanced in obesity and primarily due to the nonfat cells. Vitamins and Hormones. 74, 443-477 (2006).
- Ibrahim, M. M.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
