Isolatie, proliferatie en differentiatie van rhesus makaken vet-afgeleide stamcellen

Samenvatting

In dit artikel beschrijven we isolatie van van resusapen afgeleide vetweefsel-afgeleide stamcellen (ADSC's) met behulp van een enzymatisch weefselverteringsprotocol. Vervolgens beschrijven we ADSC-proliferatie, waaronder celonthechting, tellen en plating. Ten slotte wordt ADSC-differentiatie beschreven met behulp van specifieke adipogene inducerende middelen. Daarnaast beschrijven we kleuringstechnieken om differentiatie te bevestigen.

Samenvatting

Vetweefsel biedt een rijke en toegankelijke bron van multipotente stamcellen, die zichzelf kunnen vernieuwen. Deze van vetweefsel afgeleide stamcellen (ADSC's) bieden een consistent ex vivo cellulair systeem dat functioneel lijkt op dat van in vivo adipocyten. Het gebruik van ADSC's in biomedisch onderzoek maakt cellulair onderzoek van metabole regulatie en functie van vetweefsel mogelijk. ADSC-differentiatie is noodzakelijk voor adequate adipocytenexpansie en suboptimale differentiatie is een belangrijk mechanisme van vetdisfunctie. Het begrijpen van veranderingen in ADSC-differentiatie is cruciaal voor het begrijpen van de ontwikkeling van metabole disfunctie en ziekte. De protocollen die in dit manuscript worden beschreven, zullen, wanneer ze worden gevolgd, volwassen adipocyten opleveren die kunnen worden gebruikt voor verschillende in vitro functionele tests om de ADSC-metabole functie te beoordelen, inclusief maar niet beperkt tot testen die glucoseopname, lipolyse, lipogenese en secretie meten. Resusapen (Macaca mulatta) zijn fysiologisch, anatomisch en evolutionair vergelijkbaar met mensen en als zodanig zijn hun weefsels en cellen op grote schaal gebruikt in biomedisch onderzoek en voor de ontwikkeling van behandelingen. Hier beschrijven we ADSC-isolatie met behulp van vers subcutaan en omentieel vetweefsel verkregen van 4-9-jarige resusapen. Vetweefselmonsters worden enzymatisch verteerd in collagenase gevolgd door filtratie en centrifugatie om ADSC's te isoleren van de stromale vasculaire fractie. Geïsoleerde ADSC's worden verspreid in stromale media, gevolgd door ongeveer 14-21 dagen differentiatie met behulp van een cocktail van 0,5 μg / ml dexamethason, 0,5 mM isobutylmethylxanthine en 50 μM indomethacine in stromale media. Rijpe adipocyten worden waargenomen na ongeveer 14 dagen differentiatie. In dit manuscript beschrijven we protocollen voor ADSC-isolatie, proliferatie en differentiatie in vitro. Hoewel we ons hebben gericht op ADSC's van resusaap vetweefsel, kunnen deze protocollen worden gebruikt voor vetweefsel verkregen van andere dieren met minimale aanpassingen.

Inleiding

Vetweefsel bestaat uit een heterogeen mengsel van cellen, overwegend volwassen adipocyten en een stromale vasculaire fractie, waaronder fibroblasten, immuuncellen en van vetweefsel afgeleide stamcellen (ADSC's)^1,2,3. Primaire ADSC's kunnen rechtstreeks uit wit vetweefsel worden geïsoleerd en gestimuleerd om te differentiëren tot adipocyten, kraakbeen of botcellen⁴. ADSC's vertonen klassieke stamcelkenmerken zoals het behoud van multipotentie in vitro en zelfvernieuwing; en houden zich aan plastic in cultuur ^5,6. ADSC's zijn van groot belang voor het gebruik in de regeneratieve geneeskunde vanwege hun multipotentie en het vermogen om gemakkelijk in grote hoeveelheden te worden geoogst met behulp van niet-invasieve technieken⁷. Adipogene differentiatie van ADSC's produceert cellen die functioneel volwassen adipocyten nabootsen, waaronder lipidenaccumulatie, insuline-gestimuleerde glucose-opname, lipolyse en adipokine-secretie⁸. Hun gelijkenis met volwassen adipocyten heeft geleid tot het wijdverbreide gebruik van ADSC's voor fysiologisch onderzoek van cellulaire kenmerken en metabole functie van adipocyten. Er is steeds meer bewijs dat het idee ondersteunt dat de ontwikkeling van metabole disfunctie en aandoeningen ontstaat op cellulair of weefselniveau 9,10,11,12. Optimale ADSC-differentiatie is vereist voor voldoende uitbreiding van vetweefsel, een goede adipocytenfunctie en effectieve metabole regulatie¹³.

Protocollen die in dit manuscript worden beschreven, zijn eenvoudige technieken die gebruikmaken van standaard laboratoriumapparatuur en basisreagentia. Het manuscript beschrijft eerst het protocol voor de isolatie van primaire ADSC's uit vers vetweefsel met behulp van mechanische en enzymatische spijsvertering. Vervolgens wordt het protocol voor proliferatie en passaging van ADSC's in stromaal medium beschreven. Ten slotte wordt het protocol voor adipogene differentiatie van ADSC's beschreven. Na differentiatie kunnen deze cellen worden gebruikt voor studies om het metabolisme van adipocyten en de mechanismen van disfunctie beter te begrijpen. De protocollen voor bevestiging van adipogene differentiatie en lipidedruppeldetectie met behulp van Oil Red O en borium-dipyrromethen (BODIPY) kleuring worden ook beschreven. De details van deze protocollen waren gericht op primaire ADSC's geïsoleerd uit vers omentaal vetweefsel van resusapen. Wij en anderen hebben dit protocol gebruikt om ADSC's met succes te isoleren van resusapen subcutane en omentale vetweefseldepots^14,15. Voor dezelfde hoeveelheid weefsel die wordt gebruikt, hebben we waargenomen dat onderhuids vetweefsel dichter en taaier is en minder cellen oplevert uit de spijsvertering in vergelijking met omentieel vetweefsel. Dit protocol is ook gebruikt om ADSC's te isoleren van menselijke vetmonsters¹⁶.

Protocol

Alle verkregen weefsels en procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van het Louisiana State University Health Sciences Center en werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het National Institute of Health (NIH-publicatie nr. 85-12, herzien 1996).

1. Bereiding van buffers en oplossingen

1. Bereid steriele 5-fosfaat-gebufferde zoutoplossing (5-PBS) oplossing door 5% penicilline / streptomycine (pen / streptop) en 0,25 μg / ml schimmelremmer toe te voegen aan 1x PBS. Bereid steriele 2-PBS wasbuffer (2-PBS) oplossing door toevoeging van 2% pen/streptokokken en 0,25 μg/ml schimmelremmer in 1x PBS. Wasbuffers kunnen bij 4 °C worden bewaard voor toekomstig gebruik en moeten binnen 4 weken worden gebruikt.
   OPMERKING: 5-PBS-buffer wordt gebruikt voor het verzamelen van vetweefsel en het initiële wassen om mogelijke besmetting te minimaliseren, omdat weefselmonsters die bij obductie zijn verkregen, worden verzameld in een niet-steriele omgeving.
2. Bereid steriele collagenasebuffer (CB) door 0,075% collagenase type I (125 eenheden/mg activiteit), 2% pen/streptokokken en 0,25 μg/ml schimmelremmer in Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) te combineren met 1% runderserumalbumine. CB moet binnen 1 uur worden gebruikt.
3. Bereid steriel ADSC-groeimedium voor met behulp van α-MEM-buffer. Combineer 100 ml foetaal runderserum (FBS), 5 ml 200 mM L-glutamineoplossing, 500 μl 0,25 μg/ml schimmelremmer en 10 ml pen/streptokokkenoplossing in 394 ml α-MEM-buffer. ADSC groeimedium kan worden bewaard bij 4 °C en moet binnen 4 weken worden gebruikt.
   OPMERKING: Warmte-inactivering van FBS is niet nodig.
4. Bereid steriel ADSC-differentiatiemedium door ADSC-groeimedium zoals hierboven bereid en inductiemiddelen te combineren om een eindconcentratie van 0,5 μg/ml dexamethason, 0,5 mM isobutylmethylxanthine en 50 μM indomethacine te bereiken.

2. ADSC isolatie

1. Weefselvoorbereiding en spijsvertering
   1. Pipet ~ 10 ml 5-PBS-buffer in vier celkweekschalen van 100 mm.
   2. Breng ~50 g vetmonster over naar een van de 100 mm schotels met 5-PBS. Was het verzamelde vetweefselmonster vier keer door het achtereenvolgens over de vier kweekschalen met 5-PBS over te brengen.
   3. Breng vetweefsel over naar een schone kweekschaal van 100 mm en gehakt vetweefsel grondig met een schaar of twee steriele scalpels. Gehakt maakt het mogelijk om het oppervlak te vergroten voor een efficiënte en volledige enzymatische spijsvertering.
   4. Breng het gehakte vetweefsel over naar 50 ml plastic conische buis met 13 ml CB (1-3 cm doorsnede weefsel per 15 ml CB).
   5. Spoel de kweekschaal af met 2 ml CB en breng het medium over op de 50 ml plastic conische buis.
      OPMERKING: Op dit punt moet er in totaal 15 ml CB zijn met weefsel in een plastic conische buis van 50 ml.
   6. Pipet meerdere keren op en neer met behulp van 25 ml serologische pipet om de vertering van mechanisch weefsel te vergemakkelijken.
   7. Incubeer de 50 ml plastic conische buis met weefsel in CB op een rocker met gemiddelde snelheid bij 37 °C gedurende 30-60 minuten.
2. ADSC-beplating voor cultuur
   1. Voeg 10 ml ADSC-groeimedium toe aan de buis van 50 ml die weefsel bevat om de enzymactiviteit te neutraliseren. Pipetteer meerdere keren op en neer met behulp van 25 ml serologische pipet om eventuele vetweefselaggregaten te scheiden.
   2. Breng het vloeibare gedeelte over in een nieuwe steriele conische buis van 50 ml en laat de vaste stoffen achter. Was de originele buis van 50 ml 3 keer met ~ 7 ml 2-PBS-buffer en breng het vloeibare gedeelte over naar de buis van 50 ml.
   3. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 minuten om een celpellet te verkrijgen. Verwijder voorzichtig zoveel mogelijk supernatant met behulp van een serologische pipet zonder de celkorrel te verstoren. Niet decanteren.
   4. Resuspendeer de celpellet in 1 ml 1x rode bloedcel (RBC) lysisbuffer en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Voeg 5 ml ADSC-groeimedium toe aan de buis en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 x g en verwijder het supernatant voorzichtig en gooi het weg.
   5. Voeg 5 ml ADSC-groeimedium toe en centrifugeer gedurende 5 minuten op 500 x g om celpellets te wassen. Gooi het supernatant weg.
   6. Resuspendeer de pellet in 2 ml ADSC-groeimedium en filter door een celzeef van 70 μm in een nieuwe steriele 50 ml plastic conische buis.
   7. Spoel de celzeef af met nog eens 2 ml ADSC groeimedium. Breng 4 ml van de suspensie met ADSC's over van de conische buis van 50 ml naar een steriele kweekschaal van 100 mm.
   8. Was de conische buis van 50 ml 2 keer met 3 ml ADSC-groeimedium en breng de vloeistof over in de 100 mm kweekschaal met ADSC's voor een totaal van 10 ml medium in kweekschaal.
   9. Bekijk cellen onder een omgekeerde microscoop met een vergroting van 10x om te controleren op zwevende cellen in de media zoals weergegeven in figuur 1A. Cellen moeten in een CO_2-incubator worden gehouden bij 37 °C bij 5% CO₂ en 100% relatieve vochtigheid.
   10. Bekijk na 24 uur cellen onder een omgekeerde microscoop om te controleren op celtrouw. Aspirateer ADSC groeimedium uit de plaat en vervang door 10 ml verse, warme (37 °C) media. Verwijder en vervang media om de 48 uur totdat de cellen 80% -90% confluent zijn (figuur 1B).
       OPMERKING: Ten minste 10-20% van de cellen zal na 24 uur hechten. Controleer de celcultuur op tekenen van besmetting zoals celkorreligheid, troebelheid van de media of groei van sporen. Zodra cellen voor 80% samenvloeien, kunnen ze worden geoogst voor proliferatie en cryopreservatie of worden geïnduceerd om te differentiëren. ADSC's kunnen worden uitgebreid tot 4-6 passages voordat ze hun vermogen verliezen om zich efficiënt te verspreiden of te differentiëren.

3. ADSC-proliferatie

1. Celonthechting
   1. Verwijder ADSC groeimedium met behulp van een aspirator/pipet. Spoel confluente ADSC's 2 keer met 2 ml steriele PBS op kamertemperatuur.
   2. Aspirateer PBS en voeg 2 ml 0,25 % trypsine-EDTA per kweekplaat van 100 mm toe. Zorg ervoor dat het volledige oppervlak bedekt is met trypsine.
   3. Incubeer de plaat gedurende ~ 7 minuten bij 37 ° C in 5% CO₂ totdat ADSC's zijn losgemaakt. Verwijder de plaat uit de couveuse en maak cellen mechanisch los door de trypsine-oplossing krachtig in de plaat te pipetteren.
   4. Voeg 2 ml ADSC-groeimedium toe aan de losgeraakte cellen en pipetteer voorzichtig om te mengen. Breng cellen over naar steriele 50 ml plastic conische buis. Om maximaal celherstel te garanderen, spoelt u de kweekschaal met nog eens 2 ml ADSC-groeimedium en brengt u het medium over naar de conische buis met losse cellen.
   5. Centrifugeer de conische buis van 50 ml bij 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om een celpellet te verkrijgen. Decanteer supernatant voorzichtig zonder de celpellet te verstoren.
   6. Resuspend cel pellet in 5-6 ml ADSC groeimedium per 1 x 10⁶ cellen.
2. Celtelling en beplating
   1. Verdun in een microcentrifugebuis van 1,5 ml 10 μL celoplossing van bovenaf en 10 μL 0,04% trypanblauwe oplossing (0,4% trypanblauw verdund 1:10 in PBS) en tel cellen met behulp van een hemocytometer.
   2. Resuspendeer het gewenste aantal ADSC's in groeimedium. Voor 100 mm kweekschaal, plaat ~ 3,0 x 10⁵ cellen in 10 ml ADSC-groeimedia om 80% samenvloeiing in 72 uur of 100% samenvloeiing in 96 uur mogelijk te maken.
   3. Bekijk het gerecht onder een omgekeerde microscoop bij 10x vergroting voorafgaand aan incubatie om de aanwezigheid van gesuspendeerde cellen te garanderen. Houd de cellen op 37 °C bij 5% CO₂ en 100% relatieve vochtigheid.
   4. Adem om de 48 uur het groeimedium op en vervang het door warm (37 °C) medium totdat de cellen voor 80% tot 90% samenvloeien, zoals weergegeven in figuur 1B.
   5. Herhaal de stappen uit de punten 3.1 en 3.2 voor het juiste aantal passages om het gewenste celnummer te verkrijgen.
      OPMERKING: Na passages 5 tot 6 lijken primaire cellen senescentie te ondergaan; streef daarom naar het verkrijgen van gewenste celnummers door passage 4.

4. ADSC adipogene differentiatie

1. AspirateER ADSC-groeimedium van aanhangende ADSC's die 80% tot 90% samenvloeiing hebben bereikt.
2. Spoel de ADSC-cellaag snel af met steriele PBS op kamertemperatuur.
3. Voeg ADSC-differentiatiemedium toe. Voeg voor een kweekschaal van 100 mm 10 ml ADSC-differentiatiemedium toe.
4. Vervang medium om de 3 dagen gedurende ongeveer 14-21 dagen. Rijpe adipocyten worden over het algemeen waargenomen na 14 dagen differentiatie.
5. Onderzoek cellen onder een omgekeerde lichtmicroscoop met een vergroting van 40x om de aanwezigheid van lipidedruppels te bevestigen, zoals weergegeven in figuur 2A.

5. Adipocyten detectie

OPMERKING: In dit gedeelte worden kleuringsprotocollen beschreven die worden gebruikt voor lipidedruppeldetectie in gedifferentieerde adipocyten, maar immunofluorescente kleuring voor CD105, een mesenchymale stamcelmarker, kan ook worden gebruikt voor ADSC-bevestiging.

1. Olie Rode O kleuring
   1. Bereid 0,5% Oil Red O stockoplossing in isopropanol. Los voor 20 ml Olie Rode O-stamoplossing 100 mg Olierood O op in 20 ml isopropanol. Filtreer de oplossing door een steriel spuitfilter met een membraan van 0,2 μm.
   2. Aspirateer het differentiatiemedium zorgvuldig en was cellen 2 keer door PBS langs de zijkanten van de put toe te voegen om de celmonolaag niet te verstoren.
   3. Aspirateer PBS zorgvuldig uit cellen en voeg voldoende neutraal gebufferd formaline (NBF, 10%) toe om de cellaag te bedekken. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30-60 min.
   4. Bereid tijdens de formalinefixatiestap de Oil Red O-werkoplossing door 3 delen oil red O-voorraadoplossing te verdunnen met 2 delen gedestilleerd water. Meng de oplossing en filter door een steriel spuitfilter met een membraan van 0,2 μm. Werkoplossing is stabiel tot 2 uur.
   5. Zuig NBF voorzichtig aan en was de cellaag snel (~ 15 s) met gedestilleerd water. Voeg voldoende 60% isopropanol toe om de cellaag te bedekken na het aanzuigen van water en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
   6. Aspirateer isopropanol voorzichtig na 5 minuten incubatie en voeg voldoende Olie Rode O-werkoplossing toe om de cellaag te bedekken en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10-15 minuten.
   7. Zuig de Oil Red O-werkoplossing voorzichtig af en was de cellaag meerdere keren met gedestilleerd water totdat het water helder wordt.
   8. Voeg PBS toe aan de celkweekschaal en onderzoek cellen onder een omgekeerde microscoop op indicatie van differentiatie en aanwezigheid van lipidedruppels (figuur 2B).
2. BODIPY Kleuring
   1. Bereid 5 mM BODIPY-voorraadoplossing door 1,3 g BODIPY op te lossen in 1 ml DMSO. Bereid 2 μg/ml BODIPY-werkoplossing door de voorraadoplossing 1:25.000 keer in PBS te verdunnen.
   2. Aspirateer het differentiatiemedium zorgvuldig en was cellen 2 keer door PBS langs de zijkanten van de put toe te voegen om de celmonolaag niet te verstoren.
   3. Zuig PBS voorzichtig aan en voeg voldoende BODIPY-werkoplossing toe om de cellaag te bedekken en incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten.
      OPMERKING: Bescherm vanaf dit punt cellen tegen licht door de plaat te bedekken met folie.
   4. Zuig de BODIPY-werkoplossing zorgvuldig aan en was de cellaag 3 keer met PBS.
   5. Fixeer cellen door 4% paraformaldehyde toe te voegen en gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur te broeden.
   6. Zuig de fixatiebuffer voorzichtig op en was cellen 2 keer door PBS langs de zijkanten van de put toe te voegen om de celmonolaag niet te verstoren.
   7. Voeg PBS toe aan de celkweekschaal en onderzoek cellen onder een omgekeerde fluorescerende microscoop op bewijs van differentiatie en aanwezigheid van lipidedruppel (figuur 2C). Afbeeldingscellen met een FITC/EGFP/Bodipy Fl/Fluo3/DiO Chroma-filterset. Excitatiegolflengte is bij 480 nm met een bandbreedte van 40 nm en emissiegolflengte is bij 535 nm met een bandbreedte van 50 nm. Een vergelijkbare of geschikte filterset en microscoop kunnen worden gebruikt.

Resultaten

De ADSC's geïsoleerd uit rhesus makaken vetweefselmonsters werden gezaaid op kweekplaten en is weergegeven in figuur 1. Op de dag van plating zijn cellen niet-hechtend en drijven ze in de kweekschaal zoals weergegeven in figuur 1A. Binnen 72 uur worden ADSC's voor 80% confluent en zijn ze klaar voor adipocytendifferentiatie (figuur 1B). ADSC's vertonen sterke adipogene eigenschappen na chemische inductie. Na 14 dagen differentiatie ...

Discussie

ADSC-isolatie-, proliferatie- en differentiatieprotocollen zijn eenvoudig en reproduceerbaar, maar ze vereisen een zorgvuldige techniek om adequate isolatie, gezonde expansie en efficiënte differentiatie te garanderen. Een steriele werkomgeving is van cruciaal belang voor alle celkweekexperimenten. Bacteriën of schimmels kunnen in celculturen worden geïntroduceerd via besmette gereedschappen, media of werkomgeving. Schimmelbesmetting wordt aangegeven door sporengroei in de cultuur, terwijl bacteriële besmetting wordt aan...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0,4 % trypan blauw	Thermo-Fisher	15250061
1,5-ml microcentrifugebuisje	Dot Scientific	707-FTG
100 % isopropanol	Sigma-Aldrich	PX1838-P
100-mm celkweekschaal	Corning	430167
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I7018
50-ml plastic conische buis	Fisher Scientific	50-465-232
70-µm celzeef	Corning	CLS431751
a-MEM	Thermo-Fisher	12561056
Aluminiumfolie	Reynolds Wrap
BODIPY	Thermo-Fisher	D3922
Rundsersalbumine (BSA)	Sigma-Aldrich	05470
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Collageenase, Type I	Thermo-Fisher	17100017
Dexamethason-wateroplosbaar	Sigma-Aldrich	D2915
Dimethylsulfoxide, DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
Gedestilleerd water	Thermo-Fisher	15230162
Foetaal runds serum, USDA-goedgekeurd	Sigma-Aldrich	F0926
Fungizone/Amphotericin B (250 ug/mL)	Thermo-Fisher	15290018
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Thermo-Fisher	14175095
Hemacytometer met dekglas	Sigma-Aldrich	Z359629
Indomethacine	Sigma-Aldrich	I7378
Omgekeerd lichtmicroscoop	Nikon	DIAPHOT-TMD
L-glutamine (200 mM)	Thermo-Fisher	25030081
Laboratorium slinger, 0,5 tot 1,0 Hz	Reliable Scientific	Model 55 Rocking
Neutraal gebufferd formaline (10 %)	Pharmco	8BUFF-FORM
Oil Red O	Sigma-Aldrich	O0625
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Penicilline-streptomycine (10.000 U/mL)	Thermo-Fisher	15140122
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4	Thermo-Fisher	10010023
Rode bloedcel (RBC) lyse buffer	Qiagen	158904
Serologische pipetten, 2 tot 25 mL	Costar Stripettes
Standaard bevochtigde celkweekincubator, 37 °C, 5 % CO2	Sanyo	MCO-17AIC
Trypsine-EDTA (0,25%)	Thermo-Fisher	25200056