Methodenartikel

Identificatie, isolatie en karakterisering van fibro-adipogene voorlopercellen (FAPs) en myogene voorlopercellen (MP's) in skeletspieren bij de rat

DOI:

10.3791/61750

⸱

9 juni 2021

 ,  ,  , 
1Keenan Research Center for Biomedical Science, St Michaels Hospital, Unity Health Toronto, 2Department of Medicine and Interdepartmental Division of Critical Care Medicine, University of Toronto

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol schetst een methode om Fibro-adipogene voorlopercellen (FAPs) en myogene voorlopers (MP's) te isoleren uit de skeletspieren van ratten. Het gebruik van de rat in spierletselmodellen zorgt voor een verhoogde beschikbaarheid van weefsel van atrofische spieren voor de analyse en een groter repertoire van gevalideerde methoden om spierkracht en gang bij vrij bewegende dieren te beoordelen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fibro-adipogene voorlopers (FAP's) zijn residente interstitiële cellen in skeletspieren die, samen met myogene voorlopers (MP's), een sleutelrol spelen bij spierhomeostase, letsel en herstel. De huidige protocollen voor FAPs-identificatie en -isolatie maken gebruik van flowcytometrie / fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en studies die hun functie in vivo tot nu toe evalueren, zijn uitsluitend bij muizen uitgevoerd. De grotere inherente grootte van de rat maakt een uitgebreidere analyse van FAPs in skeletspierletselmodellen mogelijk, vooral in ernstig atrofische spieren of wanneer onderzoekers aanzienlijke weefselmassa nodig hebben om meerdere downstream-assays uit te voeren. De rat biedt bovendien een grotere selectie van spier functionele assays die geen dierlijke sedatie of opoffering vereisen, waardoor morbiditeit en diergebruik worden geminimaliseerd door seriële beoordelingen mogelijk te maken. De flowcytometrie/FACS-protocollen die voor muizen zijn geoptimaliseerd, zijn soortspecifiek, met name beperkt door de kenmerken van commercieel beschikbare antilichamen. Ze zijn niet geoptimaliseerd voor het scheiden van FAPs van ratten of zeer fibrotische spieren. Een flowcytometrie/FACS-protocol voor de identificatie en isolatie van FAPs en MP's van zowel gezonde als gedenerveerde rattenskeletspieren werd ontwikkeld, afhankelijk van de differentiële expressie van oppervlaktemarkers CD31, CD45, Sca-1 en VCAM-1. Omdat ratspecifieke, flowcytometrie-gevalideerde primaire antilichamen ernstig beperkt zijn, werd interne conjugatie van het antilichaam gericht op Sca-1 uitgevoerd. Met behulp van dit protocol werd succesvolle Sca-1-conjugatie bevestigd en flowcytometrische identificatie van FAPs en MP's werd gevalideerd door celkweek en immunostaining van FACS-geïsoleerde FAPs en MP's. Ten slotte rapporteren we een nieuw FAPs-tijdsverloop in een langdurig (14 weken) rattendenervatiemodel. Deze methode biedt de onderzoekers de mogelijkheid om FAPs te bestuderen in een nieuw diermodel.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fibro-adipogene voorlopercellen (FAP's) zijn een populatie van residente multipotente voorlopercellen in skeletspieren die een cruciale rol spelen bij spierhomeostase, reparatie en regeneratie, en omgekeerd ook pathologische reacties op spierletsel bemiddelen. Zoals de naam al doet vermoeden, werden FAP's oorspronkelijk geïdentificeerd als een voorloperpopulatie met het potentieel om te differentiëren in fibroblasten en adipocyten1 en werden ze verondersteld de belangrijkste mediatoren te zijn van fibro-vette infiltratie van skeletspieren bij chronisch letsel en ziekte. Verder onderzoek toonde aan dat FAPs bovendien in staat zijn tot osteogenese en chondrogenese2,3,4. Zo worden ze in de literatuur breder genoteerd als mesenchymale of stromale voorlopers3,5,6,7,8. Bij acuut skeletspierletsel helpen FAPs indirect bij regeneratieve myogenese door zich tijdelijk te vermenigvuldigen om een gunstige omgeving te bieden voor geactiveerde spiersatellietcellen en hun downstream myogene voorloper (MP's) tegenhangers1,9,10. Parallel aan succesvolle regeneratie ondergaan FAPs apoptose, waarbij hun aantal terugkeert naar basislijnniveaus1,9,10,11. Bij chronisch spierletsel daarentegen overschrijven FAP's pro-apoptotische signalen, wat resulteert in hun persistentie9,10,11 en abnormaal spierherstel.

In vivo studies die de cellulaire en moleculaire mechanismen evalueren waarmee FAPs spierresponsen bemiddelen, hebben tot op heden gebruik gemaakt van muizendiermodellen1,7,9,10,11,12,13,14. Hoewel genetisch gemanipuleerde muizen krachtige hulpmiddelen zijn voor gebruik in deze analyses, beperkt de kleine omvang van het dier de beschikbaarheid van weefsel voor onderzoek in langdurige gelokaliseerde letselmodellen waar spieratrofie diepgaand kan zijn, zoals traumatische denervatie. Bovendien vereist het meten van spierkracht en fysieke functie ex vivo of in situ metingen die beëindiging van de muis vereisen, of in vivo methoden die een operatie en/of een algemene verdoving vereisen om evaluatie van spiercontractiele prestaties mogelijk te maken15,16,17,18,19,20 . Bij ratten bestaan er goed gevalideerde en wereldwijd gebruikte spierfunctieanalyses, naast analyses voor complexer motorisch gedrag zoals loopanalyse (bijv. Ischiasfunctie-index, CatWalk-analyse) en worden uitgevoerd bij wakkere en spontaan bewegende dieren21,22,23,24 . Dit optimaliseert bovendien de principes van minimale morbiditeit in dierproeven en het aantal gebruikte onderzoeksdieren. De rat biedt de FAPs-onderzoeker daardoor de extra flexibiliteit van een groter gewond spiervolume voor eiwit- en cellulaire analyses en de mogelijkheid om seriële beoordelingen uit te voeren van spiercomplex statische en dynamische functionele activiteit en gedrag, in het alerte dier.

FAPs zijn voornamelijk geïdentificeerd en geïsoleerd uit hele spiermonsters met behulp van respectievelijk flowcytometrie en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Dit zijn op laser gebaseerde testen die in staat zijn om meerdere specifieke celpopulaties te identificeren op basis van karakteristieke kenmerken zoals grootte, granulariteit en een specifieke combinatie van celoppervlak of intracellulaire markers25. Dit is zeer voordelig bij de studie van een orgaansysteem zoals skeletspieren, omdat homeostase en regeneratie complexe, multifactoriële processen zijn die worden gecoördineerd door een overvloed aan celtypen. Een baanbrekende studie identificeerde FAPs, evenals MP's, met behulp van flowcytometrische methoden in de skeletspieren van muizen1. Ze toonden aan dat FAPs mesenchymaal van aard zijn, omdat ze geen oppervlakte-antigenen hadden die specifiek zijn voor cellen van endotheel (CD31), hematopoietische (CD45) of myogene (Integrin-α7 [ITGA7]) oorsprong, maar de mesenchymale stamcelmarker Sca-1 (stamcelantigeen 1) 1 tot expressie brachten en in cultuur werdengedifferentieerd tot fibrogene en adipogene cellen. Andere studies toonden succesvolle isolatie van mesenchymale voorlopercellen in spieren aan op basis van de expressie van een alternatieve stamcelmarker, van bloedplaatjes afgeleide groeifactorreceptor alfa (PDGFRα)2,7,8 en verdere analyse onthulde dat deze waarschijnlijk dezelfde celpopulatie zijn als FAPs3. FAPs worden nu vaak geïdentificeerd in flowcytometrie met behulp van Sca-1 of PDGFRα als een positieve selectiemarker1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31 . Het gebruik van PDGFRα heeft echter de voorkeur voor menselijk weefsel, omdat een directe menselijke homoloog van murine Sca-1 nog moet worden geïdentificeerd32. Bovendien zijn andere celoppervlakeiwitten gerapporteerd als markers van PARLEMENTSLEDEN (bijv. VCAM-1), wat een potentieel alternatief biedt voor ITGA7 als een indicator van cellen van myogene afstamming tijdens FAPs-isolatie33.

Hoewel flowcytometrie / FACS een krachtige methodologie is voor het bestuderen van de rol en het pathogene potentieel van FAPs in skeletspieren1,9,10,11,13,29,wordt het technisch beperkt door de specificiteit en optimalisatie van de vereiste reagentia. Aangezien flowcytometrische identificatie en isolatie van FAPs is ontwikkeld en uitgevoerd in muisdiermodellen1,9,10,11,29,vormt dit uitdagingen voor onderzoekers die FAPs in andere modelorganismen willen bestuderen. Veel factoren - zoals optimale weefselgrootte die moet worden verwerkt, evenals reagens- en / of antilichaamspecificiteit en beschikbaarheid - verschillen afhankelijk van de gebruikte soort.

Naast de technische barrières voor het bestuderen van FAPs in een nieuw diermodel, zijn ze grotendeels bestudeerd in een acute, toxische omgeving - meestal via intramusculaire chemische injectie of cardiotoxine. Evaluatie van de langetermijndynamiek van FAPs is voornamelijk beperkt tot beoordeling in Duchenne's spierdystrofie, met behulp van het mdx-muismodel9,10,11en modellen van gecombineerd spierletsel zoals massieve rotator cuff-scheur waarbij gelijktijdige peestranssectie en denervatie wordt uitgevoerd op schoudermusculatuur26,27,28 . De reactie van FAPs op de enige belediging van chronische traumatische denervatie, een veel voorkomend verschijnsel bij ongevallen op de werkplek in de zware industrie, landbouw en bij geboortetrauma's (brachiale plexusletsel)34,35,36,37 met aanzienlijke morbiditeit, is niet zo goed gekarakteriseerd, vaak beperkt tot een kortetermijntijdframe11,38.

We beschrijven een methode voor het identificeren en isoleren van FAPs en PARLEMENTSLEDEN van gezonde, maar ook ernstig atrofische en fibrotische skeletspieren bij de rat. Ten eerste wordt identificatie van CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- FAPs en CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ MP's met behulp van een weefselverterings- en flowcytometriekleuringsprotocol aangetoond en wordt de daaropvolgende validatie van onze bevindingen uitgevoerd door middel van kweek en immunocytochemische kleuring van FACS-geïsoleerde cellen. Met behulp van deze methode rapporteren we ook een nieuw FAPs-tijdsverloop in een langdurig geïsoleerd denervatieletselmodel bij de rat.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onderzoekers die dit protocol uitvoeren, moeten toestemming krijgen van hun lokale commissie voor dierenethiek / zorgcommissie. Al het dierwerk werd goedgekeurd door het St. Michael's Hospital Unity Health Toronto Animal Care Committee (ACC # 918) en werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care (CCAC). Een schema van het flowcytometrieprotocol is weergegeven in figuur 1. Als de downstream-toepassing FACS en de daaropvolgende celkweek is, moeten alle stappen worden voltooid met de juiste aseptische techniek.

1. Spierballen oogsten

  1. Verdoving ratten met behulp van een geschikt verdovingsmiddel en offer volgens de lokale richtlijnen van de vivarium- en dierenethiekcommissie. Dit protocol oogst de gastrocnemiusspier van volwassen vrouwelijke Lewis-ratten (200-250 g), als voorbeeld. Ratten werden verdoofd met 2-3% isofluraan en werden geofferd door intracardiale injectie van T61.
  2. Zodra het dier is geofferd, scheert u de hele achterpoot om de locatie van de spier te vergemakkelijken en de vachtbesmetting van het geoogste weefsel te minimaliseren.
  3. Maak met behulp van een steriel scalpel twee incisies in de huid: de eerste rond de omtrek van het enkelgewricht en de tweede de middellijn van het mediale aspect van de achterpoot van de enkel naar de heup.
  4. Pel de huid en oppervlakkige spierlagen af om de onderliggende gastrocnemius te onthullen, die ontstaat bij de mediale en laterale condylen van het dijbeen en inserts bij de achillespees.
  5. Gebruik stompe dissectie om de gastrocnemius van het omliggende weefsel te scheiden en behandel de spier alleen bij de pees om verbrijzelingsletsel te voorkomen.
  6. Scheid de gastrocnemius van het inbrengen door de achillespees zo distaal mogelijk met een scherpe schaar door te snijden. Eenmaal gesneden, pak je de achillespees vast met een tang en pel je de gastrocnemius voorzichtig van het onderliggende bot. Nog steeds met de spier met een tang in één hand, lokaliseer de twee oorsprongen van de gastrocnemius en snijd bij de mediale en laterale femorale condylen.
  7. Dep de weggesneden gastrocnemius voorzichtig tegen een steriel stuk gaas om zoveel mogelijk bloed te verwijderen. Trim de spier op een steriel oppervlak en verwijder overtollig bindweefsel en de achillespees.
  8. Plaats spieren in een weegboot en weeg met behulp van een precisieweegschaal. Dit protocol is geoptimaliseerd om spieren te verteren met een nat gewicht variërend van 200-600 mg. Exploitanten kunnen overtollig geoogst weefsel desgewenst onderverdelen voor andere stroomafwaartse assays.
  9. Verdeel de geoogste spier voor flowcytometrie voorzichtig verder in 3-4 kleinere stukjes (ongeveer 1-2 cm3)en dompel onder in ijskoude 1x PBS. Koud houden op ijs totdat alle monsters zijn geoogst.

2. Spiervertering

  1. Verwijder de spieren van PBS en plaats in een steriele celkweekschaal van 10 cm. Scheur en gehakt weefsel voorzichtig met een tang tot stukjes ongeveer 3-4 mm3zijn, waarbij zoveel mogelijk bindweefsel wordt verwijderd. Eenmaal grondig gehakt, overgebracht naar een steriele conische buis van 50 ml met 6 ml DMEM + 1% penicilline / streptomycine (P / S).
  2. Voeg 10 μL van 300 mM CaCl2-oplossing toe aan 365 μL Collagenase II-oplossing (voorraadconcentratie 4800 U/ml) om het collagenase-enzym te activeren. Voeg de geactiveerde collagenase II-oplossing toe aan de conische buis van 50 ml die de weefselslib bevat. De uiteindelijke Collagenase II concentratie is 250 U/ml.
  3. Incubeer buizen in een shaker gedurende 1 uur bij 37 °C, 240 x g, zorg ervoor dat u elke 15 minuten handmatig wervelt om weefsel los te maken dat zich aan de zijkant van de buis heeft gehecht.
  4. Verwijder na 1 uur de buisjes uit de shaker en voeg het volgende per monster toe: 100 μL Collagenase II (4.800 E/ml) en 50 μL Dispase (4,8 E/ml).
  5. Pipetteer monsters met een serologische pipet 15-20 keer totdat de oplossing homogeen is. Als u meerdere monsters verwerkt, gebruik dan een afzonderlijke steriele pipet voor elk monster om kruisbesmetting van het monster te voorkomen.
  6. Incubeer opnieuw in een shaker gedurende 30 min bij 37 °C en 240 x g. Schud na 15 minuten monsters met de hand om het aanhangende weefsel van de zijkant van de buis los te maken.

3. Generatie van eencellige suspensie

  1. Schuif monsters langzaam door een spuit van 10 ml met een naald van 20 G gedurende 10 cycli.
    OPMERKING: Eén cyclus omvat het opnemen van spieroplossing in de spuit en het terug injecteren in de buis. Zorg ervoor dat u eventuele bubbels minimaliseert door het knippen langzaam te voltooien, omdat overmatig schuimen extra celdood kan veroorzaken39.
  2. Plaats een celzeef van 40 μm op een steriele conische buis van 50 ml en maak deze nat door 5 ml DMEM + 10% FBS & 1% P / S te pipetteren.
  3. Pipetteer 1 ml van het monster per keer door de celzeef.
  4. Was de celzeef door DMEM met 10% FBS en 1% P/S door de zeef te pipetteren om het totale volume in de buis op 25 ml te brengen.
  5. Splits 25 ml van het monster gelijkmatig in twee conische buizen van 15 ml en centrifugeer bij 15 °C, 400 x g gedurende 15 minuten.
    OPMERKING: Het splitsen van de spieroplossing in twee conische buizen van 15 ml zorgt voor een beter celherstel na centrifugatie in vergelijking met een enkele buis.
  6. Zuig het supernatant op en suspensie de pellet opnieuw in 1 ml 1x RBC Lysis-buffer (zie aanvullend bestand) bij kamertemperatuur gedurende 7 minuten om erytrocyten te elimineren.
  7. Breng het volume op 10 ml met 9 ml wasbuffer (zie aanvullend bestand)en spinbuizen op 400 x g,15 °C gedurende 15 minuten.
  8. Zuig het supernatant op en recombineer pellets door opnieuw te suspensie in een wasbuffer van 1 ml.
  9. Breng een geschikt volume cellen over in een afzonderlijke microcentrifugebuis van 1,5 ml en meng met trypanblauwe kleurstof. Tel levende cellen op een lichtmicroscoop met behulp van een hemocytometer.

4. Antilichaamkleuring voor flowcytometrie

OPMERKING: Het Sca-1-antilichaam moet worden geconjugeerd aan APC voorafgaand aan flowcytometrie / FACS-experimenten, volgens de instructies van de fabrikant. De prestaties moeten voor elke partij conjugaten worden gevalideerd(figuur 2). De uiteindelijke vervoegingen kunnen worden bewaard in aliquots van 20 μL bij -20 °C en zijn drie weken stabiel. Raadpleeg het aanvullend dossier voor het volledige vervoegingsprotocol.

  1. Breng voor flowcytometrie 1-2 x 106 cellen per experimenteel monster over naar een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml. Breng het volume tot 1 ml met wasbuffer en plaats het op ijs.
  2. Stel voor elk experiment de volgende vereiste controles in: i) niet-gekleurd en ii) levensvatbaarheidscontroles om nauwkeurig te selecteren voor de levende celpopulatie; iii) fluorescentie minus één (FMO) controles op eencellige suspensies om nauwkeurige poorten in te stellen voor CD31-/CD45-fracties, FAPs en parlementsleden; en iv) enkelgekleurde compensatieparels om te corrigeren voor fluorescentieoverloop tussen kanalen.
    1. Voor alle celcontroles, aliquot 5 x 105 - 1 x 106 cellen in 1 ml wasbuffer in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en op ijs plaatsen.
    2. Voeg voor kraalcontroles 1 druppel positieve compensatieparels (~ 1,5 x 105 kralen per druppel) toe aan elke gelabelde microcentrifugebuis van 1,5 ml. Het volledige pakket controles is opgenomen in tabel 1.
      OPMERKING: Als het experiment voor de eerste keer wordt uitgevoerd, voert u single-stained controles uit voor elk geconjugeerd antilichaam op eencellige suspensies (naast ongekleurde, levensvatbaarheid, enkelgekleurde compensatiekraal en FMO-controles) om de positief gekleurde populatie in cellen te beoordelen en kleuring te valideren die is waargenomen op compensatieparels. Valideer elk vers geconjugeerd Sca-1::APC-preparaat door enkelvoudige kleuring uit te voeren op compensatieparels en eencellige suspensies. Raadpleeg tabel 1 voor een volledige lijst van kleuringscontroles.
  3. Om de levensvatbaarheidscontrole voor te bereiden, brengt u de helft van het volume cellen over van de "levensvatbaarheidsbuis" naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml. Label deze buis "Dood".
  4. Incubeer "Dead" buis bij 65 ° C gedurende 2-3 minuten om de cellen te doden en plaats ze vervolgens op ijs. Na 2-3 minuten, combineer dode cellen opnieuw met levende cellen die achterblijven in de levensvatbaarheidscontrolebuis. Deze populatie van cellen zal worden gebruikt om compensatiewaarden in te stellen (indien nodig) en op de juiste manier poorten te instellen voor de levensvatbaarheidskleurstof.
  5. Centrifugeer de eencellige suspensies (experimentele monsters en controles) gedurende 5 minuten bij 500 x g, 4 °C.
  6. Zuig het supernatant op en suspensie celkorrels opnieuw in een wasbuffer van 100 μL.
  7. Voeg antilichamen toe, afhankelijk van het experimentele monster of de controle. Raadpleeg de kleuringsmatrix (tabel 2) voor informatie over antilichaamcombinaties en hoeveelheden.
  8. Veeg voorzichtig met elk monster om een volledige menging te garanderen en incubeer gedurende 15 minuten op ijs in het donker. Voor compensatieparels, incubeer bij kamertemperatuur in het donker gedurende 15 minuten.
  9. Voor experimentele en controlemonsters met eencellige suspensie brengt u het volume op 1 ml door een wasbuffer van 900 μL toe te voegen. Voor compensatiekraalcontroles brengt u het volume op 1 ml met 900 μL 1x PBS.
  10. Centrifugeer eencellige suspensiemonsters bij 500 x g,4 °C gedurende 5 minuten. Centrifugecompensatieparel regelt bij 300 x g,4 °C gedurende 5 minuten.
  11. Voor alle eencellige suspensiemonsters, aspirateer en gooi supernatant en opnieuw suspensiecelkorrel in 300 μL wasbuffer. Voor compensatiekraalcontroles, aspirateer en gooi het supernatant weg, suspensie de pellet opnieuw in 300 μL van 1x PBS en voeg vervolgens 1 druppel (~ 1,5 x 105) negatieve compensatieparels toe.
  12. Bewaar alle eencellige suspensiemonsters op ijs onder aluminiumfolie en ga verder met flowcytometrische acquisitie. Compensatiekraalbedieningen moeten ook worden beschermd tegen licht, maar kunnen bij kamertemperatuur worden bewaard.
    OPMERKING: Als het experimentele eindpunt FAPs-identificatie door flowcytometrie is, volg dan de stappen 5.1.1-5.1.11. Als het eindpunt celisolatie via FACS voor kweek en kleuring is, volg dan de stappen 5.2.1-5.2.9 en rubrieken 6-7.

5. Flowcytometrie en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)

  1. Flowcytometrie
    OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van een benchtop flowcytometer uitgerust met 405 nm, 488 nm en 640 nm lasers die in staat zijn om tegelijkertijd 10 verschillende kleuren te onderscheiden. Bandpass-filters en de bijbehorende fluorchromen die in dit protocol worden gebruikt, zijn als volgt: 450/50 (SYTOX Blue), 530/30 (FITC), 575/25 (PE) en 670/30 (APC). De spanningen voor elke detector zijn als volgt: FSC 700; SSC 475; FITC 360; PE 460; PE-Cy7 600; SYTOX Blauw 360; APC 570. Zorg ervoor dat u voor gebruik bent getraind in de juiste werking van de flowcytometer of celsorteerder.
    1. Zorg ervoor dat de cytometer gedurende 10-20 minuten voor gebruik is ingeschakeld en is geprimed door achtereenvolgens te reinigen met schone, spoel- en mantelvloeistofoplossingen voor elk 30-45 s. Werk af met een spoeling met dH2O. Zorg ervoor dat er voldoende hoeveelheid mantelvloeistof aan de opslagcontainer is toegevoegd om de juiste monsterstroom tijdens de acquisitie te behouden.
    2. Stel de gating-strategie in om FAPs en parlementsleden te identificeren zoals beschreven in figuur 3.
      OPMERKING: FAPs en MP's worden geïdentificeerd door de volgende hiërarchische gatingstrategie: i) SSC-A vs FSC-A (zijcelverstrooiingsgebied versus voorwaarts celverstrooiingsgebied naar afzonderlijke cellen versus puin), ii) FSC-W vs FSC-H (voorwaartse celverstrooiingsbreedte versus voorwaartse celverstrooiingshoogte om singlets te onderscheiden van doubletten in de FSC-parameter), iii) SSC-W versus SSC-H (zijcelverstrooiingsbreedte versus zijcelverstrooiingshoogte om singlets te onderscheiden van doubletten in de SSC-parameter), iv) SSC-A vs SYTOX Blue (om levende versus dode singlets te onderscheiden), v) SSC-A vs CD31/45::FITC (om CD31+ en CD45+ cellen uit te sluiten van verdere analyse), en vi) Sca-1::APC vs VCAM-1::P E van de CD31-/CD45- (Lineage; Lin-) bevolking (identificatie van FAPs en Parlementsleden). FAP's worden geïdentificeerd als CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1-events en MPs worden geïdentificeerd als CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ events.
    3. Voer eerst elke enkelgekleurde compensatieparelcontrole op lage snelheid door de cytometer om compensatiewaarden te genereren die worden gebruikt om te corrigeren voor eventuele fluorescentieoverloop tussen kanalen. Beoordeel de compensatie door het fluorescerende signaal van elke besturing in zijn eigen detector (bijv. SSC-A versus APC voor Sca-1::APC enkelvlekte kralen) en alle andere detectoren te vergelijken. Er moeten twee verschillende populaties zijn (een met negatief en een met positief signaal) in de juiste detector en alleen een negatieve populatie in alle andere detectoren. Stel de stoppoort in op 10.000 compensatiekraalgebeurtenissen en noteer de gegevens.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u tussen de acquisitie van elk monster dH2O gedurende 10-20 seconden door de cytometer laat lopen om besmetting van monster tot monster te voorkomen.
    4. Verwerk vervolgens de ongekleurde en levensvatbaarheidscontrolemonsters om de levende afzonderlijke cellen goed te sluiten. Stel de stoppoort in op 10.000 singletgebeurtenissen en leg gegevens vast.
      OPMERKING: Voeg ongeveer 5 minuten voordat elk monster van de suspensie van een enkele cel, met uitzondering van het niet-gekleurd monster, 1 μL SYTOX Blue-levensvatbaarheidskleurstof (300 μM werkconcentratie verdund uit 1 mM stamoplossing) aan elk monster toe en veeg zachtjes om te mengen (eindconcentratie 1 μM).
    5. Verkrijg vervolgens de resterende eencellige suspensiecontrolemonsters. Beoordeel elke FMO-controle met de juiste plot in de gating-strategie(figuur 3). Beoordeel bijvoorbeeld het FITC-signaal van de CD31+CD45 FMO om een nauwkeurige CD31-/CD45-gate te garanderen. Een optimaal voorbeeld is weergegeven in figuur 3G. Als het protocol voor de eerste keer wordt uitgevoerd, moeten single-stained controles op cellen worden uitgevoerd voordat FMO-controles worden verkregen.
    6. Beoordeel het fluorescerende signaal van elk enkel gekleurd celmonster in de juiste detector en in alle andere detectoren om de juiste compensatie te valideren. Stel de stoppoort in op 10.000 live singlet-evenementen en neem op in de software.
    7. Zodra alle controles (eencellige suspensies en kralen) zijn verwerkt, bereidt u alle experimentele monsters voor door eerst het volume van elk monster te meten en te registreren. Deze metingen zullen worden gebruikt om FAPs en PARLEMENTSLEDEN nauwkeurig te kwantificeren, zoals beschreven in stap 5.1.11. Voeg vervolgens 50 μL precisietelparels toe en meng voorzichtig door 2-3 keer op en neer te pipetteren.
    8. Voer kort het eerste experimentele monster uit om de identificatie van de tetellende kralenpopulatie te valideren. Deze populatie verschijnt als een kleine afzonderlijke cluster gescheiden van de algemene celpopulatie op de FSC-A vs SSC-A plot(Figuur 3A,rode doos). Maak een poort rond de telkraalpopulatie. Verwerf vervolgens gegevens voor elk experimenteel monster door de cytometer op lage snelheid te verwerken. Stel de stoppoort in op 10.000 tellen van kraalgebeurtenissen en record.
      OPMERKING: Onderzoekers kunnen ook telparels identificeren door een extra plot in te stellen dat SSC-A beoordeelt ten opzichte van een van de detectoren, omdat de telparels fluorescerend zijn in alle detectoren.
    9. Nadat alle monsters zijn verwerkt, reinigt u de cytometer met behulp van de juiste protocollen. Exporteer alle gegevens voor analyse.
    10. Open alle gegevensbestanden op een geschikte flowcytometrie-analysesoftware. Stel de gatingstrategie in zoals gebruikt voor gegevensverzameling zoals beschreven in stap 5.1.2. Onderzoek besturingselementen in dezelfde volgorde als bij gegevensverzameling (bijv. Onbevlekt, levensvatbaarheid, enkele vlek en vervolgens FMO-controles) om de gatingstrategie opnieuw te valideren. Zodra nauwkeurige poorten zijn ingesteld met behulp van FMO-bedieningselementen, past u de poorten toe op alle experimentele monsters. Exporteer onbewerkte gegevens als een spreadsheet voor kwantificering.
    11. Bereken het aantal FAPs en MPs in elke experimentele steekproef met behulp van de telparels:
      figure-protocol-1
      waarbij het aantal verworven cellen het aantal geregistreerde gebeurtenissen van relevante celpopulatie (bijv. FAPs of parlementsleden) op de acquisitiesoftware is; Acquired Bead Count is het aantal geregistreerde gebeurtenissen van het tellen van kralen op de acquisitiesoftware; Telparels Volume is het volume van de telkraaloplossing dat is toegevoegd in stap 5.1.7; Monstervolume = het volume van elk gekleurd experimenteel monster voorafgaand aan de toevoeging van telparels. Kraalconcentratie is het aantal kralen per μL-oplossing; deze waarde vindt u in het productgegevensblad.
  2. FACS - sortering voor celkweek
    OPMERKING: Dit protocol voert FACS uit op een celsorteerder uitgerust met 4 lasers (UV, Violet, Blauw, Rood) die in staat is om tegelijkertijd 11-14 kleuren te onderscheiden. Volg het experimentele monsterkleuring (sectie 4) en het flowcytometrieprotocol, met uitzondering van stap 1 tot en met 3 hieronder, om de FACS-workflow te optimaliseren:
    1. Verhoog de concentratie van cellen in de te sorteren experimentele monsters tot 7 x 106 cellen / ml om robuuste opbrengsten van FAPs en MP's te genereren.
    2. Om deze significante toename van de celconcentratie te verklaren, verdubbelt u alle antilichaamconcentraties in de experimentele monsters die moeten worden gesorteerd.
    3. Verwerk de laatste gekleurde celmonsters door een 40 μM celzeefdop die onmiddellijk voorafgaand aan het sorteren op een polystyreenbuis van 5 ml is aangebracht om celklontering te verminderen en de sorteeropbrengst te verhogen.
    4. Verzamel enkele, levende rat-FAPs en MP's rechtstreeks van de celsorteerder in een polypropyleen verzamelbuis van 5 ml met 1 ml steriel, 100% foetaal runderserum (FBS). Houd cellen op ijs totdat het sorteren is voltooid.
      OPMERKING: Als u FACS uitvoert op een externe locatie, breng dan alle gesorteerde cellen over op ijs en in een beveiligde, overdekte container.
    5. Werk in een steriele bioveiligheidskast (BSC), breng het volume van gesorteerde cellen tot 7 ml met geschikte groeimedia (bijv. FAP-groeimedia (FAP GM) voor gesorteerde FAPs en MP-groeimedia (MP GM) voor gesorteerde parlementsleden; zie Aanvullend bestand voor recepten) en centrifugeer bij 500 x g, 4 °C gedurende 7 minuten om zoveel mogelijk resterende wasbuffer te verwijderen.
    6. Resuspend pellets in 1 ml geschikte groeimedia en plaat in een 12-putplaat met een steriele, met collageen beklede glazen afdekkingslip/put van 12 mm voor daaropvolgende immunostaining (zie rubriek 6).
      OPMERKING: Als immunocytochemische kleuring voor collageen, plaat gesorteerd cellen in een 12 put plaat met een steriele, laminine-gecoate 12 mm glazen coverslip / put, in plaats van collageen-gecoat. Als immunocytochemische experimenten van onmiddellijk geïsoleerde voorlopercellen nodig zijn, zaad FAPs en MP's met een dichtheid van 15.000 cellen per cm2 en ga direct door naar stap 6.1. Voor langetermijnculturen om voorloperdifferentiatie te induceren, zaad-FAPs met een dichtheid van 5.000 cellen per cm2en PARLEMENTSLEDEN met een dichtheid van 7.500 cellen per cm2.
    7. Incubateer cellen bij 37 °C en 5% CO2 in een celkweekincubator. Na 72 uur cultuur verander je de helft van de media. Wissel media volledig om de 2-4 d daarna.
    8. Om de ontwikkeling van myocyten te induceren, schakelt u op dag 9 van de cultuur over op MP-differentiatie (MD) medium. Om adipocyten te induceren, schakelt u FAPs-culturen over naar FAP adipogene differentiatie (AD) medium op dag 10 van de cultuur.
    9. Om fibrogenese te induceren, kunnen FAP's worden overgeschakeld op fibrogene differentiatiemedia (FD) op variabele tijdstippen tijdens de kweek, of als alternatief kunnen ze direct in FD-media worden gezaaid na isolatie (stap 5.2.6) (zie aanvullend bestand voor alle mediarecepten).

6. Immunocytochemie van gekweekte FAPs en Parlementsleden

  1. Om celsortering te valideren en de zuiverheid van FAPs- en MP-culturen aan te tonen, immunostain met celtypespecifieke markers, waaronder PDGFRα (FAPs-marker), Pax-7 (spierstam [satelliet] celmarker), Fibroblast-specifiek eiwit (FSP-1, fibroblastmarker), Perilipin-1 (Plin-1, adipocytenmarker), Collageentype 1 (Col1a1, indicator van fibrose), Myosine Heavy Chain (MHC, volwassen myocytenmarker).
    1. Voor immunostaining van vers gesorteerde cellen, centrifugeer de 12-well plaat bij 200 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur om de hechting van cellen aan de coverslip / put te vergemakkelijken. Deze stap is niet nodig voor culturen op de lange termijn. Cultuurmedia verwijderen.
    2. Voor immunostaining met FSP-1 fixeert u cellen met 1 ml 100% methanol (MeOH) gedurende 2 minuten bij 4 °C. Als immunostaining voor PDGFRα, Plin-1, Pax7 of Col1a1, fixeer celculturen met 1 ml 4% PFA in 1x PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. MHC immunostaining verdraagt beide fixatieve.
      OPMERKING: Voor methanol-vaste cellen slaat u stap 6.2 over en gaat u verder met stap 6.3.
  2. Aspirateer 4% PFA en was celculturen snel 3-4 keer met 1x PBS. Voeg 1 ml 100 mM Glycine toe in 1x PBS en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om resterende PFA te inactiveren. Aspirateer en was 1-2 keer met 1x PBS.
    OPMERKING: Cellen kunnen in dit stadium worden achtergelaten in 2 ml 1x PBS, gewikkeld in vershoudfolie en maximaal 7-10 dagen bij 4 °C bewaard.
  3. Voeg na het wassen 1 ml 0,1% Triton-X toe in 1x PBS en incubeer gedurende 20 minuten om celmembranen te permeabiliseren.
  4. Was putten 2-3 keer met 1-2 ml 1x PBS en blokkeer vervolgens cellen met 1 ml 1x PBS + 3% BSA per put gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  5. Pipetteer 80 μL primair antilichaam verdund in 1x PBS + 3% BSA (PDGFRα 1:100, Pax7 neat, FSP-1 1:50, Plin-1 1:400, Col1a1 1:250, MHC 3 μg/ml) op een stuk parafilm dat op een mobiele container is geplakt. Til met behulp van een steriele fijne tang voorzichtig de deklip uit de put en keer terug op de druppel antilichaamoplossing. Incubeer coverslip met twee natte stukken keukenpapier en dek de container af in plastic folie om verdamping van de antilichaamoplossing te voorkomen. Incubeer een nacht bij 4 °C.
    OPMERKING: Het kleuren van coverslips uit de put maakt gebruik van minder antilichaam (~ 80 μL) dan kleuring in de put (minimaal 500 μL).
  6. Laat op dag 2 coverslips 30 minuten op kamertemperatuur staan om op te warmen. Gebruik de tang zorgvuldig naar rechts en breng coverslips terug naar hun respectievelijke putten (cellen naar boven gericht) en was 2-3 keer met 1-2 ml 1x PBS gedurende 2 minuten elk om zoveel mogelijk primaire antilichamen te verwijderen.
  7. Met behulp van dezelfde kleuringstechniek als bij primaire antilichaamkleuring, vlekken cellen met geiten anti-konijn Alexa Fluor 488 secundair antilichaam (1:400) om FSP-1, Plin-1, Col1a1 of PDGFRα en geiten anti-muis Alexa Fluor 555 secundair antilichaam (1:300) te detecteren om MHC of Pax-7 te detecteren. Incubeer cellen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en houd cellen beschermd tegen licht.
  8. Breng cellen terug naar de put en incubeer cellen met Hoechst (1:10.000) gedurende 2-4 minuten bij kamertemperatuur. Was cellen nog eens 2-3 keer met 1x PBS gedurende 2 minuten elk om overtollige Hoechst te verwijderen.
  9. Monteer coverslips op glazen platen met behulp van een anti-fade fluorescerend montagemedium en laat dia's 's nachts drogen in het donker bij kamertemperatuur. Bewaar gemonteerde coverslips bij 4 °C in het donker.

7. Oil Red O (ORO) kleuring van gekweekte FAPs en Parlementsleden

  1. Voer ORO-kleuring uit op niet-gepermeabiliseerde cellen, omdat permeabilisatie van het celmembraan kan resulteren in niet-specifieke / ongewenste kleuring van niet-adipogene celtypen. Voordat u begint met kleuren, bereidt u een ORO-werkvoorraad voor (zie aanvullend bestand voor het recept) en incubeert u gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
  2. Filter de oplossing na 20 minuten met een filter van 0,2 μm om eventuele onopgeloste aggregaten te verwijderen.
  3. Zuig media uit de put en voeg 1 ml 10% neutraal gebufferd formaline (10% NBF) toe. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Celconfluentie kan resulteren in het opheffen van de put / coverslip. Wees voorzichtig bij het aanzuigen/toevoegen van oplossingen.
  4. Aspirateer en voeg 1 ml verse 10% NBF toe en incubeer gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Het protocol kan op dit punt worden gestopt, omdat cellen 's nachts in 10% NBF kunnen worden achtergelaten.
  5. Was de putjes snel één keer met 1 ml 60% isopropanol, aspirateer vervolgens en laat de putten volledig drogen (ongeveer 2 min).
  6. Voeg 400 μL Oil Red O-werkvoorraad per put toe en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, zorg ervoor dat u geen ORO op de wanden van de plaat pipettert.
  7. Verwijder alle Oil Red O en was de put snel 4 keer met dH2O.
    OPMERKING: Als gekleurde putjes coverslips bevatten, monteer dan met dezelfde techniek als beschreven in stap 6.9.
  8. Beeld ofwel gemonteerde coverslips of de gebeitste put met behulp van een brightfield microscoop.

8. Weefselkleuring van contralaterale en gedenervateerde gastrocnemiussecties bij ratten

  1. Picrosirius Rood (PSR)
    1. Voer PSR-kleuring uit op 5 μm dikke, formaline-gefixeerde paraffine ingebedde (FFPE) rat gastrocnemius histologische secties zoals eerder beschreven40.
  2. Olie Red O (ORO)
    1. Fixeer 5 μm dikke isopentane-bevroren rat gastrocnemius histologische secties in 4% PFA gedurende 10 min, incubeer in 60% isopropylalcohol gedurende 1 min.
    2. Beits met ORO-werkvoorraad gedurende 12 min. Incubeer gedurende 1 min in 60% isopropylalcohol, was gedurende 10 min in dH2O. Monteer op coverslips met behulp van een in water oplosbaar montagemedium.
  3. Sca-1 en laminine weefsel fluorescerende immunohistochemie (IHC)
    1. Voer fluorescerende IHC uit op 5 μm dikke isopentane-bevroren rat gastrocnemius histologische secties.
    2. Hydrateer monsters in 1x PBS gedurende 5 minuten, fixeer in 4% PFA gedurende 10 minuten en incubateer monsters vervolgens in weefsel IF-blokkerende oplossing (zie Aanvullend bestand) gedurende 90 minuten.
    3. Incubateer met anti-Sca-1 primair antilichaam (1:500) verdund in 1x PBS + 0,05% Tween bij 4 °C 's nachts.
    4. Was op dag 2 drie keer in 1x PBS + 0,05% Tween gedurende 5 minuten elk en incubeer vervolgens in geit anti-konijn Alexa Fluor 555 (1:500) gedurende 1 uur.
    5. Was opnieuw (zoals voorheen), incubeer met blokkerende oplossing gedurende 1 uur en voeg vervolgens anti-laminine primair antilichaam (1:500) verdund in 1x PBS + 0,05% Tween gedurende 1 uur toe.
    6. Was opnieuw (zoals voorheen) en incubeer vervolgens in geiten anti-konijn Alexa Fluor 488 (1:500) gedurende 1 uur (voor laminine).
    7. Was opnieuw (zoals voorheen) en incubeer vervolgens in DAPI (1:10.000) gedurende 4 min. Was en monteer op coverslips met behulp van anti-fade montagemedium.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het identificeren van FAPs en MP's via flowcytometrie met behulp van een nieuw antilichaampanel, waaronder Sca-1 en VCAM-1
De gating-strategie voor het identificeren van FAPs in rattenspier is gebaseerd op flowcytometrieprotocollen in de muis29, die poort op CD31 (endotheel) en CD45 (hematopoietische) positieve cellen (de afstamming [Lin] genoemd) en onderzoekt het fluorescerende profiel van FAPs marker Sca-1 en MPs marker ITG...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een geoptimaliseerd, gevalideerd FAPs-isolatieprotocol voor rattenspier is essentieel voor onderzoekers die letselmodellen willen bestuderen die om biologische of technische redenen niet haalbaar zijn in de muis. Muizen zijn bijvoorbeeld geen optimaal diermodel om chronische lokale of neurodegeneratieve verwondingen zoals langdurige denervatie te bestuderen. Biologisch gezien maken de korte levensduur en snelle veroudering van muizen het moeilijk om de spiersequalae nauwkeurig af te bakenen als gevolg van denervatie van ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen conflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen de Flow cytometry Core Facilities aan de Universiteit van Ottawa en het Keenan Research Centre for Biomedical Sciences (KRC), St Michaels Hospital Unity Health Toronto bedanken voor hun expertise en begeleiding bij het optimaliseren van het flowcytometrie / FACS-protocol dat in dit manuscript wordt gepresenteerd. Dit werk werd gefinancierd door Medicine by Design New Ideas 2018 Fund (MbDNI-2018-01) aan JB.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
5 mL Polypropylene Round-Bottom TubeFalcon352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer CapFalcon352235
10 cm cell culture dishesSarstedt83.3902
12-well cell culture plateThermoFisher130185
12 mm glass coverslips, No.2VWR89015-724
10 mL SyringeBeckton Dickenson302995
15 mL centrifuge tubesFroggaBio91014
20 gauge needleBeckton Dickenson305176
25mL Serological pipetteSarstedt86.1685.001
40µm cell strainerFisher Scientific22363547
50mL centrifuge tubesFroggaBioTB50
AbC Total Antibody Compensation Beads ThermoFisherA10497
Ammonium Chloride, Reagent GradeBioshopAMC303.500
APC Conjugation Kit, 50-100µgBiotium92307
Aquatex Aqueous Mounting MediumMerck108562
Biolaminin 411 LNBiolaminaLN411
Bovine Serum Albumin (BSA)BioshopALB001
Calcium ChlorideBioshopCCL444.500
Collagenase Type IIGibco17101015
CountBright Plus Absolute Counting BeadsThermoFisherC36995
DexamethasoneMillipore SigmaD4902
DispaseGibco17105041
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)Gibco11995-065(+)4.5 g/L D-Glucose
(+)L-Glutamine
(+)110 mg/L Sodium Pyruvate
EDTAFisherScientificS311
FACSClean SolutionBeckton Dickenson340345
FACSDiva SoftwareBeckton Dickenson--
FACSRinse SolutionBeckton Dickenson340346
Fetal Bovine SerumSigmaF1051
Flow Cytometry Sheath FluidBeckton Dickenson342003
FlowJo SoftwareBeckton Dickenson--
Fluorescent Mounting MediumDakoS302380-2
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibodyInvitrogenA21424
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibodyInvitrogenA11008
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibodyInvitrogenA21429
Goat SerumGibco16210-064
Ham's F10 MediaThermoFisher 11550043(+) Phenol Red
(+) L-Glutamine
(-) HEPES
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X)Multicell311-513-CL
Heat Inactivated Horse SerumGibco26050-088
HemocytometerReichertN/A
HEPES, minimum 99.5% titrationSigmaH3375
Horse SerumThermoFisher16050130
Human Transforming Growth Factor β1 (hTGF-β1)Cell Signaling8915LF
Humulin RLillyHI0210
IBMXMillipore SigmaI5879Ook bekend als 3-Isobutyl-1-methylxanthine
IsopropanolSigmaI9516Ook bekend als 2-propanol
Lewis Rat, FemaleCharles River Kingston004 (Strain Code)200-250 gram gebruikt
LSRFortessa X-20 Benchtop CytometerBeckton Dickenson--
MicrocentrifugeEppendorfEP-5417R
MoFlo XDP Cell SorterBeckman Coulter--
Mouse Anti-CD31::FITC AntibodyAbcamab33858Clone TLD-3A12
Mouse Anti-CD45::FITC AntibodyBiolegend202205Clone OX-1
Mouse Anti-CD106::PE AntibodyBiolegend200403Ook bekend als VCAM-1
Mouse Anti-MHC AntibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)N/AOok bekend als MF20
Mouse Anti-Pax7 AntibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)N/A
Neutral Buffered Formalin, 10 %SigmaHT501128
Oil Red OMillipore SigmaO0625
PE-Cy7 Conjugation KitAbcamab102903
Penicillin-StreptomycinSigma P4333
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X)Gibco10010-023(-)Calcium Chloride
(-)Magnesium Chloride
Potassium Bicarbonate, Reagent GradeBioshopPBC401.250
Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) AntibodyInvitrogenMA5-32347FSP-1 ook bekend als S100A4
Rabbit Anti-Integrin-a7 AntibodyAbcamab203254
Rabbit Anti-Laminin AntibodySigmaL9393
Rabbit Anti-Perilipin-1 AntibodyAbcamab3526
Rabbit Anti-Sca-1 AntibodyMillipore SigmaAB4336
Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I AntibodyAbcamab260043Ook bekend als Col1a1
Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha AntibodyAbcamab203491
Recombinant Human FGF-basicGibcoPHG0266
Sodium AzideSigma

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12, 153-163 (2010).
  2. Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).
  3. Uezumi, A., Ikemoto-Uezumi, M., Tsuchida, K. Roles of nonmyogenic mesenchymal progenitors in pathogenesis and regeneration of skeletal muscle. Frontiers in Physiology. 5, 1-11 (2014).
  4. Biswas, A. A., Goldhamer, D. J. FACS fractionation and differentiation of skeletal-muscle resident multipotent Tie2+ progenitors. Methods in Molecular Biology. 1460, 255-267 (2016).
  5. Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network. Frontiers in Physiology. 10, 1-10 (2019).
  6. Wosczyna, M. N., Rando, T. A. A muscle stem cell support group: Coordinated cellular responses in muscle regeneration. Developmental Cell. 46 (2), 135-143 (2018).
  7. Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
  8. Uezumi, A., et al. Fibrosis and adipogenesis originate from a common mesenchymal progenitor in skeletal muscle. Journal of Cell Science. 124 (21), 3654-3664 (2011).
  9. Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
  10. Malecova, B., et al. Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  11. Madaro, L., et al. Denervation-activated STAT3-IL-6 signalling in fibro-adipogenic progenitors promotes myofibres atrophy and fibrosis. Nature Cell Biology. 20 (8), 917-927 (2018).
  12. Heredia, J. E., et al. Type 2 innate signals stimulate fibro/adipogenic progenitors to facilitate muscle regeneration. Cell. 153 (2), 376-388 (2013).
  13. Fiore, D., et al. Pharmacological blockage of fibro/adipogenic progenitor expansion and suppression of regenerative fibrogenesis is associated with impaired skeletal muscle regeneration. Stem Cell Research. 17 (1), 161-169 (2016).
  14. Kang, X., et al. Interleukin-15 facilitates muscle regeneration through modulation of fibro/adipogenic progenitors. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 1-11 (2018).
  15. Lovering, R. M., Roche, J. A., Goodall, M. H., Clark, B. B., Mcmillan, A. An in vivo rodent model of contraction-induced injury and non-invasive monitoring of recovery. Journal of Visualized Experiments. (51), e2782(2011).
  16. Iyer, S. R., Valencia, A. P., Hernández-Ochoa, E. O., Lovering, R. M. In vivo assessment of muscle contractility in animal studies. Methods in Molecular Biology. 1460, 293-307 (2016).
  17. Mintz, E. L., Passipieri, J. A., Lovell, D. Y., Christ, G. J. Applications of in vivo functional testing of the rat tibialis anterior for evaluating tissue engineered skeletal muscle repair. Journal of Visualized Experiments. (116), e54487(2016).
  18. Hakim, C. H., Wasala, N. B., Duan, D. Evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice. Journal of Visualized Experiments. (72), e50183(2013).
  19. Moorwood, C., Liu, M., Tian, Z., Barton, E. R. Isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies. Journal of Visualized Experiments. (71), e50036(2013).
  20. Gerlinger-Romero, F., et al. Non-invasive assessment of dorsiflexor muscle function in mice. Journal of Visualized Experiments. (143), e58696(2019).
  21. Iohom, G., et al. Long-term evaluation of motor function following intraneural injection of ropivacaine using walking track analysis in rats. British Journal of Anaesthesia. 94 (4), 524-529 (2005).
  22. Brown, C. J., et al. Self-evaluation of walking-track measurement using a sciatic function index. Microsurgery. 10 (3), 226-235 (1989).
  23. Bozkurt, A., et al. CatWalk gait analysis in assessment of functional recovery after sciatic nerve injury. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 91-98 (2008).
  24. Deumens, R., Jaken, R. J. P., Marcus, M. A. E., Joosten, E. A. J. The CatWalk gait analysis in assessment of both dynamic and static gait changes after adult rat sciatic nerve resection. Journal of Neuroscience Methods. 164 (1), 120-130 (2007).
  25. McKinnon, K. M. Flow cytometry: An overview. Current Protocols in Immunology. 2018, 1-11 (2018).
  26. Jensen, A. R., et al. Neer Award 2018: Platelet-derived growth factor receptor α co-expression typifies a subset of platelet-derived growth factor receptor β-positive progenitor cells that contribute to fatty degeneration and fibrosis of the murine rotator cuff. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 27 (7), 1149-1161 (2018).
  27. Mosich, G. M., et al. Non-fibro-adipogenic pericytes from human embryonic stem cells attenuate degeneration of the chronically injured mouse muscle. JCI Insight. 4 (24), (2019).
  28. Lee, D., et al. HMGB2 is a novel adipogenic factor that regulates ectopic fat infiltration in skeletal muscles. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
  29. Low, M., Eisner, C., Rossi, F. Fibro/Adipogenic Progenitors (FAPs): Isolation by FACS and Culture. Muscle Stem Cells: Methods and Protocols. , 179-189 (2017).
  30. Giuliani, G., et al. SCA-1 micro-heterogeneity in the fate decision of dystrophic fibro/adipogenic progenitors. Cell Death and Disease. 12 (1), 1-24 (2021).
  31. Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
  32. Upadhyay, G. Emerging role of lymphocyte antigen-6 family of genes in cancer and immune cells. Frontiers in Immunology. 10, 819(2019).
  33. Boscolo Sesillo, F., Wong, M., Cortez, A., Alperin, M. Isolation of muscle stem cells from rat skeletal muscles. Stem Cell Research. 43, 101684(2020).
  34. Ciaramitaro, P., et al. Traumatic peripheral nerve injuries: Epidemiological findings, neuropathic pain and quality of life in 158 patients. Journal of the Peripheral Nervous System. 15 (2), 120-127 (2010).
  35. Noble, J., Munro, C. A., Prasad, V. S. S. V., Midha, R. Analysis of upper and lower extremity peripheral nerve injuries in a population of patients with multiple injuries. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 45 (1), (1998).
  36. Malik, S. Traumatic peripheral neuropraxias in neonates: A case series. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 8 (10), 10-12 (2014).
  37. Smith, B. W., Daunter, A. K., Yang, L. J. S., Wilson, T. J. An update on the management of neonatal brachial plexus palsy-replacing old paradigms a review. JAMA Pediatrics. 172 (6), 585-591 (2018).
  38. Rebolledo, D. L., et al. Denervation-induced skeletal muscle fibrosis is mediated by CTGF/CCN2 independently of TGF-β. Matrix Biology. 82, 20-37 (2019).
  39. Walls, P. L. L., McRae, O., Natarajan, V., Johnson, C., Antoniou, C., Bird, J. C. Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
  40. Yuen, D. A., et al. Culture-modified bone marrow cells attenuate cardiac and renal injury in a chronic kidney disease rat model via a novel antifibrotic mechanism. PLOS One. 5 (3), 9543(2010).
  41. Fukada, S. I. The roles of muscle stem cells in muscle injury, atrophy and hypertrophy. Journal of Biochemistry. 163 (5), 353-358 (2018).
  42. Itabe, H., Yamaguchi, T., Nimura, S., Sasabe, N. Perilipins: A diversity of intracellular lipid droplet proteins. Lipids in Health and Disease. 16 (1), 1-11 (2017).
  43. Chapman, M. A., Mukund, K., Subramaniam, S., Brenner, D., Lieber, R. L. Three distinct cell populations express extracellular matrix proteins and increase in number during skeletal muscle fibrosis. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 312 (2), 131-143 (2016).
  44. Hillege, M., Galli Caro, R., Offringa, C., de Wit, G., Jaspers, R., Hoogaars, W. TGF-β regulates Collagen Type I expression in myoblasts and myotubes via transient Ctgf and Fgf-2 Expression. Cells. 9 (2), 375(2020).
  45. Kafadar, K. A., Yi, L., Ahmad, Y., So, L., Rossi, F., Pavlath, G. K. Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration. Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).
  46. Batt, J. A. E., Bain, J. R. Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. Journal of Visualized Experiments. (81), e50657(2013).
  47. Carlson, B. M. The biology of long-term denervated skeletal muscle. European Journal of Translational Myology. 24 (1), (2014).
  48. Kennedy, E., et al. Embryonic rat vascular smooth muscle cells revisited - A model for neonatal, neointimal SMC or differentiated vascular stem cells. Vascular Cell. 6 (1), 1-13 (2014).
  49. Pannérec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials. Development (Cambridge). 140 (14), 2879-2891 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Flowcytometriedenervatie van de ratcelisolatieoppervlaktemarkersSca 1 conjugatiecelkweekimmuunkleuring

Gerelateerde artikelen