Methodenartikel

Horizontale Hippocampal Plakjes van de Hersenen van de Muis

21.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61753

⸱

22 september 2020

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Endometrium, Endometriosis and Reproductive Medicine, Department of Development and Regeneration, KU Leuven, 2Laboratory of Ion Channel Research, VIB-KU Leuven Center for Brain and Disease Research, Leuven, Belgium and Department of Molecular Medicine, KU Leuven

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel is bedoeld om een systematisch protocol te beschrijven om horizontale hippocampale hersenplakken bij muizen te verkrijgen. Het doel van deze methodologie is om de integriteit van hippocampale vezelroutes te behouden, zoals het perforantpad en het bemoste vezelkanaal om deukende gyrusgerelateerde neurologische processen te beoordelen.

Samenvatting

De hippocampus is een sterk georganiseerde structuur in de hersenen die deel uitmaakt van het limbische systeem en betrokken is bij geheugenvorming en consolidatie, evenals de manifestatie van ernstige hersenaandoeningen, waaronder de ziekte van Alzheimer en epilepsie. De hippocampus krijgt een hoge mate van intra- en interconnectiviteit, waardoor een goede communicatie met interne en externe hersenstructuren wordt gewaarborgd. Deze connectiviteit wordt bereikt via verschillende informatiestromen in de vorm van vezelbanen. Hersensegmenten zijn een veelgebruikte methodologie bij het verkennen van neurofysiologische functies van de hippocampus. Hippocampale hersensegmenten kunnen voor verschillende toepassingen worden gebruikt, waaronder elektrofysiologische opnames, licht microscopische metingen en verschillende moleculaire biologische en histochemische technieken. Daarom vertegenwoordigen hersensegmenten een ideaal modelsysteem om eiwitfuncties te beoordelen, om patofysiologische processen te onderzoeken die betrokken zijn bij neurologische aandoeningen en voor drugsontdekkingsdoeleinden.

Er bestaan verschillende manieren om preparaten te snijden. Brain slice preparaten met een vibratome zorgen voor een betere conservering van de weefselstructuur en garanderen een voldoende zuurstoftoevoer tijdens het snijden, wat voordelen biedt ten opzichte van het traditionele gebruik van een tissue chopper. Bovendien kunnen verschillende snijvlakken worden toegepast voor vibratome brain slice preparaten. Hier wordt een gedetailleerd protocol verstrekt voor een succesvolle voorbereiding van vibratome-gesneden horizontale hippocampale plakjes muishersenen. In tegenstelling tot andere segmentpreparaten maakt horizontaal snijden het mogelijk om de vezels van het hippocampale invoerpad (perforantpad) in een volledig intacte toestand binnen een segment te houden, wat het onderzoek naar entorhinal-hippocampale interacties vergemakkelijkt. Hier bieden we een grondig protocol voor de dissectie, extractie en acute horizontale snijden van het murine-brein en bespreken we uitdagingen en mogelijke valkuilen van deze techniek. Tot slot zullen we enkele voorbeelden laten zien voor het gebruik van hersensegmenten in verdere toepassingen.

Inleiding

De uitgebreide verkenning van de hippocampus begon toen Scoville en Milner het onvermogen van een patiënt (H.M.) meldden om nieuw, declaratief geheugen te vormen na chirurgische verwijdering van de hippocampus en nabijgelegen temporale kwabstructuren als een behandeling voor ernstige epilepsie1. Vanaf dat moment is de hippocampus uitgebreid bestudeerd, beginnend met algemene neuronale eigenschappen en functies tot de ontwikkeling van ernstige hersenaandoeningen, zoals epilepsie en de ziekte van Alzheimer2,3,4,5. De hippocampus maakt deel uit van het limbische systeem, bestaande uit een groep verwante hersenstructuren die betrokken zijn bij emotie en geheugenvorming6,7. Een dicht netwerk van verschillende vezelroutes bereikt een nauwe hippocampale connectiviteit met interne en externe hersenstructuren. Deze paden omvatten het mediale en laterale perforantpad (entorhinale cortex om gyrus, CA3 – CA1 en subiculum te deuken)8,het bemoste vezelpad (dentaat gyrus tot CA3)9 en het Schaffer collateral/associational commissural pathway (CA3 tot CA1)10 (Figuur 1). De hippocampus presenteert een van de meest breed verkende hersengebieden tot nu toe vanwege de sterk geconserveerde laminaire organisatie van de neuronale laagvorming en de mogelijkheid om vitale neuronale culturen en hersensegmenten met relatief gemak te verkrijgen5.

figure-introduction-1
Figuur 1: Cartoon ter illustratie van de verschillende hippocampale regio's en belangrijkste vezelroutes. De verschillende hippocampale gebieden worden aangegeven door effen gekleurde lijnen: entorhinale cortex (EC; zwart), dentate gyrus (DG; oranje), Cornu Ammonis (CA) 3 (cyaan), 2 (geel) en 1 (magenta) en het subiculum (groen). Vezelpaden worden weergegeven met een gekleurde stippellijn: het mediale (MPP, rood) en het laterale perforantpad (LPP, blauw) (van de entorhinale cortex tot de dentaat gyrus, CA3, CA1 en subiculum), de bemoste vezelroute (MF, violet) (van de dentate gyrus naar CA3) en de Schaffer collateral (SC, brown) (ipsilateral van CA3 naar CA1)/associational commissural pathways (AC, lichtgroen) (contralaterale van CA3 naar CA1). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Hersensegmentprotocollen leiden vaak tot het verlies van verbindingen van verder weg gelegen hersengebieden naar het interessegebied5. Bovendien zijn de haarvaten niet langer functioneel5 en wordt de bloedcirculatie beroofd11. Ondanks deze beperkingen worden hersenplakken nog steeds voornamelijk gebruikt voor het onderzoek naar neurofysiologische functies van de hippocampus vanwege een aantal voordelen. Ten eerste is de extractie van de hippocampus snel12 en vereist niet veel materialen. De enige essentiële instrumenten zijn een dissectiekit, een laboratoriumwaterbad, toegang tot carbogen en een trillende microtome (vibratome)13. Andere troeven van de hersenschijftechniek zijn de omzeiling van de bloed-hersenbarrière (BBB) en de wash-out van endogeen vrijgekomen moleculen vóór het begin van het experiment5, waardoor het mogelijk is het effect van geneesmiddelen met relatief nauwkeurige doseringscontrole te bestuderen14. Bovendien behouden hersensegmenten de cyto-architectuur en synaptische circuits binnen de hippocampus15,16, waar de neuroanatomie en de lokale omgeving met neuronale connectiviteit en complexe neuron-glia-interacties behouden blijven4,11,17. Bovendien zijn hippocampale vezelverbindingen overwegend unidirectioneel en hippocampale neuronen hebben een hoge synaptische plasticiteit, wat de verzameling en interpretatie van hoogwaardige elektrofysiologische opnames enorm vereenvoudigt om neurologische processen te begrijpen18,19. Belangrijk is dat hersensegmenten een waardevol goed vormen dat toepasbaar is in een breed scala aan verschillende wetenschappelijke technieken, variërend van moleculaire biologische technieken over beeldvormingsopnamen tot elektrofysiologische metingen12,20,21,22,23,24,25,26.

Zoals hierboven beschreven, hippocampale hersensegmenten presenteren een krachtig experimenteel hulpmiddel om structurele en functionele kenmerken van de synaptische connectiviteit te bestuderen. Dit biedt de mogelijkheid om de effecten van chemicaliën of mutaties op neuronale prikkelbaarheid en plasticiteit te beoordelen16.

Acute hersenschijfpreparaten vormen een relatief gevoelige techniek en de optimale snijkwaliteit is sterk afhankelijk van ideale experimentele omstandigheden, waaronder de leeftijd van het dier, de euthanasiemethode, de snelheid van dissectie en snijden, de snijoplossingen en parameters (bijv. snijsnelheid) en de omstandigheden voor plakherstel4. Daarom is een goed ontworpen protocol van het grootste belang en beveiligt het de reproduceerbaarheid in verschillende onderzoekseenheden13.

Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor acute horizontale hippocampale plakpreparaten, met als doel de integriteit van het hippocampale laterale en mediale perforantpad en het bemoste vezelpad te behouden, waardoor het onderzoek naar dentaat gyrusgerelateerde processen mogelijk is9. We zullen in detail de belangrijkste stappen beschrijven om de murinehersenen te ontleden, te extraheren en horizontaal te snijden, gevolgd door representatieve resultaten van calcium-microfluorimetrische opnamen en veldopwekkende postsynaptische potentiële opnames (fEPSP's) onder basisomstandigheden en tijdens LTP-inductieprotocollen in hersensegmenten van wilde type C57BL/6J-muizen.

Protocol

Alle dierproeven voor deze studie werden goedgekeurd door de ethische toetsingscommissie van de KU Leuven (België) (P021/2012).

1. Bereiding van hoog-sacharose plakoplossing en kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF)

  1. Voorafgaand aan de experimentele dag
    1. Bereid 1 L van 10x plakjes vooroplossing met water van laboratoriumkwaliteit type 1 met (in mM): 25 KCl, 20 CaCl2, 10 MgSO4, 12,5 KH2PO4 (tabel 1). Om calciumfosfaatprecipitatie te voorkomen, mengt u de chemicaliën langzaam in een bekerglas voorgevuld met 800 ml H2O terwijl u constant roert met een magnetische roerder. Bewaar de oplossing bij 4 °C of kamertemperatuur (RT).
  2. Op de experimentele dag
    1. Bereid 1 L van 1x ACSF met water van laboratoriumkwaliteit Type 1 met (in mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgSO4, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 25 Glucose (Tabel 2). Gebruik een dampdruk osmometer om de osmolariteit tussen 305–315 mOsm (pH ~ 7,55–7,6) te valideren.
      OPMERKING: Om calciumfosfaatprecipitatie te voorkomen, mengt u langzaam alle vaste chemicaliën in een bekerglas voorgevuld met 800 ml H2O terwijl u constant roert met een magnetische roerder. Voeg mgso4 en cacl2 helemaal aan het einde toe en druppel langzaam in de benodigde hoeveelheid van 1 M voorraadoplossingen.
    2. Continu bellen 1x ACSF oplossing bij RT met carbogen om pH in te stellen tussen 7.3–7.4.
      OPMERKING: Als de pH iets te hoog of te laag is, zouden kleine aanpassingen in de carbogenatiesterkte voldoende zijn. Als de pH hoger is dan 7,45 bij carbogenatie, pas deze dan aan door enkele druppels van 1 M NaH2PO4-oplossing toe te voegen.
    3. Bereid 250 ml (per brein) van 1x hoogsucroseschijfoplossing in een bekerglas met 25 ml pre-oplossing van 10x plakjes en (in mM): 252 Sucrose, 26 NaHCO3en 10 glucose (tabel 3). Controleer of de osmolariteit tussen 320-325 mOsm (pH ~ 7,55–7,6) ligt.
    4. Bubbel de high-sucrose slice oplossing gedurende 10-15 min met carbogen om de pH tussen 7.3–7.4 te regelen.
      OPMERKING: Als de pH hoger is dan 7,45 bij carbogenation, pas deze dan aan door een paar druppels 1 M KH2PO4-oplossing toe te voegen.
    5. Bewaar de high-sucrose slice oplossing 20-30 min in de ultravriezer (-80 °C) tot deze gedeeltelijk bevroren is.

2. Voorbereiding van de werkruimte voor de hersendissectie

  1. Bereid tijdens het afkoelen van de oplossing met hoge sacharoseschijf het volgende voor.
    1. Warm het waterbad op tot 32 °C.
    2. Vul de terugwinningskamer (figuur 2A) met de carbogenated ACSF-oplossing en plaats de kamer in het waterbad. Breng continu carbogen aan op de hoofd-ACSF-fles en de ACSF in de terugwinningskamer.
    3. Breng het dier naar de experimentele kamer.
      OPMERKING: De leeftijd, het geslacht en de stam van het dier moeten worden bepaald door de individuele experimenteerder en zijn afhankelijk van de specifieke onderzoeksvraag. De parameters van het dier moeten echter binnen één studie constant blijven om de vergelijkbaarheid tussen de verschillende experimentele dagen te garanderen. Dit protocol is ontworpen voor het gebruik van C57BL/6J mannelijke muizen op de leeftijd van 2-6 weken. Als oudere dieren worden gebruikt, moeten snij- en hersteloplossingen mogelijk dienovereenkomstig worden aangepast4,27 (bijv. NMDG+-gebaseerde oplossingen23,28) om de gezondheid van de hersenen van de acute plakjes te behouden.
    4. Bereid de anesthesiekamer voor.
    5. Leg tissuepapier, plastic Pasteur pipet met brede opening (opengesneden), 90 mm kweekschaal gevuld met ijs, een vierkant filterpapier bovenop de gekoelde kweekschaal, sterke schaar voor onthoofding, dissectieschaar, gebogen tang, spatel, 35 mm kweekschaal, fijne borstel, mes, monsterplaat (wordt geleverd met vibratome), superlijm, pipetpunt, vier riemen filterpapier (~ 2 cm x 0,5 cm) (figuur 2A).
    6. Stel de vibratome in: Programmeer eerst de vibratome voor de juiste instellingen (rijsnelheid van het blad: 0,08 mm/s, snijamplitude: 1,4 mm, snijfrequentie: 85 Hz) en bevestig de carbogenlijn in de snijkamer. Plaats vervolgens de snijkamer in de houder, vul de houder rond de snijkamer met ijs en bevestig alles aan de vibratome. Plaats ten slotte het scheermesje in de vibratome meshouder(afbeelding 2B).
  2. Voer na het invriezen van de hoog-sacharose-oplossing de volgende stappen uit.
    1. Haal na 20-30 minuten de high-sucrose slice oplossing uit de -80 °C ultravriezer en houd het bekerglas op ijs.
    2. Leg de high-sucrose oplossing naast de vibratome op je bankje, plet en meng de gedeeltelijk bevroren oplossing met een spatel om een lekkere slush te krijgen en begin te borrelen met carbogen.
    3. Neem wat high-sucrose slice oplossing met de plastic Pasteur pipet om het vierkante filterpapier bovenop de gekoelde 90 mm kweekschaal te weken.
    4. Vul de kweekschaal van 35 mm (of een equivalente kleine container die geschikt is om de hele hersenen op te slaan) tot 75% met de hoogsucrose-plakoplossing (voldoende om de hele hersenen te bedekken) en koel de kweekschaal op ijs die naast het bekerglas wordt bewaard met de rest van de oplossing. Karbogenate de oplossing in de 35 mm cultuurschaal.

3. Dissectie en positionering van de murine hersenen

  1. Verdoof het dier met 5% isofluraan. Bepaal de juiste diepte van anesthesie door de poot te knijpen. Er mag geen pootonttrekkingsreflex optreden.
  2. Breng het dier over op tissuepapier en onthoofd het met een sterke schaar of een kleine dierlijke guillotine.
  3. Gebruik een dissectieschaar om de hoofdhuid open te snijden.
  4. Snijd de calvaria langs de sagittale hechting open en verwijder deze met behulp van gebogen tang totdat de hele hersenen, inclusief de reukbollen, zichtbaar zijn.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u de hersenen niet beschadigt met de scherpe randen van de calvaria of tang.
  5. Gebruik een spatel om de hersenen voorzichtig uit te scheppen (reukbollen moeten gehecht blijven).
  6. Breng de hersenen over in de gekoelde 35 mm kweekschaal en verwijder alle haar- of bloeddeeltjes uit het weefsel door de hersenen voorzichtig te wassen met een met ACSF gevulde Pasteur-pipet (bloed heeft cytotoxische effecten op hersenweefsel29).
  7. Breng de hersenen met behulp van de spatel over op het doorweekte filterpapier bovenop de gekoelde kweekschaal van 90 mm (figuur 2A).
  8. Gebruik een mes om de hersenen doormidden te snijden, de twee hemisferen te scheiden en beide hersenhelften aan de vers gesneden mediale kant te plaatsen.
  9. Gebruik een mes om het dorsale deel te verwijderen (5%–10%) van de hersenen van elke hemisfeer met een parallelle snede naar de rugtop (figuur 2C)30 en plaats beide hersenhelften aan de vers gesneden kant met het ventrale deel van de hersenen naar boven gericht.
  10. Plaats een druppel superlijm op de monsterplaat en spreid deze goed uit met een pipetpunt om beide hemisferen te huisvesten.
  11. Gebruik een filterpapierriem om één halfrond met capillaire krachten op te pakken door de ventrale kant aan te raken met de filterpapierband, waardoor het weefsel niet wordt beschadigd.
  12. Gebruik een andere filterpapierband om de dorsale kant van de hersenen voorzichtig halfdroog te drogen voordat u de hersenhelft met de rugzijde op de lijm op de monsterplaat plaatst. Herhaal dezelfde procedure met de tweede hemisfeer.
    OPMERKING: De hemisferen moeten op een gespiegelde manier in horizontale uitlijning op de vibratomeplaat worden geplaatst, waarbij de rostrale zijden naar buiten wijzen en de caudale zijden naar elkaar gericht (maar niet aanraken) in het midden. De mediale zijden van beide hemisferen moeten naar het vibratomeblad en de zijkanten naar de experimenteerder wijzen (figuur 2D).
  13. Plaats de monsterplaat in de snijkamer en bedek deze snel, maar voorzichtig, met ijskoude high-sucrose slice solution slush. Zodra de oplossing de lijm raakt, zal deze stollen en de hemisferen correct op de monsterplaat lijmen.
  14. Zorg ervoor dat de hemisferen goed zijn bedekt met hoogsucrose slice-oplossing en bevestig dat de oplossing is bubbels met carbogen.
    OPMERKING: De hele dissectieprocedure moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd. Zorg ervoor dat de hersenen niet blijven zonder de toevoer van zuurstof voor een zeer lange tijd. Het duurt slechts ongeveer 1-1,5 minuut van onthoofding tot hersenonderdompeling in de high-sucrose slice oplossing slush. Dit is de meest kritieke vereiste voor acute brain slice preparaten om een hoge kwaliteit van de plak te garanderen.

4. Horizontaal snijden van de hersenen

  1. Plaats het vibratomeblad voor de mediale kant van de hemisferen en verlaag het tot dezelfde hoogte als de ventrale zijden van de hemisferen die nu naar boven gericht zijn. Laat het zaagblad met behulp van de vibratomeregeling verder in de dorsale richting zakken tot 600 μm en begin met snijden. Het mes moet het weefsel raken (zo niet, draai het mes om en laat het iets meer zakken). Snijd tot de eerste twee plakjes volledig van de twee hemisferen zijn gescheiden.
  2. Draai het mes om en laat nog eens 300 μm zakken en snijd opnieuw.
  3. Wanneer de hippocampus zichtbaar wordt (gebruik indien nodig de muis31 hersenatlas voor hulp) (figuur 2E) verzamel de plakjes met de verbrede plastic Pasteur pipet. Verzamel de plakjes totdat de caudate putamen zichtbaar wordt naast de hippocampus. Meestal kunnen tussen 8-12 plakjes van 300 μm (4-6 per halfrond) worden verzameld voor de muishersenen.
  4. Gebruik de plastic Pasteur pipet om de plakjes te verzamelen en over te brengen naar de terugwinningskamer in het waterbad(afbeelding 2F) (verzamel plakjes na elke snijronde om te voorkomen dat ze rondzweven in de snijkamer).
    OPMERKING: Werk zo snel mogelijk en zorg ervoor dat de hoogsucrose slice-oplossing ijskoud is en gedurende de hele procedure wordt gecarbogen. Vul indien nodig het ijs rond de snijkamer bij.

5. Herstel van hersenplakken voor elektrofysiologische opnames

  1. Laat de plakjes in de met ACSF gevulde terugwinningskamer gedurende 1 uur in het waterbad van 32 °C.
    OPMERKING: Herstelkamers zijn ook in de handel verkrijgbaar.
  2. Haal de herstelkamer uit het waterbad.
  3. Plaats de plakjes minstens nog 30 minuten op RT voor herstel voordat u met een verdere toepassing begint.

6. fEPSP-opnames in het mediale perforantpad (MPP) van de hippocampus

  1. Trek opnamepizetten van borosilicaatglascapillairen met een horizontale pipettrekker om pipetten ter grootte van ~ 2 MΩ te ontvangen wanneer ze zijn gevuld met ACSF-oplossing en ondergedompeld in de met ACSF gevulde opnamekamer.
  2. Vul ACSF-badoplossing en ACSF-oplossing met de juiste chemicaliën (bijv. Bicuculline) in een zwaartekrachtgestuurd perfusiesysteem met meerdere vaten dat op de opnamekamer is aangesloten. Continu alle oplossingen karbogen.
  3. Schakel een peristaltische of vacuümpomp in die is aangesloten op een zuigslang die tegenover de perfusielijn in de opnamekamer eindigt. Open het met ACSF gevulde vat en begin een continue stroom vast te stellen (1-2 druppels per seconde). Controleer of de referentieelektrode is ondergedompeld in de ACSF-oplossing.
  4. Schakel de installatiecomputer, de versterker, de micromanipulator, de stimulator, de microscooplamp(s), de camera en de monitor (indien van toepassing) in.
  5. Open de juiste software voor elektrofysiologische opnames (er bestaan verschillende hardware- en softwareleveranciers voor elektrofysiologische apparatuur).
  6. Breng één hersenschijfhersenhelft over van de herstelkamer naar de opnamekamer van de plakopstelling en plaats deze in de juiste richting met de dentate gyrusgranulaatcellaag en de moleculaire laag in het gezichtsveld. Zorg ervoor dat de stimulatie-elektrode het MPP in de plak kan bereiken vanuit de richting van de entorhinale cortex en dat de opname-elektrode toegang heeft tot het MPP vanaf de precies tegenovergestelde kant vanuit de richting van CA3.
  7. Stabiliseer het segment in de opnamekamer met een paperclip (figuur 3A) of een in de handel verkrijgbaar hersenschijfraster.
    OPMERKING: Het kan handig zijn om de perfusie uit te schakelen tijdens het overbrengen en positioneren van plakjes. Dit mag echter niet te lang duren om de kwaliteit van de hersenschijf te garanderen.
  8. Verlaag en plaats de opname- en stimulatie-elektroden in het MPP in het onderste derde deel van de moleculaire laag dicht bij de korrelcellaag(figuur 3B),tegenover elkaar op een afstand van ongeveer 100-150 μm. De stimulatie-elektrode moet minimaal contact maken met het oppervlak, terwijl de opname-elektrode de bovenste plaklaag enigszins moet infiltreren.
  9. Breng een stimulus met een lage intensiteit (30-50 μA gedurende 0,1 ms) aan op de hersenschijf om het fEPSP-signaal te verkrijgen. Pas indien nodig de positie van de elektroden aan (bijv. laag of atypisch gevormd fEPSP-signaal).
  10. Begin met het opnemen van Input-Output curven: breng toenemende stimulusintensiteiten toe op het hersensegment in intervallen van 30 s.
  11. Stel de stimulusintensiteit in op 50% van de maximale fEPSP-respons en start baseline fEPSP-opnames waarbij de 50% stimulus-intensiteit gedurende 20-40 minuten in intervallen van 30 s op het hersensegment wordt toegepast.
  12. Als de basislijn stabiel lijkt te zijn, gaat u verder met aanvullende opnamen (bijv. LTP/LTD-protocollen en/of geneesmiddeltoepassingen). (Voor LTP-inductie in het MPP werd hier een protocol gebruikt dat bestond uit vier keer 1 s 100 Hz pulsen die in een interval van 5 min werden toegepast. Bicuculline werd 10 minuten voor en tijdens de conditioneringsfase aangebracht.)
    OPMERKING: Alle opnamen moeten worden uitgevoerd in de huidige klemmodus met de juiste low-pass filtering (<5 kHz) en sampling rates (>10 kHz).
  13. Pak de gegevens uit in een geschikte bestandsindeling en analyseer fEPSP-parameters, zoals fiber volley, fEPSP amplitude en fEPSP-helling.

7. Calcium beeldvorming opnames van hersenen plakjes

  1. Breng een hersenschijf halfrond over in een 12-put kamer en laad deze gedurende 30 minuten tot 1 uur met een geschikte calciumkleurstof. Carbogeneer continu de laadoplossing door een carbogenatiebuis door een zelfgemaakt gat (met een hete 18G-naald) in het deksel van de 12-putplaat te steken.
    OPMERKING: Deze stap is niet nodig in het geval van hersenschijfpreparaten van genetisch gemodificeerde dieren die endogeen een fluorescerende verslaggever zoals GCaMP uitdrukken.
  2. Bereid de opname-instelling voor zoals beschreven in stap 6.2–6.5.
    OPMERKING: Er zijn geen versterkers of micromanipulator nodig voor microfluorimetrische beeldvormingsexperimenten. Het gebruik van een stimulator is experimentafhankelijk. Specifieke software voor fluorescentie-beeldvormingsexperimenten is essentieel.
  3. Pas de software aan de juiste beeldinstellingen aan: dit omvat cameraversterker en binning-instelling, instelling van de golflengte, belichtingstijd en timingprotocol. De instellingen kunnen variëren afhankelijk van de exacte experimenten. (Voor de voorbeeldsporen werd 1 x 1 binning, 2,4x voorversterkerwinst, 300 EM-camerawinst, belichting van 50 ms bij 488 nm herhaald om de 500 ms gedurende de duur van het experiment gebruikt.)
  4. Breng na het laden met de calciumkleurstof de hersenschijfhelft over van de 12-put naar de opnamekamer en plaats deze op het microscoopstadium.
  5. Stabiliseer het segment in de opnamekamer met een paperclip (figuur 3A) of een in de handel verkrijgbaar hersenschijfraster vergelijkbaar met het in stap 6.7 beschreven.
  6. Zorg ervoor dat het interessegebied zich in het juiste microscopische veld en in focus bevindt.
  7. Gebruik de fluorescentiebeeldvormingssoftware om verschillende interessegebieden (ROC's) op uw segment te selecteren.
    OPMERKING: Het kan handig zijn om het hele gezichtsveld te selecteren om de algemene helderheidsschommelingen te volgen als gevolg van fotobleaching.
  8. Start de opname en breng de experimentele testgeneesmiddelen aan op de gekozen tijdstipen.
    OPMERKING: Het is raadzaam om aan het einde van elk experiment een hoge K+ -oplossing toe te passen om het neuronale karakter van de cellen en de segmentkwaliteit te verifiëren.
  9. Pak de gegevens uit in een geschikte bestandsindeling en analyseer de fluorescentiesignaalveranderingen die gedurende de hele meting in de ROC's optreden. ROI's kunnen ook worden aangepast tijdens de off-line analyse.
    OPMERKING: Andere protocollen die fEPSP-opnamen en calciummicrofluorimetrie in hersensegmenten beschrijven , zijn beschikbaar in literatuur24,32,33,34,35.

Resultaten

Algemeen overzicht van tools en kritieke stappen die nodig zijn voor het protocol
Figuur 2 bevat alle benodigde hulpmiddelen en kritieke stappen voor de voorbereiding van horizontale acute hippocampale hersensegmenten zoals beschreven in dit protocol. Over het algemeen zijn een beperkt aantal belangrijke instrumenten vereist, waaronder een paar dissectiegereedschappen en een plakterugwinningskamer (figuur 2A),een laboratoriumwaterbad en een vibratome (figuur 2B). Figuur 2C–E visualiseert belangrijke stappen en oriëntaties van de hersenen en hemisferen tijdens het slice preparation protocol. Figuur 2F is een illustratie van een verwacht resultaat van horizontale hersensegmenten.

fEPSP-opnamen in het mediale perforantpad
Na de herstelperiode kunnen de hersenplakken worden gebruikt voor elektrofysiologische opnames van fEPSP's. Hier gebruikten we een rechtopstaande microscoop uitgerust met een meerkanaals zwaartekrachtgestuurd perfusiesysteem(figuur 3A en figuur 3B). Een glazen micropipette (~ 2 MΩ) werd gevuld met ACSF-oplossing en bevestigd bovenop een met chloride gecoate zilveren elektrode die is gemonteerd op een operationele versterker in circuit met een gechloreerde badelektrode. fEPSP's werden opgenomen en gevisualiseerd met een versterker en geschikte opnamesoftware door de glazen micropipette in het MPP van de hippocampus in de bovenste laag van de hersenschijf te plaatsen. fEPSP's werden geïnduceerd door stimulatie met een 2-contact cluster microelectrode, waarbij verschillende stroomintensiteiten werden toegepast op het MPP stroomopwaarts van de opnameelektrode. Merk op dat dit protocol niet bedoeld is om uit te leggen hoe U MPP-opnamen verkrijgen, maar gebruikt eenvoudig opnames in het MPP als voorbeeld om het succes van het hier beschreven segmentvoorbereidingsprotocol aan te tonen. Als iemand MPP-opnamen probeert uit te voeren, kunnen bepaalde besturingselementen (bijv. gekoppelde pulsopnamen) nodig zijn om de juiste opnamelocatie te garanderen en het MPP te onderscheiden van de LPP8,36,37.

Figuur 3C illustreert een negatief (linkerpaneel, segment van lage kwaliteit) en positief (rechterpaneel, segment van hoge kwaliteit) voorbeeld van een fEPSP-opname. Het negatieve voorbeeldspoor toont een grote vezelvolleybal (FV) amplitude die zelfs hoger is dan de werkelijke fEPSP-amplitude (≈0,5 mV). Het voorbeeld van een segment van hoge kwaliteit (rechterpaneel) toont daarentegen een kleine FV-fEPSP-verhouding en een hoge fEPSP-amplitude (>0,5 mV). De vezelvolleybal is het signaal dat optreedt bij depolarisatie van de gestimuleerde neuronale vezels en gaat daarom vooraf aan de postsynaptische potentiëring (fEPSP). De relatie van FV met fEPSP-eigenschappen biedt belangrijke informatie over het behoud van de axonale en synaptische eigenschappen. Plakjes van hoge kwaliteit met intacte zenuwvezels moeten een hoge fEPSP-amplitude/FV-verhouding vertonen. Integendeel, segmenten van lage kwaliteit met verminderde geleidingseigenschappen hebben een verminderde fEPSP-fV-verhouding. Evenzo kan de levensvatbaarheid van een hersensegment worden geanalyseerd door fEPSP-hellingen te plotten versus de vezelvolleybalitudes (figuur 3D).

Bovendien worden input-outputcurven (fEPSP-helling en FV-amplitude ten opzichte van stimulusintensiteit) standaard gebruikt om de segmentkwaliteit te bepalen. Dergelijke curven worden verkregen door toenemende stroomprikkels toe te passen op het hersensegment en door de daaropvolgende fEPSP-reacties te monitoren. Hersensegmenten van lage kwaliteit vertonen een verminderde input-outputcurve als gevolg van suboptimale geleidingseigenschappen van slecht bewaard hersenweefsel (figuur 3E,F). Bovendien zijn input-outputcurven nodig om het ideale stimulatie-intensiteitsbereik voor het onderzoek van synaptische processen te definiëren. Idealiter moet de stimulusintensiteit worden ingesteld rond 50% van de intensiteit voor maximale reacties. Bij deze gekozen stimulusintensiteit zijn de fEPSP-reacties zeer gevoelig voor veranderingen in synaptische plasticiteit, wat de mogelijkheid biedt om zowel langdurige potentiëring (LTP) als langdurige depressie (LTD) te onderzoeken.

Om de synaptische plasticiteit te bestuderen, wordt de synaptische overdracht van het hersensegment (fEPSP-helling) bij de gekozen 50% stimulusintensiteit gedurende een langere periode (meestal tussen 20-40 minuten) vóór de conditioneringsfase gecontroleerd. Levensvatbare hersensegmenten hebben stabiele basislijnen, terwijl hersensegmenten met een onstabiele basislijn niet kunnen worden gebruikt voor verdere conditioneringsprotocollen om synaptische plasticiteit van de hersencircuits te bestuderen(figuur 3G,bovenste paneel). fEPSP baseline opnames kunnen ook nuttig zijn om de effecten van geneesmiddelen op synaptische transmissie zelf te monitoren(figuur 3G,onderste paneel). Het gemiddelde van de geregistreerde fEPSP-basislijnsignalen wordt meestal gebruikt om een fEPSP-tijdcursus te normaliseren en is standaard ingesteld op 100%.

Synaptische plasticiteit kan worden bestudeerd door specifieke conditioneringsprotocollen toe te passen op de hersensegmenten. Deze protocollen zijn afhankelijk van het onderzochte hersencircuit en het mechanisme van belang (bijv. LTP of LTD). Om LTP in het MPP van de dentate gyrus op te wekken, is een sterk conditioneringsprotocol nodig vanwege de sterke GABAergetische remming die aanwezig is bij de MPP-synapsen38. Er wordt gemeld dat de GABAerge remming nog meer uitgesproken is in hersenschijfjes bereid met hoog-sacharose snijoplossingen39. Hier gebruiken we een protocol bestaande uit vier stimulaties van 1 s lange 100 Hz pulsen toegepast in een interval van 5 minuten tijdens de behandeling met de GABAA receptor antagonist Bicuculline(figuur 3H). De co-toevoeging van NMDA en Bicuculline tijdens de conditioneringsperiode resulteert in een verhoogde LTP (figuur 3H). Lage kwaliteit van de slice en onstabiele synaptische transmissie (fEPSP baseline) kunnen leiden tot gewijzigde of mislukte LTP en LTD inductie. Daarom is het van groot belang om te werken met hoogwaardige segmentpreparaten en gebruik te maken van strenge uitsluitingscriteria (lage fEPSP-amplitude tot vezelvolleybalverhouding (<3), kleine fEPSP-helling (<0,5 mV/ms) of amplitude (<0,5 mV) en onstabiele fEPSP-basislijn (verandering van meer dan 5%) voor niet-benijdenswaardige segmenten bij het onderzoeken van synaptische processen.

Calciummicrofluorimetrische metingen in de korrelcellaag van de dentaat gyrus
Na herstel werd een hersenschijfje geïncubeerd bij kamertemperatuur met 2 μM van een calciumgevoelige kleurstof gedurende 1 uur in gecarbogeneerde ASCF, afgeschermd van licht. De plak werd overgebracht naar een opnamekamer (figuur 3A) op een rechtopstaande fluorescentiemicroscoop uitgerust met een multichannel zwaartekrachtgestuurd perfusiesysteem. Fluorescentie-emissiebeelden werden om de 500 milliseconden verkregen na verlichting bij 488 nm (figuur 4A,B). Excitatie werd gedaan met een Xenon-lamp en een op scanner gemonteerde diffractieroostermonochromator en beeldverwerving werd uitgevoerd met een computergestuurde CCD-camera. Tijdens de metingen werd de plak behandeld met de NMDA-receptorantagonist APV, wat resulteerde in een afname van de intracellulaire calciumconcentratie. Stimulatie van de plak met een extracellulaire oplossing met een hoge kaliumconcentratie (50 mM) resulteerde in een massale instroom van extracellulair calcium als gevolg van de depolarisatie van de neuronen en het openen van spanningsgedekte ionenkanalen (figuur 4C).

SamengesteldeConcentratie (mM)Molecuulgewicht (g/mol)Bedrag (g)
Kcl2574.551.86
CaCl2 * 2H2O20147.012.94
MgSO4 * 7H2O10246.482.46
KH2POST4 12.5136.081.7

Tabel 1: 10 x plak vooroplossing (1 L).

SamengesteldeConcentratie (mM)Molecuulgewicht (g/mol)Bedrag (g)
Nacl12558.447.3
Kcl2.574.550.19
CaCl2 * 2H2O2vanaf 1 M CaCl2 oplossing2 ml
MgSO4 * 7H2O1vanaf 1 M MgSO4-oplossing1 ml
NaH2PO4 * 2U2O1.25156.020.2
NaHCO 2684.012.18
Glucose * H2O25198.174.95

Tabel 2: 1x ACSF (1 L) (osmolariteit tussen 305–315 mOsm).

SamengesteldeConcentratie (mM)Molecuulgewicht (g/mol)Bedrag (g)
10x plakje voorsolutionN/aN/a25 ml
Sacharose252342.321.57
NaHCO 2684.010.55
Glucose * H2O10198.170.49

Tabel 3: 1x hoog-sacharose plakoplossing (250 ml) (osmolariteit tussen 320-325 mOsm).

figure-results-1
Figuur 2: Gedetailleerde informatie over de bereiding van horizontale hippocampale hersenschijfjes. (A) Afbeelding van gereedschappen die nodig zijn voor de dissectie en het snijden van de knaagdierhersenen: a) ±2 cm lang en ±0,5 cm brede riemen filterpapier (bijv. klasse 413); b) blad; c) superlijm; d) pipetpunt; e) monsterplaat (wordt geleverd met vibratome); f) kweekschaal van 35 mm; g) fijne borstel; h) spatel; i) gebogen tang; j) dissectieschaar; k) sterke schaar (bladlengte boven 10 cm); l) kunststof Pasteur pipet met brede opening (tussen 0,6 en 0,8 cm in diameter); m) terugwinningskamer (zelf gemaakt met 250 ml bekerglas, plastic ring, nylon gaas, stuk van een serologische pipet van 10 ml); n) kweekschaal van 90 mm gevuld met ijs en o) vierkant filterpapier bovenop de gekoelde kweekschaal. (B) Afbeelding van een vibratome met a) houder van een met ijs gevulde plakkamer; b) snijkamer; c) carbogenlijn en d) het snijden van scheermesjes. (C) Cartoon ter illustratie van de oriëntatie van de snede van de rugzijde van één halfrond om de hersenen voor te bereiden op horizontaal snijden (zie stap 3.9). (D) Isometrische projectie van de hersenoriëntatie op de monsterplaat van de vibratome. (E) Cartoon die een bovenaanzicht illustreert van de positie van de twee hemisferen op de monsterplaat. (F) Cartoon toont de positie van de hippocampus in een horizontaal hersensegment. De dentate gyrus (DG) en Cornu Ammonis (CA)–Subiculum (SB) gebieden van de hippocampus zijn geïndiceerd. (G) Afbeelding van een herstelkamer met carbogenated ACSF met tien vers gesneden horizontale hersenschijfjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 3: Elektrofysiologische opnames van hippocampale hersenplakken. (A) Afbeelding van een opnamekamer met perfusie en zuiging, gebruikt onder een rechtopstaande microscoop. Een hersenschijf wordt in de kamer geplaatst en geïmmobiliseerd met een stuk van een paperclip voor het begin van de opnames. (B) Helder veldbeeld van een hippocampale hersenschijf onder een rechtopstaande microscoop (10x objectief). Het dentaat gyrus (DG) en CA3-gebied worden aangegeven, evenals de stimulatie (linksonder) en opname (rechtsonder) elektroden, gericht op het mediale perforantpad tijdens fEPSP-opnamen. (C) Links: weergave van een segment van lage kwaliteit voorbeeld van een fEPSP-opname met een robuuste vezelvolleybal en een kleine amplitude. Rechts: segmentvoorbeeld van hoge kwaliteit van een fEPSP-opname. De grijze lijn geeft het basislijnniveau aan. De stippellijnen wijzen op de afgesneden amplitude van 0,5 mV. (D) Plot van de fEPSP helling versus de FV amplitude voor hoge kwaliteit (zwart; n= 10) en lage kwaliteit hersensegmenten (grijs; n = 4). Gegevens weergegeven als gemiddelde ± SEM. (E) Input-Output plot (fEPSP-helling) voor verschillende stimulatie-intensiteiten (μA) voor segmenten van hoge kwaliteit (zwart; n = 10) en segmenten van lage kwaliteit (grijs; n = 4)). (F) Hetzelfde als in (E) maar voor de FV amplitudes versus de stimulusintensiteiten. (G) Tijdsloop van drie verschillende baseline fEPSP-opnamen (helling van fEPSP in %; genormaliseerd tot de gemiddelde fEPSP-helling van de eerste 5 minuten). Het bovenste paneel vertegenwoordigt een positief (zwart) en negatief (rood) voorbeeld, waarbij het laatste een onstabiele basislijn heeft als gevolg van het weglaten van carbogen tijdens de opname. Het onderste paneel toont twee stabiele basisopnamen bij behandeling (na 20 minuten stabiele uitgangswaarde werden AMPA-receptoren geblokkeerd door toepassing van de AMPA-receptorantagonist DNQX (10 μM)) (blauw) en onbehandelde toestand (zwart). (H) Tijdsduur van LTP-opnames voor verschillende behandelingsomstandigheden (aangegeven in het onderste paneel). Zwarte kleur voor toepassing van Bicuculline (20 μM) tijdens conditionering en blauw voor gelijktijdige toepassing van Bicuculline (20 μM) en NMDA (10 μM) tijdens conditionering. Pijlen in het bovenste paneel geven de tijdspunten aan waar hoogfrequente stimulatie is toegepast (4 x 1s van 100Hz). Staafgrafiek in lager paneel vertegenwoordigt de gemiddelde fEPSP-hellingen (%) gedurende 50-60 minuten na LTP-inductie van de experimenten in het bovenpaneel (enkele representatieve opname voor elke aandoening). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 4: Calcium-microfluorimetrie van hippocampale hersensegmenten. (A en B) Fluorescentiebeeld (opgewekt bij 488 nm) (A) en bijbehorende hittekaart (B) van een horizontaal hippocampaal hersensegment van de muishersenen. De dentaat gyrus (DG), CA3-regio en een voorbeeld van een interessegebied (ROI) worden aangegeven in deel A. (C) Tijdsverloop van calciumresponsen (F488 nm) van een ROI in de dentate gyrus van een acuut hippocampaal hersensegment tijdens de behandeling met de NMDA-receptorantagonist APV (50 μM) en oplossing met hoog extracellulair kalium (K+) (50 mM). Het spoor wordt genormaliseerd tot de hoogste calciumrespons tijdens een hoge K+ perfusie en is baseline gecorrigeerd voor fotobleaching. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Hoewel vaak gebruikt onder de neurowetenschappen gemeenschap, hersenen slice preparaten worden ook geconfronteerd met verschillende nadelen. Invoer- en uitvoerverbindingen met de interessegebieden van de hersenen zijn bijvoorbeeld niet langer verbonden in een hersensegment. Bovendien begint het weefsel, eenmaal geïsoleerd, langzaam af te smelten in de loop van de tijd en dit proces kan de fysiologische omstandigheden van het hersensegment veranderen. Dit onderwerp in het bijzonder is zeer zorgwekkend omdat de meeste opnames van hersensegmenten enkele minuten tot uren duren, wat resulteert in lange experimentele dagen met opnames uitgevoerd op weefsel dat tot 6-8 uur voor het begin van het experiment werd geïsoleerd. Bovendien worden de cerebrospinale vloeistof en bloedcirculatie onderbroken tijdens plakjepreparaten, wat kan leiden tot het ontbreken van belangrijke endogene verbindingen in een hersenschijf. En het meest duidelijk is dat de snijprocedure zelf mechanische weefselschade kan veroorzaken die de verkregen resultaten in gevaar kan brengen. De werkelijke voordelen van hersenschijfpreparaten wegen echter nog steeds op tegen hun nadelen, daarom presenteren ze een zeer gewaardeerde en gebruikte techniek in neurowetenschappelijk onderzoek.

Acute hippocampale hersensegmenten vormen een krachtige en daarom veel gebruikte techniek om neuronale processen te onderzoeken van moleculair niveau tot complexe hersencircuitstudies. Dit is gebaseerd op de ideale neuroanatomie van de hippocampus die gemakkelijk kan worden bewaard in een plakbereiding18. Bijgevolg worden hippocampale hersensegmenten gebruikt in een breed scala aan wetenschappelijke onderzoeksprojecten, waaronder geneesmiddelenscreenings17, studies naar neuronale en synaptische eigenschappen die betrokken zijn bij cognitieve functies40,41, en onderzoeken naar pathologische hersenaandoeningen14,42,43. Een breed spectrum van verschillende toepassingen veroorzaakt echter ook een breed scala aan beschikbare segmentvoorbereidingsprotocollen die kunnen verschillen in verschillende parameters, zoals dissectieomstandigheden en snijvlakoriëntatie, onder andere. Daarom moet de exacte onderzoeksvraag van een wetenschappelijk project worden bepaald om een geschikt plakvoorbereidingsprotocol te kiezen.

De tissue chopper presenteert een van de oudste gebruikte technieken om hippocampale hersenschijfjes44, 45te bereiden. De belangrijkste voordelen van deze bereidingsmethode zijn de lage kosten van de chopper en het snelle en gemakkelijke gebruik46. Weefselhakselaars veroorzaken echter mechanische stress die resulteert in morfologische veranderingen en celdood47. Ter vergelijking: de vibratome is een vrij dure machine en de tijd voor de bereiding van de plakjes wordt aanzienlijk verhoogd, wat van invloed kan zijn op de kwaliteit van de plak. De vibratome biedt echter meestal een zachtere manier om de plakjes van het weefsel te scheiden en maakt het mogelijk om de hersenen mooi gekoeld en zuurstofrijk te houden gedurende de hele isolatieprocedure, waardoor de plakeigenschappen worden verbeterd46. Daarom maken verschillende groepen standaard gebruik van deze techniek en hebben ze protocollen voorgesteld voor de voorbereiding van acute hippocampale hersensegmenten met behulp van de vibratome16,30,48. Hoewel sommige protocollen slechts een paar details bieden voor het snijden zelf, maar zich eerder richten op een specifieke toepassing van een dergelijke segmentvoorbereiding48, bieden andere gedetailleerde segmentprotocollen die verschillen in snijvlak of andere protocoldetails (bijv. agarose-inbeddings - of slice/recovery-oplossingen) die in dit artikel27,30worden gegeven .

Het hier beschreven protocol presenteert een eenvoudige methode om acute horizontale hippocampale muishersenenschijfjes van hoge kwaliteit van jonge dieren te bereiden. Het protocol is bijzonder nuttig om het perforantpad (mediaal en lateraal) te behouden dat het hippocampale invoerpad presenteert, dat projecteert van de entorhinale cortex naar de hippocampus8,49,50. Sagittale, coronale, evenals geïsoleerde hippocampus transversale plakpreparaten behouden het perforantpad niet goed, dat voornamelijk afkomstig is uit lagen II en V van de entorhinale cortex en projecten naar verschillende gebieden binnen de hippocampus18. Vanwege de anatomische positionering van de entorhinale cortex ten opzichte van de hippocampus zijn horizontale hersensegmenten een noodzaak om volledig intacte perforante padvezels binnen de plakvoorbereiding te behouden31. Bovendien behoudt horizontaal snijden idealiter de bemoste vezels die projecteren van de dentate gyrus naar de CA3-neuronen in de hippocampus9,30,50. Daarom is deze bereidingsmethode van grote waarde voor studies die hippocampale inputtrajecten en DG-gerelateerde processen onderzoeken. Bovendien maakt dit protocol het onderzoek van het Schaffer collateral pathway50mogelijk . Sagittale en coronale brain slice preparaten worden echter vaker gebruikt bij het onderzoeken van CA3 tot CA1 vezelprojecties, vermoedelijk vanwege hun iets snellere bereidingstijd die de kans op het verkrijgen van plakjes van hoge kwaliteit kan vergroten. Niettemin vormen horizontale hippocampale segmentpreparaten een krachtig onderzoeksinstrument, omdat het het behoud en onderzoek van alle hippocampale vezelroutes binnen één segment halfrond mogelijk maakt. Dit kan met name nuttig zijn wanneer circuitreacties worden bestudeerd, bijvoorbeeld in multi-elektrodetestopnamen.

Een grote zorg bij het bereiden van hersenschijfjes is het goed bewaren van het hersenweefsel. Dit wordt bereikt door verschillende kritieke stappen in ons protocol, waaronder een snelle dissectie, de continue en voldoende oxygenatie en koeling van het weefsel en de bescherming van het hersenweefsel door gebruik te maken van de beschermende snijmethode met een natriumarme, hoogsucrose snijoplossing39,51. Ondanks het feit dat het hier beschreven protocol een slagingspercentage van ongeveer 90% oplevert, kunnen mogelijk aanvullende beschermende stappen nodig zijn bij het werken met weefsel afkomstig van oudere of genetisch diverse dieren of bij het proberen een specifieke celpopulatie te behouden. Verschillende methoden werden al gemeld om gevoelige hersenweefselpreparaten te beschermen. Deze methoden omvatten het gebruik van op NMDG gebaseerde snijoplossingen om de natriumpermeatie52te verminderen , het gebruik van hoge magnesiumgehalten in de snijoplossing om NMDA-receptoractiviteit53te blokkeren , en het langdurige gebruik van beschermende oplossingen ook tijdens de herstelperiode23. Al deze maatregelen zullen resulteren in een verminderde excitotoxiciteit. Bovendien wordt vaak een transcardiale perfusie met ijskoude beschermende ACSF-oplossingen gebruikt en noodzakelijk bij het werken met oudere dieren27.

Acute hippocampale hersenplakken zijn bij uitstek geschikt en worden veel gebruikt voor elektrofysiologisch onderzoek om redenen zoals de hoge amplitudesignalen die kunnen worden verkregen uit een relatief dikke (300-500 μm) acute hersenschijf, die een hoge signaal-ruisverhouding11garandeert. Standaard gebruikte elektrofysiologische toepassingen omvatten extracellulaire veldopnamen en intracellulaire hele celopnamen in een spannings- of stroomklemmodus. Om elektrofysiologische gegevens van hoge kwaliteit te verkrijgen, is de gezondheid van de segmenten van primair belang en kan worden gegarandeerd door het gepresenteerde protocol strikt te volgen. Aangezien plakpreparaten echter een zeer gevoelige techniek vormen, moet een kwaliteitscontrole routinematig worden opgenomen vóór het begin van elk experiment. Verschillende parameters kunnen worden gebruikt als kwaliteitscontrole van het segment en worden standaard beoordeeld via input-outputcurven en baseline fEPSP - of EPSC-opnamen19. Niettemin moet worden opgemerkt dat suboptimale elektrofysiologische eigenschappen kunnen voortvloeien uit experimentele fouten zoals elektrodepositionering, oriëntatie of zelfs schade en niet alleen de gezondheid van de bereide plak vertegenwoordigen. Daarom is het raadzaam om aanvullende kwaliteitscontroles uit te voeren, zoals eenvoudige visualisatie en beoordeling van de cellen onder een 40x-doelstelling of een DAPI-kernkleuring. Dergelijke kwaliteitscontroles kunnen worden gebruikt om de constante segmentstatus tijdens verschillende segmentvoorbereidingssessies te bevestigen.

Calciummicrofluorimetrie presenteert een minder vaak gebruikte techniek om hippocampale hersensegmenten te bestuderen. Deze techniek is echter van toegevoegde waarde voor de standaard extracellulaire en intracellulaire elektrode-opnamen, omdat het intracellulaire calciumfluxen kan visualiseren en kwantificeren, die van groot belang zijn bij neuronale en synaptische signalering. Veranderingen in intracellulaire calciumconcentraties zijn betrokken bij de afgifte van neurotransmitterblaasjes, postynaptische potentiële generatie, regulering van synaptische plasticiteit en axonale zenuwgeleiding54,55,56. Ter illustratie van deze techniek(figuur 4)hebben we gebruik gemaakt van een in de handel verkrijgbare calciumkleurstof. Ontegenzeggelijk kan de behandeling van weefselplakken met calciumkleurstoffen problemen opleveren, zoals een verhoogd experimenteel tijdsbestek en inefficiënte belasting van lager gelegen neuronale cellen. Variaties op deze techniek kunnen echter worden gebruikt om deze technische uitdagingen te omzeilen. Het is bijvoorbeeld mogelijk om calciummetingen en patchklemopnames in hippocampale plakjes te combineren. Op deze manier kan een calcium-fluorescerende kleurstof via de patchpipet in een specifieke cel worden geladen, waardoor de metingen van de calciumdynamiek in één specifieke cel van belangzijn 57. Als alternatief kunnen genetisch gemanipuleerde dieren die de calciumindicator uitdrukken, GCaMP58, hetzij in de hele hersenen, hetzij aangedreven door een celspecifieke promotor, worden gebruikt. Interessant is dat hersenweefsel van GCaMP-dieren met een directe linker naar een eiwit van belang mogelijkheden kan bieden om het neuronale expressiepatroon te bepalen of de betrokkenheid bij calciumvonken en golven te onderzoeken.

Al met al bieden we de richtlijnen voor de succesvolle voorbereiding van gezonde en levensvatbare horizontale hippocampale hersenplakken van muizen voor elektrofysiologische en beeldvormingsopnames. Deze methodologie is zeer nuttig om toegang te krijgen tot neurologische veranderingen die optreden in hersenpathologieën die worden beschreven in de dentaat gyrus.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We danken de afdeling Elektrofysiologie van het VIB-KU Leuven Centrum voor Hersen- en Ziekteonderzoek onder begeleiding van Dr. Keimpe Wierda en Prof. Dr. Joris De Wit voor het gebruik van hun onderzoeksfaciliteiten. Verder bedanken we alle leden van het Laboratorium voor Ionenkanaalonderzoek en het Laboratorium voor Endometrium, Endometriose en Reproductieve Geneeskunde van de KU Leuven voor hun nuttige discussies en opmerkingen.

Dit project heeft financiering ontvangen van de Onderzoeksstichting-Vlaanderen (G.084515N en G.0B1819N aan J.V.) en de Onderzoeksraad van de KU Leuven (C1-funding C14/18/106 aan J.V.). K.P. is een FWO [PEGASUS]2 Marie Skłodowska-Curie Fellow en ontving financiering van het Horizon 2020 onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie in het kader van de Marie Skłodowska-Curie subsidieovereenkomst (665501) met de Onderzoeksstichting Vlaanderen (FWO) (12T0317N). K.H. is postdoctoraal fellow van de Onderzoeksstichting Vlaanderen, België (12U7918N).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anesthesia chamberhome made - GenericN/Aplexiglas
Anesthesia vaporizerDräger & MSS International LtdIsoflurane Vapor 19.3 & MSS Isofluraneom isofluraang te verdampen voor anesthesie bij knaagdieren
Barrels for the perfusion systemTERUMOHypodermic syringes without needlehttps://www.terumotmp.com/products/hypodermics/terumo-hypodermic-syringes-without-needle.html
Bicuculline methiodidehellobioHB0893https://www.hellobio.com/bicuculline-methiodide.html
Borosilcate glass capillariesScience ProductsGB150F-8Phttps://science-products.com/en/shop/micropipette-fabrication-1/capillary-glass-for-micropipette-pullers/borosilicate-glass-capillaries/borosilicate-filament-polished
Calcium chlorid dihydrateMerck102382https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Calcium-chloride-dihydrate,MDA_CHEM-102382?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Calcium Imaging softwareTill PhotonicsLiveAcquisition v2.3.0.18
Carbogen tankAir LiquideAlphagaz mix B50Gasmixture CO2/O2: 5/95, purity 5
Cluster microelectrodeFHCCE2C55https://www.fh-co.com/product/cluster-microelectrodes/
Culture dish (35 mm)Corning Life Sciences353001https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2c/US/en/Cell-Culture/Cell-Culture-Vessels/Dishes%2C-Culture/Falcon®-Cell-Culture-Dishes/p/353001
Culture dish (90 mm)Thermo Fisher Scientific101VR20https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/101R20#/101R20
Curved forcepsFine Science tools11270-20https://www.finescience.de/de-DE/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-7b-Forceps/11270-20
D-AP5hellobioHB0225https://www.hellobio.com/dap5.html
D-(+)-Glucose monohydrateSigma Aldrich16301https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/16301?lang=en®ion=BE
Digital CMOS cameraHAMAMATSUORCA-spark C11440-36Uhttps://www.hamamatsu.com/eu/en/product/type/C11440-36U/index.html
Dissection scissorsFine Science tools14058-09https://www.finescience.de/de-DE/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-ToughCut®/14058-09
DNQXhellobioHB0262https://www.hellobio.com/dnqx-disodium-salt.html
EMCCD cameraAndoriXon TM + DU-897E-CSO-#BVhttps://andor.oxinst.com/products/ixon-emccd-cameras?gclid=CjwKCAjw97P5BRBQEiwAGflV6ULsKjXfhN2YZxtvsWAmF4QghyXZKuqYHVMa6KU9JyS80ATQkSKeBBoCIM0QAvD_BwE
EPC10 USB Double Patch Clamp AmplifierHEKA Elektronik895278https://www.heka.com/sales/brochures_down/bro_epc10usb.pdf
Filter paperVWR516-0818grade 413
Fine brushRaphael Kaerell8204Size #1
18G needleHenke Sass Wolf Fine-Ject18G X 1 1/2" 4710012040https://www.henkesasswolf.de/cms/de/veterinaer_produkte/produkte_vet/einmalkanuelen/hsw_henke_ject_einmalkanuelen/
IsofluraneDechra Veterinary ProductsIso-Vet 1000mg/g250 ml fles
Loctite 406Henkel Adhesive technologiesLoctite 406Superlijm
Magnesium sulfate heptahydrateMerck105886https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Magnesium-sulfate-heptahydrate,MDA_CHEM-105886?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
MicromanipulatorLuigs & NeumannSM-10 with SM-7 remote control systemhttps://www.luigs-neumann.org
Microscope (for calcium imaging)OlympusBX51WIhttps://www.olympus-lifescience.com/de/microscopes/upright/bx61wi/
Microscope (for ephys recordings)ZeissAxio Examiner.A1https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/axio+examiner-axio+examiner.a1-aufrechte+mikroskope/10185/
Microscope light sourceCAIRN Researchdual OptoLed power supplyhttps://www.cairn-research.co.uk/product/optoled/
MonochromatorTill PhotonicsPolychrome V
N-Methyl-D-aspartic acid (NMDA)Sigma AldrichM3262https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m3262?lang=en®ion=BE
Oregon Green® 488 BAPTA-1Invitrogen Molecular Probes#0680710x50ug
OsmometerWescor5500 vapor pressure osmometerom osmolariteit van zout oplossingen te verifiëren
Peristaltic pumpThermo Fisher ScientificMasterflex C/L 77120-62https://www.fishersci.be/shop/products/masterflex-peristaltic-c-l-dual-channel-pump-2/p-8004229
pH meterWTWinoLab series pH 720https://www.geminibv.nl/wp-content/uploads/manuals/wtw-720-ph-meter/wtw-inolab-ph-720-manual-eng.pdf
Pipette pullerSutter InstrumentP-1000https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-1000.html
Potassium chloridChem-labCL00.11

Referenties

  1. Scoville, W. B., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 20 (1), 11-21 (1957).
  2. Cavarsan, C. F., Malheiros, J., Hamani, C., Najm, I., Covolan, L. Is mossy fiber sprouting a potential therapeutic target for epilepsy. Frontiers in Neurology. 9, 1023(2018).
  3. Nadler, J. V. The recurrent mossy fiber pathway of the epileptic brain. Neurochemical Research. 28 (11), 1649-1658 (2003).
  4. Raimondo, J. V., et al. Methodological standards for in vitro models of epilepsy and epileptic seizures. A TASK1-WG4 report of the AES/ILAE translational task force of the ILAE. Epilepsia. 58, Suppl 4 40-52 (2017).
  5. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. , 86-98 (2015).
  6. Tohno, Y., et al. Relationships among the hippocampus, dentate gyrus, mammillary body, fornix, and anterior commissure from a viewpoint of elements. Biological Trace Element Research. 140 (1), 35-52 (2011).
  7. Maclean, P. D. The limbic system and its hippocampal formation; studies in animals and their possible application to man. Journal of Neurosurgery. 11 (1), 29-44 (1954).
  8. Petersen, R. P., et al. Electrophysiological identification of medial and lateral perforant path inputs to the dentate gyrus. Neuroscience. 252, 154-168 (2013).
  9. Amaral, D. G., Scharfman, H. E., Lavenex, P. The dentate gyrus: fundamental neuroanatomical organization (dentate gyrus for dummies). Progress in Brain Research. 163, 3-22 (2007).
  10. Szirmai, I., Buzsaki, G., Kamondi, A. 120 years of hippocampal schaffer collaterals. Hippocampus. 22 (7), 1508-1516 (2012).
  11. Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current Neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
  12. Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. Journal of Visualized Experiments. (49), e2330(2011).
  13. Papouin, T., Haydon, P. G. Obtaining Acute Brain Slices. Bio-protocol. 8 (2), 2699(2018).
  14. Li, Q., Han, X., Wang, J. Organotypic hippocampal slices as models for stroke and traumatic brain injury. Molecular Neurobiology. 53 (6), 4226-4237 (2016).
  15. Lo, D. C., McAllister, A. K., Katz, L. C. Neuronal transfection in brain slices using particle-mediated gene transfer. Neuron. 13 (6), 1263-1268 (1994).
  16. Lein, P. J., Barnhart, C. D., Pessah, I. N. Acute hippocampal slice preparation and hippocampal slice cultures. Methods in Molecular Biology. 758, Clifton, N.J. 115-134 (2011).
  17. Magalhaes, D. M., et al. Ex vivo model of epilepsy in organotypic slices-a new tool for drug screening. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 203(2018).
  18. Bliss, T. The hippocampus book. Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., O'Keefe, J. , Oxford University Press. Ch. 3 37-114 (2007).
  19. Bortolotto, Z. A., Amici, M., Anderson, W. W., Isaac, J. T. R., Collingridge, G. L. Synaptic plasticity in the hippocampal slice preparation. Current Protocols in Neuroscience. 54 (1), 11-26 (2011).
  20. Al-Osta, I., et al. Imaging calcium in hippocampal presynaptic terminals with a ratiometric calcium sensor in a novel transgenic mouse. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 209(2018).
  21. McLeod, F., Marzo, A., Podpolny, M., Galli, S., Salinas, P. Evaluation of synapse density in hippocampal rodent brain slices. Journal of Visualized Experiments. (128), e56153(2017).
  22. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024(2016).
  23. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, Clifton, N.J. 221-242 (2014).
  24. Weng, W., Li, D., Peng, C., Behnisch, T. Recording synaptic plasticity in acute hippocampal slices maintained in a small-volume recycling-, perfusion-, and submersion-type chamber system. Journal of Visualized Experiments. (131), e55936(2018).
  25. Zhou, Q., Abe, H., Nowak, T. S. Immunocytochemical and in situ hybridization approaches to the optimization of brain slice preparations. Journal of Neuroscience Methods. 59 (1), 85-92 (1995).
  26. Koike-Tani, M., Tominaga, T., Oldenbourg, R., Tani, T. Birefringence changes of dendrites in mouse hippocampal slices revealed with polarizing microscopy. Biophysical Journal. 110 (10), 2366-2384 (2020).
  27. Ting, J. T., et al. Preparation of acute brain slices using an optimized N-Methyl-D-glucamine protective recovery method. Journal of Visualized Experiments. (132), e53825(2018).
  28. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
  29. Hua, Y., Keep, R. F., Hoff, J. T., Xi, G. Brain injury after intracerebral hemorrhage: the role of thrombin and iron. Stroke. 38, 2 Suppl 759-762 (2007).
  30. Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1 (4), 2075-2081 (2006).
  31. Paxinos, G., Franklin, K. The Mouse Brain In Stereotaxic Coordinates. 3 edn. , Academic Press. 256(2008).
  32. Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Preparation of acute subventricular zone slices for calcium imaging. Journal of Visualized Experiments. (67), e4071(2012).
  33. Schauer, C., Leinders-Zufall, T. Imaging calcium responses in GFP-tagged neurons of hypothalamic mouse brain slices. Journal of Visualized Experiments. (66), e4213(2012).
  34. Tetteh, H., Lee, J., Lee, J., Kim, J. G., Yang, S. Investigating Long-term Synaptic Plasticity in Interlamellar Hippocampus CA1 by Electrophysiological Field Recording. Journal of Visualized Experiments. (150), e59879(2019).
  35. Smith, C. J., et al. Investigations on alterations of hippocampal circuit function following mild traumatic brain injury. Journal of Visualized Experiments. (69), e4411(2012).
  36. McNaughton, B. L. Evidence for two physiologically distinct perforant pathways to the fascia dentata. Brain Research. 199 (1), 1-19 (1980).
  37. Colino, A., Malenka, R. C. Mechanisms underlying induction of long-term potentiation in rat medial and lateral perforant paths in vitro. Journal of Neurophysiology. 69 (4), 1150-1159 (1993).
  38. Coulter, D. A., Carlson, G. C. Functional regulation of the dentate gyrus by GABA-mediated inhibition. Progress in Brain Research. 163, 235-243 (2007).
  39. Kuenzi, F. M., Fitzjohn, S. M., Morton, R. A., Collingridge, G. L., Seabrook, G. R. Reduced long-term potentiation in hippocampal slices prepared using sucrose-based artificial cerebrospinal fluid. Journal of Neuroscience Methods. 100 (1-2), 117-122 (2000).
  40. Connor, S. A., et al. Loss of synapse repressor MDGA1 enhances perisomatic inhibition, confers resistance to network excitation, and impairs cognitive function. Cell Reports. 21 (13), 3637-3645 (2017).
  41. Lisman, J., et al. Viewpoints: how the hippocampus contributes to memory, navigation and cognition. Nature Neuroscience. 20 (11), 1434-1447 (2017).
  42. Moodley, K. K., Chan, D. The hippocampus in neurodegenerative disease. Frontiers of Neurology and Neuroscience. 34, 95-108 (2014).
  43. Kong, H., et al. Inhibition of miR-181a-5p reduces astrocyte and microglia activation and oxidative stress by activating SIRT1 in immature rats with epilepsy. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. , (2020).
  44. Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35 (2), 589-593 (1971).
  45. Schwartzkroin, P. A. Characteristics of CA1 neurons recorded intracellularly in the hippocampal in vitro slice preparation. Brain Research. 85 (3), 423-436 (1975).
  46. Wang, T., Kass, I. S. Preparation of brain slices. Methods in Molecular Biology. 72, Clifton, N.J. 1-14 (1997).
  47. Garthwaite, J., Woodhams, P. L., Collins, M. J., Balazs, R. On the preparation of brain slices: morphology and cyclic nucleotides. Brain Research. 173 (2), 373-377 (1979).
  48. Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51706(2014).
  49. Aydin-Abidin, S., Abidin, İ 7,8-Dihydroxyflavone potentiates ongoing epileptiform activity in mice brain slices. Neuroscience Letters. 703, 25-31 (2019).
  50. Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. A comparison of different slicing planes in preservation of major hippocampal pathway fibers in the mouse. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 107(2017).
  51. Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices. Synapse. 3 (4), 331-338 (1989).
  52. Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 118-125 (2008).
  53. Reid, K. H., Edmonds, H. L., Schurr, A., Tseng, M. T., West, C. A. Pitfalls in the use of brain slices. Progress in Neurobiology. 31 (1), 1-18 (1988).
  54. Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Neuronal calcium signaling: function and dysfunction. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 71 (15), 2787-2814 (2014).
  55. Gleichmann, M., Mattson, M. P. Neuronal calcium homeostasis and dysregulation. Antioxidants & Redox Signaling. 14 (7), 1261-1273 (2011).
  56. Padamsey, Z., Foster, W. J., Emptage, N. J. Intracellular Ca(2+) release and synaptic plasticity: a tale of many stores. The Neuroscientist: A Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry. 25 (3), 208-226 (2019).
  57. Chen-Engerer, H. J., et al. Two types of functionally distinct Ca2+ stores in hippocampal neurons. Nature Communications. 10 (1), 3223(2019).
  58. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).

Herprints en machtigingen

Tags

Vibratoomsnijden van de hersenendissectie van de muizenhersenenbereiding van ACSF-oplossingsucrose-rijke slice-oplossingelektrofysiologische opnamesveld-excitatoir postsynaptisch potentiaalinput/output-curvenbeeldvorming met calciumindicatorenanalyse van synaptische transmissie
Horizontale Hippocampal Plakjes van de Hersenen van de Muis
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.