Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Productie van IgG Fusion Proteins transiently uitgedrukt in Nicotiana benthamiana

7.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61774

⸱

16 januari 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Immunotherapy, Vaccines and Virotherapy, The Biodesign Institute, Arizona State University, 2School of Life Sciences, Arizona State University, 3Molecular Biosciences/Biotechnology Undergraduate Program, Arizona State University, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan Medical School

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven hier een eenvoudige methode voor expressie, extractie en zuivering van recombinant menselijke IgG versmolten tot GFP in Nicotiana benthamiana. Dit protocol kan worden uitgebreid tot zuivering en visualisatie van tal van eiwitten die kolomchromatografie gebruiken. Bovendien is het protocol aanpasbaar aan het persoonlijke en virtuele college onderwijs laboratorium, het verstrekken van project-based exploratie.

Samenvatting

De grote vraag naar antilichamen als therapeutische interventies voor verschillende infectieuze, metabole, auto-immuun-, neoplastische en andere ziekten creëert een groeiende behoefte aan het ontwikkelen van efficiënte methoden voor recombinante antilichaamproductie. Vanaf 2019 waren er meer dan 70 door de FDA goedgekeurde monoklonale antilichamen en is er een exponentieel groeipotentieel. Ondanks hun belofte, beperkende factoren voor wijdverbreid gebruik zijn productiekosten en complexiteit. Mogelijk bieden fabrieken goedkope, veilige en gemakkelijk schaalbare eiwitproductiestrategieën. Planten zoals Nicotiana benthamiana kunnen niet alleen complexe zoogdiereiwitten correct vouwen en assembleren, maar kunnen ook kritische post-translationele wijzigingen toevoegen die vergelijkbaar zijn met die van celculturen van zoogdieren. In dit werk, met behulp van native GFP en een zuur-stabiele variant van groene fluorescerende eiwitten (GFP) versmolten met menselijke monoklonale antilichamen, waren we in staat om de gehele voorbijgaande antilichaam expressie en zuivering proces van N. benthamiana planten visualiseren. Afhankelijk van het doel van het experiment kan native GFP-fusie zorgen voor een eenvoudigere visualisatie tijdens de expressiefase in de planten, terwijl zuur-stabiele GFP-fusie visualisatie mogelijk maakt tijdens downstreamverwerking. Deze schaalbare en eenvoudige procedure kan worden uitgevoerd door een enkele onderzoeker om milligram hoeveelheden zeer zuivere antilichaam of antilichaam fusie eiwitten te produceren in een kwestie van dagen met behulp van slechts een paar kleine planten. Een dergelijke techniek kan worden uitgebreid tot de visualisatie van elk type antilichaam zuiveringsproces en mogelijk vele andere eiwitten, zowel in plantaardige als andere expressiesystemen. Bovendien kunnen deze technieken profiteren van virtuele instructies en worden uitgevoerd in een academisch laboratorium door undergraduate studenten met minimale eerdere ervaring met moleculaire biologie technieken, het verstrekken van een basis voor project-based exploratie met real-world toepassingen.

Inleiding

Industrie rapporten geven aan dat dertien van de twintig meest brutowinst drugs in de Verenigde Staten waren biologische (eiwit-gebaseerde geneesmiddelen), waarvan negen waren antilichamen. Vanaf 2019 waren er meer dan 570 antilichaam (Ab) therapieën in verschillende klinische ontwikkelingsfasen1,2,3. De huidige wereldwijde ab-omzet bedraagt meer dan 100 miljard USD en de monoklonale ab (mAb) therapeutische markt zal naar verwachting tot 300 miljard USD genereren in 20251,4. Met zo'n hoge vraag en verwachte stijgingen van de inkomsten, onderzoekers hebben gewerkt aan manieren om Ab therapeutics te produceren op een steeds grotere schaal, met een hogere kwaliteit en lagere kosten te ontwikkelen. Plantaardige expressiesystemen hebben verschillende voordelen ten opzichte van traditionele zoogdiercellijnen voor de betaalbare en grootschalige productie van Ab therapeutics5,6. Voor de productie van eiwittherapeutisch in planten ("moleculair pharming") zijn geen dure bioreactoren of celkweekfaciliteiten nodig, net als traditionele zoogdiercelkweektechnieken7,8. Planten kunnen geen menselijke ziekteverwekkers oplopen, waardoor potentiële besmetting tot een minimalisering wordtgeminimaliseerd 9. Zowel voorbijgaande als transgene plantaardige eiwitexpressie kan worden gebruikt als goedkopere alternatieven voor zoogdier- of bacteriële productiesystemen10. Hoewel transgene planten de voorkeur hebben voor de productie van gewassen, kan recombinante eiwitproductie met behulp van deze methode weken tot maanden duren. Vooruitgang in tijdelijke expressie met behulp van virale vectoren door middel van spuit of vacuüm agroinfiltratie zorgen voor een kleine en grootschalige productie, respectievelijk, van het gewenste eiwit in de dagen11,12,13,14. De productie van mAbs tegen ebola, Dengue en Zika, en tal van andere recombinante eiwitten, zijn snel en efficiënt geproduceerd en gezuiverd met behulp van tijdelijke expressie in N. benthamiana planten15,16,17,18,19. Deze omstandigheden maken tijdelijke plantaardige expressie een aantrekkelijke optie voor het ontwikkelen van meerdere Ab therapeutica en de methoden die in dit protocol20 wordenaangetoond .

MAb's van de eerste generatie waren van murineafscheiding, wat resulteerde in niet-specifieke immunogeniciteit bij gebruik in menselijke proeven21. Na verloop van tijd, chimeric, gehumaniseerd, en uiteindelijk, volledig menselijke Abs werden geproduceerd om immunogeniciteit veroorzaakt door Ab therapeutica te verminderen. Helaas veroorzaken sommige van deze Abs nog steeds gastheer immunogeniciteit als gevolg van verschillen in glycosylation21. Ontwikkelingen in de installatietechniek hebben gezorgd voor de wijziging van Ab glycans, wat essentieel is omdat de stabiliteit en functie van een Ab aanzienlijk kunnen worden beïnvloed door zijn glycosylation staat22. De vooruitgang heeft de productie in plantaardige systemen van hoog-niveauuitdrukking van gehumaniseerde mAbs mogelijk gemaakt, die menselijke glycanen en resulterend de gewenste biologische eigenschappen van een massa-geproduceerde menselijk farmaceutisch19,21bevatten .

Naast recombinant Abs, Ab fusie moleculen (Ab fusies) zijn onderzocht voor verschillende doeleinden in de afgelopen decennia. Ab fusies bestaan vaak uit een Ab of Ab fragment gefuseerd tot een molecuul of eiwit en zijn ontworpen om reacties uit te lokken van immuun effector cellen23. Deze moleculen zijn gemaakt als potentiële therapeutische interventies voor de behandeling van verschillende pathologieën zoals kanker en auto-immuunziekten24,25,26,27. Recombinant immune complexs (RICs) zijn een andere klasse van Ab fusies die zijn gebruikt als vaccin kandidaten28. RICs maken gebruik van het vermogen van het immuunsysteem om de Fc-regio's van Ab-fusies te herkennen en blijken de immunogeniciteit te verbeteren in combinatie met andere vaccinplatforms29,30,31.

Green Fluorescent Protein (GFP) is een bioluminescent eiwit afkomstig van de kwal Aequorea Victoria, die groen licht uitzendt wanneer opgewonden door ultraviolet licht32,33. In de loop der jaren is het gebruik van GFP als visuele marker van genexpressie uitgebreid van expressie in Escherichia coli tot tal van eiwitexpressiesystemen, waaronder N. benthamiana-planten 34,35,36,37,38. Zichtbare markers, zoals GFP, hebben overvloedige implicaties in het onderwijzen en leren van wetenschappelijke concepten. Tal van instapstudenten beschrijven moeilijkheden bij het begrijpen van wetenschappelijke concepten wanneer het idee dat wordt onderwezen niet met het blote oog zichtbaar is, zoals de concepten van moleculaire biologie en aanverwante gebieden39. Visuele markers, zoals GFP, kunnen zo bijdragen aan de verwerking van informatie met betrekking tot de wetenschappelijke processen en kunnen helpen de moeilijkheden te verminderen die studenten rapporteren bij het leren van tal van wetenschappelijke concepten.

Hoewel GFP vaak wordt gebruikt als een marker om gen en expressie in vivoaan te geven, is het moeilijk om het te visualiseren in de downstream processen bij het gebruik van zure omstandigheden. Deze omstandigheid is voornamelijk omdat GFP zijn structuur en resulterende fluorescentie niet behoudt bij een lage pH40. Tijdelijke zure omgevingen zijn vaak nodig in verschillende zuiveringsprocessen, zoals eiwit G, eiwit A, en eiwit L chromatografie, vaak gebruikt voor Ab zuivering41,42,43,44. GFP-mutanten zijn gebruikt om fluorescentie onder zure omstandigheden45,46te behouden .

Hierin beschrijven we een eenvoudige methode voor expressie, extractie en zuivering van recombinante IgG fusie-eiwitten in N. benthamiana planten. We produceerden traditionele GFP gefuseerd naar de N-terminus van een gehumaniseerde IgG zware keten, het creëren van een GFP-IgG fusie. Tegelijkertijd ontwikkelden we de fusie van een plant codon-geoptimaliseerde sequentie voor een zuur-stabiele GFP (asGFP) naar de N-terminus van een gehumaniseerde IgG zware keten, het creëren van een asGFP-IgG fusie. De voordelen van het produceren van GFP-IgG omvatten de mogelijkheid om de aanwezigheid van een doeleiwit tijdens expressie te visualiseren, terwijl asGFP-IgG het mogelijk maakt om de aanwezigheid van recombinant eiwit te zien in niet alleen de expressie- en extractiestappen, maar ook in de zuiveringsstappen van het eiwit. Dit protocol kan worden aangepast voor de productie, zuivering en visualisatie van een reeks GFP-fusie-eiwitten geproduceerd in N. benthamiana en gezuiverd met behulp van chromatografietechnieken die een lage pH vereisen. Het proces kan ook worden afgestemd op verschillende hoeveelheden bladmateriaal. Terwijl Abs en fusie-eiwitten gelabeld met GFP of asGFP zijn niet bedoeld om te worden gebruikt voor therapieën, deze methoden kunnen nuttig zijn als controles tijdens experimenten en kan ook verder worden gebruikt als een leermiddel voor moleculaire en cellulaire biologie en biotechnologie, zowel in-persoon en vrijwel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Cultiveren N. benthamiana planten

  1. Plaats grond turf pellets op een lade en giet eerder gekookt, nog warm (~ 40-45 °C), water over de turf pellets voor volledige expansie. Na pellets zijn volledig uitgebreid, plaats 2-3 N. benthamiana zaden op elke turf pellet met behulp van pincet.
  2. Giet ongeveer 0,5 in water om de bodem van de lade te bedekken. Label de lade met de opzaaidatum. Ga door met het water van de zaailingen dagelijks met de juiste hoeveelheden kunstmest. Meststof (water-oplosbare all-purpose plant food) concentratie is over het algemeen 2,5-2,8 g/L.
  3. Bedek de lade met een humidome top wanneer geplaatst in de groeikamer. Houd de ingezaaide turfkorrels in de groeikamer op 23-25 °C, met een fotoperiode van 16 uur en een relatieve luchtvochtigheid van 60%.
  4. Na een week, verwijder extra planten verlaten elke pellet met slechts een zaailing.
  5. Wanneer de planten 2-3 weken oud zijn, breng elke turfpellet over naar een individuele pot met vochtbeheersingsgrond. Deze demonstratie gebruikte Miracle-Gro vochtcontrole potgrond.
  6. Water dagelijks met 1 g/L meststof. Laat de grond nooit helemaal droog. Planten zijn klaar voor infiltratie wanneer ze 5-6 weken oud zijn.

2. Voorbereiding van agrobacterium tumefaciens voor infiltratie

OPMERKING: GFP-IgG fusieconstructies kunnen worden verkregen zoals beschreven in dit artikel31. Het asGFP-gen werd verkregen en plant-geoptimaliseerd uit deze studie45. De volgende stappen moeten worden uitgevoerd naast een Bunsen-brander, en basisaseptische technieken moeten worden toegepast om besmetting te voorkomen.

  1. Streep A. tumefaciens EHA105 herbergen bonen gele dwerg virus (BeYDV)19 plant expressie vector voor elke constructie (asGFP-IgG, GFP-IgG, lichtketting) uit een glycerolvoorraad op LB agar (10 g/L Tryptone, 10 g/L NaCl, 5 g gistextract, 15 g/L agar, 50 μg/mL kanamycine) plaat.
  2. Kweek één dag in een 30 °C staande couveuse. Isoleer een enkele kolonie voor verificatie door standaard kolonie scherm PCR protocol.
  3. Gebruik geverifieerde kolonie voor elke constructie. Vul conische buis met 10 mL LB-media (10 g/L tryptone, 10 g/L NaCl, 5 g gistextract, 50 μg/mL). Voeg vervolgens 10 μL van 100 μg/mL kanamycine toe. Voeg 10 μL 2,5 μg/mL rifampicin toe om E. coli besmetting te voorkomen. Incubeer bij 30°C en 120-150 tpm 's nachts.
  4. De volgende dag, als de Agrobacterium cultuur wordt gegroeid tot OD600 = 0,6-0,9, kan het worden gebruikt voor infiltratie. Als het is overwoekerd (OD600 > 1), moet 1-2 mL worden overgebracht naar verse LB met antibiotica en worden geteeld tot de vereiste OD600. Afhankelijk van de concentratie van de oorspronkelijke cultuur kan het mogelijk twee dagen duren om te groeien tot OD600 = 0,6-0,9.
  5. Eenmaal op de juiste OD600, plaats de culturen in een centrifuge, en pellet de bacteriën door centrifugatie op 4.500 x g gedurende 20 min, kamertemperatuur (RT).
  6. Decanteer supernatant van beide monsters, en vervolgens resuspend elke pellet in 1x infiltratie buffer (10 mM 2-(N-morpholino) ethanesulfonic zuur, 10 mM magnesiumsulfaat, aangepast aan pH 5.5 met KOH) om de definitieve OD600 = 0,4. Dit moet ongeveer 15-45 mL infiltratie buffer, afhankelijk van de oorspronkelijke cultuurdichtheid. Combineer gelijke volumes van elke IgG fusion construct met de lichtkettingconstructie om de uiteindelijke OD600 = 0,2 per constructie in elke buis te krijgen.

3. Naaldloze spuit agroinfiltratie

  1. Neem een rechtgetrokken paperclip en 5-6-weken oude N. benthamiana planten vanaf stap 1. Maak met behulp van de scherpe rand van de paperclip een kleine punctie in de eerste opperhuidlaag van het blad op het adaxiale oppervlak. Vermijd puncturing het helemaal door.
    LET OP: De onderste bladeren zijn gemakkelijker voor infiltratie, terwijl de bladeren aan de bovenkant van de plant zijn harder. Over het algemeen is de expressie van recombinante eiwitten het hoogst in de bladeren in het midden van een plant, en deze bladeren worden ook minder necrotisch.
  2. Vul een spuit van 1 mL, zonder naald, met de voorbereide Agrobacterium-oplossing vanaf stap 2. Bedek het gat gemaakt in de vorige stap met het einde van de spuit en langzaam duwen om de bacteriën te injecteren in het blad, terwijl het toepassen van zachte tegendruk van achter het blad. Let op het blad donkerder als de oplossing wordt geïnjecteerd zonder het toepassen van te veel druk op de spuit.
  3. Probeer het grootste deel van het blad gebied te infiltreren op een maximum van 3-4 keer – overmatige bladschade kan belemmeren eiwitopbrengst. Het geïnfiltreerde plantenblad zal meestal donker lijken vanuit het onderste zicht.
    OPMERKING: Deze bacteriële oplossing moet voldoende zijn voor ten minste 3-4 planten per constructie. Autoclave eventuele resterende bacteriële oplossing voor het weggooien.

4. Groeien en observeren van de geïnfiltreerde N. benthamiana

  1. Plaats geïnfiltreerde planten terug in de groeikamer en blijf dagelijks water geven.
  2. Observeer de bladeren voor chlorose en necrose in geïnfiltreerde gebieden. Observeer planten voor GFP fluorescentie (als GFP aanwezig is) onder een lange en korte golf UV-lamp.
  3. Dag 4-5 toont de hoogste fluorescentie van beide GFP constructies in de bladeren. Oogst alle bladeren op 4-5 dpi (dagen na infiltratie) en weeg het totale bladmateriaal.
  4. Gebruik het onmiddellijk voor downstream verwerking of opslaan op -80 °C tot klaar voor gebruik.

5. Eiwitextractie

  1. Houd buffers en blender cups op ijs of op 4 °C voor gebruik.
  2. Bereid 2-3 mL ijskoude extractiebuffer (100 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 8 met HCl) per 1 g plantaardig materiaal. Voeg vlak voor de extractiebuffer 2 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) uit voorraad (100 mM) en 50 mM natriumascorbaat toe aan de extractiebuffer.
  3. Plaats plantaardig weefsel van stap 4 in de gepekwicht blender cup. Voeg een gemeten hoeveelheid gekoelde extractiebuffer toe aan de blenderbeker (zoals aangegeven in stap 5.2). Leg de blenderbeker op de blender. Neem een voorgesneden vel parafilm en strek het over de bovenkant van de blender cup. Meng tot homogeniteit met intervallen van 20 seconden, goed roeren tussen de mengcycli als dat nodig is.
  4. Breng gemengd materiaal over naar een beker. Voeg een roerstaaf toe en roer 30 minuten door 4 °C om de oplosbaarheid van eiwitten te verbeteren en neerslag van vaste stoffen mogelijk te maken.
  5. Plaats 2 lagen Miracloth over een schone beker op ijs en giet het extract erdoorheen om grote bladresten te verwijderen. Nadat al het extract is gegoten, vouw de Miracloth om het restblad extract te knijpen. Het extract moet donkergroen lijken zonder zichtbare deeltjes.
  6. Breng 50 μL van dit monster over naar een nieuwe buis van 1,5 mL en label "totaal extract" voor latere analyse. Breng het extract over in centrifugebuizen. Centrifugeren de rest van het plantenextract op 16.000 x g gedurende 20 min, 4 °C en breng het supernatant over op een conische buis.
  7. Filter het oplosbare extract met een spuitfilter van 50 mL en spuitglasvezelfilter (0,75 μm).
  8. Verzamel 50 μL van een monster na centrifugatie, label "oplosbaar extract" voor latere analyse.

6. Eiwit G kolom chromatografie procedure

OPMERKING: Het protocol hier beschreven is voor zwaartekracht-flow chromatografie met behulp van Pierce Protein G agarose hars. Als u een andere hars gebruikt, raadpleegt u de instructies van de fabrikant voor aanpassingen. Laat de hars nooit droog lopen en voorkom dat alle vloeistof uitmondt. Recapituleren de uitlaat als dat nodig is.

  1. Stel een polypropyleenkolom in met een monster van 20 mL.
  2. Schat de hoeveelheid drijfmest die nodig is, afhankelijk van het doelimmunlinetype en de affiniteit met de hars. Over het algemeen is 3 mL van totale drijfmest met 1,5 mL bedvolume voldoende voor de zuivering van meerdere milligram Ab.
  3. Giet voorzichtig de vereiste hoeveelheid opgesuspend drijfmest in de afgetopte kolom. Open de kolomuitlaat vanaf de onderkant van de kolom en laat deze leeglopen totdat het grootste deel van de buffer is verdwenen.
  4. Giet onmiddellijk 10 mL wasbuffer 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 met HCl) bovenop. Laat het uitlekken en herhaal deze wasstap 2x.
  5. Pas het gefilterde monster van stap 5 op de kolom toe en verzamel de doorstroom, 50 μL stroomdoor voor latere analyses. Sla de rest van de flowthrough op voor het geval de Ab zich niet aan de hars bindt.
    OPMERKING: Het opnieuw toepassen van de doorstroom naar een nieuwe kolom resulteert meestal niet in een goede opbrengst; daarom wordt geadviseerd om te beginnen met nieuw bladmateriaal.
  6. Was de hars twee maal met 10 mL 1x PBS om niet-specifieke binding te verminderen. Indien gewenst, aliquot 50 μL van wassen als de buffer afvoeren door de kolom om te controleren of het doel Ab niet is geëuterd met een wasbuffer.
  7. Stel vijf buizen op en label ze met 125 μL steriele 1 M Tris-HCl bij pH 8. Dit is om de Abs te neutraliseren in de zure elutie buffer om mogelijke structurele veranderingen te voorkomen. U ook 30 μL van 2 M Tris-basis toevoegen om een minder verdund monster te krijgen.
    LET OP: Tijdens elutie kan UV-licht worden gebruikt voor visualisatie. Dit hoeft niet te worden gedaan voor de duur van de elutie. Als UV wordt gebruikt, moet u de juiste BESCHERMINGsmiddelen dragen om schade aan ogen en huid te voorkomen. Een UV-licht hoeft niet te worden gebruikt tijdens de elutiestap.
  8. Elute de Abs door het toepassen van 5 mL elutie buffer (100 mM glycine, pH 2.5 met HCl) op de kolom en verzamel 1 mL fracties op elke aangewezen buis van de vorige stap.
  9. Regeneratie van de kolom onmiddellijk door 20 mL wasbuffer aan te brengen, gevolgd door 10 mL wasbuffer. Zorg ervoor dat de hars langere tijd niet in een zure omgeving wordt achtergelaten. Elutions moeten fluorescerend lijken, vaak wordt de hoogste fluorescentie gezien in de tweede elutie, maar kan variëren van extractie tot extractie.
  10. Voor opslag, was de hars met 10 mL van 20% ethanol in PBS en laat het halverwege uitlekken. Recapituleren de top, dan de onderkant van de kolom, en rechtop te houden op 4 °C.
    OPMERKING: Over het algemeen kunnen eiwit G-harsen tot 10 keer worden hergebruikt zonder significant verlies van efficiëntie. Raadpleeg de richtlijnen van de fabrikant voor specifieke details.
  11. Bepaal de Ab-concentratie met behulp van een spectrofotometer door absorptie op 280 nm te meten, met behulp van de elutiebuffer als blanco. Bewaar de eluates in -80 °C en aliquot 50 μL van elke fractie op een aparte buis voor verdere analyse.

7. SDS-PAGINA voor GFP-Ig fusiedetectie

  1. Maak alle voorbeelden voor het instellen van de SDS-PAGINA.
    1. Voeg 4 μL monsterbuffer toe (6x verminderende monsterbuffer: 3,0 mL glycerol, 0,93 g DTT, 1 g SDS, 7 mL van 4x Tris (pH 6,8) 0,5 M, 1,2 mg bromofolblauw); (6x niet-reducerende monsterbuffer: 3,0 mL glycerol, 1 g SDS, 7 mL van 4x Tris (pH 6.8) 0,5 M, 1,2 mg bromofenolblauw) tot 20 μL van elk monster (totaal extract, oplosbaar extract, flowthrough, wash, all elutions fractie) voor analyse. Zorg ervoor dat buisdoppen stevig worden vastgemaakt.
    2. Behandel alleen het verminderen van monsters gedurende 5 minuten in een kokend waterbad, en zet vervolgens monsters gedurende 5 minuten op ijs. Spin monsters in een microcentrifuge voor ~ 5 s en laad 20 μL van elk monster in de volgorde van de collectie in de gelputten. Laad 3 μL eiwitladder in een aparte put.
  2. Voer de SDS-PAGE gel uit op een constante 100 V op de gewenste eiwitbandscheiding; het duurt ongeveer 1,5 uur. Controleer de ladder als een indicator van eiwitscheiding.
  3. Visualiseer de gel onder de UV om GFP-fluorescentie te observeren.
  4. Bevlek desgewenst de gel met Coomassie-vlek om het totale eiwit in elk monster te beoordelen. U ook westerse vlekken uitvoeren om doeleiwit te evalueren met behulp van specifieke Abs.
    OPMERKING: Zowel Coomassie kleuring als westelijke vlek kunnen worden uitgevoerd door de standaardprotocollen47,48tevolgen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Deze studie toont een eenvoudige en snelle methode aan om recombinante eiwitten te produceren en te visualiseren in downstream processen. Met behulp van N. benthamiana en volgens het meegeleverde protocol, recombinante eiwitproductie hier beschreven kan worden bereikt in minder dan een week. De algemene workflow van plantenexpressie, extractie en zuivering wordt weergegeven in figuur 1. De stadia van plantengroei van 2 weken oude zaailingen, 4 weken oude planten en 6 weken oude plan...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol kan worden gebruikt voor de visuele verificatie van alle recombinant Ab of recombinant eiwit geproduceerd in N. benthamiana planten, met inbegrip van die vereisen tijdelijke blootstelling aan zure omgevingen voor kolom zuivering doeleinden42,43,44. Bovendien kan de fusie van asGFP naar andere eiwitten in verschillende expressiesystemen een nuttig hulpmiddel zijn voor experimentele visualisatie en onderwijs....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken Maria Pia DiPalma voor het bewerken van de video. We danken ook het Office of Educational Outreach and Student Services aan de Arizona State University voor hun genereuze publicatie vergoeding bijstand. Onderzoek voor dit protocol werd ondersteund door de School of Life Sciences, Arizona State University.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
5 mL spuitelkeN/A
50 mL spuitelkeN/A
AgarSIGMA-ALDRICHA5306
Blender met bekerselkeN/A
BromofenolblauwBio-Rad1610404
DTT (DL-Dithiothreitol)MP BIOMEDICALS219482101
EDTA (Ethyleendiamine)tetraazijnzuurSIGMA-ALDRICHE-6760
EthanolelkeN/A
GlycerolG-BiosciencesBTNM-0037
GlycineSIGMA-ALDRICHG7126-500G
HCl (Zoutzuur)EMD MILLIPORE CORPORATIONHX0603-4
Verwarmingsblokelke gerenommeerde leverancierN/A
Jiffy-7 727 met gat turfpelletsHummert International14237000
KanamycineGold Biotechnology IncK-120-100
KCl (Kaliumchloride)SIGMA-ALDRICHP9541-500G
KH2PO4 (Kaliumfosfaat)J.t.baker3248-05
KOH (Kaliumhydroxide)VWRBDH0262
Magnesiumsulfaat heptahydraatSIGMA-ALDRICHM2773
MES (2-(N-Morpholino)ethaansulfonzuur)SIGMA-ALDRICHM8250
MiraclothMillipore4 75855-1R
Vochtigheidscontrole potmixMiracle-Gro755783
Na2HPO4 (Natriumfosfaat)J.t.baker3827-01
NaCl (Natriumchloride)Santa Cruz Biotechnologysc-203274C
Nicotiana benthamiana zadenelke gerenommeerde leverancierN/A
PMSF (Fenylmethylsulfonylfluoride)G-Biosciences786-787
Polypropyleen kolomelkeN/A
Precision Plus Protein Dual Color StandardsBio-Rad1610394
Proteïne G-harsThermo Fisher Scientific20399
RifampicineGold Biotechnology IncR-120-25
SDS (Natriumdodecylsulfaat)G-BiosciencesDG093
NatriumascorbaatSIGMA-ALDRICHA7631-500G
Spectrofotometerelke gerenommeerde leverancierN/A
Titan3 0,75 µm glasvezelfilterThermoScientific40725-GM
Schaal voor turfpellets met koepelelkeN/A
TRIS-BaseJ.t.baker4109-02
Tris-HClAmrescoM108-1KG
TryptoneSIGMA-ALDRICH17221
UV-lampelkeN/A
Wateroplosbare universele plantenvoedingMiracle-Gro2000992
GistextractSIGMA-ALDRICH9182

Referenties

  1. Lu, R. M., et al. Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases. Journal of Biomedical Science. 27 (1), (2020).
  2. Kaplon, H., Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2019. mAbs. 11 (2), 219-238 (2019).
  3. The top 20 drugs by U.S. sales. FiercePharma. , Available from: https://www.fiercepharma.com/special-report/top-20-drugs-by-2018-u-s-sales (2018).
  4. Grilo, A. L., Mantalaris, A. The Increasingly Human and Profitable Monoclonal Antibody Market. Trends in Biotechnology. 37 (1), 9-16 (2019).
  5. Kim, M. -Y., et al. Novel vaccination approach for dengue infection based on recombinant immune complex universal platform. Vaccine. 33 (15), 1830-1838 (2015).
  6. Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. Transgenic plants in the biopharmaceutical market. Expert Opinion on Emerging Drugs. 10 (1), 185-218 (2005).
  7. Stoger, E., Fischer, R., Moloney, M., Ma, J. K. -C. Plant Molecular Pharming for the Treatment of Chronic and Infectious Diseases. Annual Review of Plant Biology. 65 (1), 743-768 (2014).
  8. Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnology and Bioengineering. 109 (10), 2575-2588 (2012).
  9. Yao, J., Weng, Y., Dickey, A., Wang, K. Y. Plants as factories for human pharmaceuticals: Applications and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28549-28565 (2015).
  10. Mor, T. S., Moon, Y. -S., Palmer, K. E., Mason, H. S. Geminivirus vectors for high-level expression of foreign proteins in plant cells. Biotechnology and Bioengineering. 81 (4), 430-437 (2003).
  11. Hefferon, K. L. Plant virus expression vectors set the stage as production platforms for biopharmaceutical proteins. Virology. 433 (1), 1-6 (2012).
  12. Yamamoto, T., et al. Improvement of the transient expression system for production of recombinant proteins in plants. Scientific Reports. 8 (1), 4755(2018).
  13. Zhong, G. Y., et al. Commercial production of aprotinin in transgenic maize seeds. Molecular Breeding. 5 (4), 345-356 (1999).
  14. Giddings, G., Allison, G., Brooks, D., Carter, A. Transgenic plants as factories for biopharmaceuticals. Nature Biotechnology. 18 (11), 1151-1155 (2000).
  15. Fulton, A., Lai, H., Chen, Q., Zhang, C. Purification of monoclonal antibody against Ebola GP1 protein expressed in Nicotiana benthamiana. Journal of Chromatography A. 1389, 128-132 (2015).
  16. Diamos, A., et al. A highly expressing, soluble, and stable plant-made IgG fusion carrying Zika virus envelope domain III elicits potent immunogenic responses in mice without adjuvant. Frontiers in immunology. 3140 (11), (2020).
  17. Hunter, J. G. L., et al. Evaluation of a toxoid fusion protein vaccine produced in plants to protect poultry against necrotic enteritis. PeerJ. 2019 (3), 6600(2019).
  18. Dent, M., et al. Plant-produced anti-dengue virus monoclonal antibodies exhibit reduced antibody-dependent enhancement of infection activity. Journal of General Virology. 97 (12), 3280-3290 (2016).
  19. Diamos, A. G., et al. High Level Production of Monoclonal Antibodies Using an Optimized Plant Expression System. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 472(2020).
  20. Olinger, G. G., et al. Delayed treatment of Ebola virus infection with plant-derived monoclonal antibodies provides protection in rhesus macaques. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 18030-18035 (2012).
  21. Mastrangeli, R., Palinsky, W., Bierau, H. Glycoengineered antibodies: towards the next-generation of immunotherapeutics. Glycobiology. 29 (3), 199-210 (2019).
  22. Montero-Morales, L., Steinkellner, H. Advanced Plant-Based Glycan Engineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 81(2018).
  23. Joosten, V., Lokman, C., vanden Hondel, C. A. M. J. J., Punt, P. J. The production of antibody fragments and antibody fusion proteins by yeasts and filamentous fungi. Microbial Cell Factories. 2 (1), 1-15 (2003).
  24. Müller, D. Antibody fusions with immunomodulatory proteins for cancer therapy. Pharmacology and Therapeutics. 154, 57-66 (2015).
  25. Bootz, F., Neri, D. Immunocytokines: A novel class of products for the treatment of chronic inflammation and autoimmune conditions. Drug Discovery Today. 21 (1), 180-189 (2016).
  26. Jafari, R., Zolbanin, N. M., Rafatpanah, H., Majidi, J., Kazemi, T. Fc-fusion Proteins in Therapy: An Updated View. Current Medicinal Chemistry. 24 (12), (2017).
  27. Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. mAbs. 9 (2), 182-212 (2017).
  28. Mason, H. S. Recombinant immune complexes as versatile and potent vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 12 (4), 988-989 (2016).
  29. Mason, H. S. Recombinant immune complexes as versatile and potent vaccines. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 12 (4), 988-989 (2016).
  30. Diamos, A. G., et al. Vaccine synergy with virus-like particle and immune complex platforms for delivery of human papillomavirus L2 antigen. Vaccine. 37 (1), 137-144 (2019).
  31. Diamos, A. G., et al. Codelivery of improved immune complex and virus-like particle vaccines containing Zika virus envelope domain III synergistically enhances immunogenicity. Vaccine. 38 (18), 3455-3463 (2020).
  32. Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. 111 (2), 229-233 (1992).
  33. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  34. Palm, M., Baumstark-Khan, C., Horneck, G. Green Fluorescent Protein (GFP) Expression in Mammalian Cells After UV-Irradiation. Fundamentals for the Assessment of Risks from Environmental Radiation. , 311-316 (1999).
  35. Paemeleire, K., et al. Intercellular calcium waves in HeLa cells expressing GFP-labeled connexin 43, 32, or 26. Molecular Biology of the Cell. 11 (5), 1815-1827 (2000).
  36. Harper, B. K., Stewart, C. N. Patterns of Green Fluorescent Protein Expression in Transgenic Plants. Plant Molecular Biology Reporter. 18 (2), 141(2000).
  37. Kaishima, M., Ishii, J., Matsuno, T., Fukuda, N., Kondo, A. Expression of varied GFPs in Saccharomyces cerevisiae: Codon optimization yields stronger than expected expression and fluorescence intensity. Scientific Reports. 6, (2016).
  38. Glow in the Dark: Fluorescent Proteins as Cell and Tissue-Specific Markers in Plants. , Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21772029/ (2020).
  39. Mnguni, L. E. The theoretical cognitive process of visualization for science education. SpringerPlus. 3 (1), 1-9 (2014).
  40. Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120 (24), 4247-4260 (2007).
  41. Bjorck, L., Kronvall, G. Purification and some properties of streptococcal protein G, a novel IgG-Binding reagent. The Journal of Immunology. 133 (2), (1984).
  42. Andrew, S. M., Titus, J. A. Purification of Immunoglobulin G. Current Protocols in Immunology. 21 (1), 1-12 (2001).
  43. Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein A chromatography for antibody purification. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 848 (1), 40-47 (2007).
  44. Vola, R., Lombardi, A., Tarditi, L., Björck, L., Mariani, M. Recombinant proteins L and LG: efficient tools for purification of murine immunoglobulin G fragments. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 668 (2), 209-218 (1995).
  45. Shinoda, H., Ma, Y., Nakashima, R., Sakurai, K., Matsuda, T., Nagai, T. Acid-Tolerant Monomeric GFP from Olindias formosa. Cell Chemical Biology. 25 (3), 330-338 (2018).
  46. Roberts, T. M., et al. Identification and Characterisation of a pH-stable GFP. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  47. Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
  48. Mahmood, T., Western Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  49. Vessoni Penna, T. C., Ishii, M., Cholewa, O., de Souza, L. C. Thermal characteristics of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) extracted from Escherichia coli. Letters in Applied Microbiology. 38 (2), 135-139 (2004).
  50. Kang, S. J., Park, E. A., Lee, D. H., Hong, K. W. Comparison of the stability of eGFP displayed on the Bacillus subtilis spore surface using CotB and C-terminally truncated CotB proteins as an anchoring motif under extreme conditions. Applied Biological Chemistry. 62 (1), 41(2019).
  51. Kuta, D. D., Tripathi, L. Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology. 4 (8), 752-757 (2005).
  52. Qiusheng, Z., Bao, J., Likun, L., Xianhua, X. Effects of antioxidants on the plant regeneration and GUS expressive frequency of peanut (Arachis hypogaea) explants by Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 81 (1), 83-90 (2005).
  53. Diamos, A. G., Rosenthal, S. H., Mason, H. S. H.S. 5' and 3' Untranslated Regions Strongly Enhance Performance of Geminiviral Replicons in Nicotiana benthamiana Leaves. Frontiers in Plant Science. 7, 200(2016).
  54. Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 706-714 (2009).
  55. Diamos, A. G., Mason, H. S. Modifying the Replication of Geminiviral Vectors Reduces Cell Death and Enhances Expression of Biopharmaceutical Proteins in Nicotiana benthamiana Leaves. Frontiers in Plant Science. 9, 1974(2019).
  56. Gordon-Kamm, W., et al. Stimulation of the cell cycle and maize transformation by disruption of the plant retinoblastoma pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11975-11980 (2002).
  57. Villemont, E., Dubois, F., Sangwan, R. S., Vasseur, G., Bourgeois, Y., Sangwan-Norreel, B. S. Role of the host cell cycle in the Agrobacterium-mediated genetic transformation of Petunia: Evidence of an S-phase control mechanism for T-DNA transfer. Planta. 201 (2), 160-172 (1997).
  58. Regnard, G. L., Halley-Stott, R. P., Tanzer, F. L., Hitzeroth, I. I., Rybicki, E. P. High level protein expression in plants through the use of a novel autonomously replicating geminivirus shuttle vector. Plant Biotechnology Journal. 8 (1), 38-46 (2010).
  59. Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants. Human Vaccines. 7 (3), 331-338 (2011).
  60. Morton, T. G., Gold, A. J., Sullivan, W. M. Influence of Overwatering and Fertilization on Nitrogen Losses from Home Lawns. Journal of Environmental Quality. 17 (1), 124-130 (1988).
  61. Brown, J. C. Iron Chlorosis in Plants. Advances in Agronomy. 13, 329-369 (1961).
  62. Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory Maintenance of Agrobacterium. Current Protocols in Microbiology. , CHAPTER, Unit3D.1 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Tijdelijke expressieGFP-fusieproteïnezuiveringkolomchromatografieAgrobacterium-infiltratieextractie van bladweefselcentrifugatieprocesantilichaamkwantificering
Productie van IgG Fusion Proteins transiently uitgedrukt in Nicotiana benthamiana
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.