Methodenartikel

Een driedimensionaal model van sferoïden om stamcellen van darmkanker te bestuderen

DOI:

10.3791/61783

⸱

22 januari 2021

 ,  ,  , 
1Département de la recherche, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, INSERM U1052, CNRS UMR5286, Université de Lyon, Université Lyon 1, Centre Léon Bérard, 2UMR-S1113 - IRFAC INSERM, Université de Strasbourg

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol presenteert een nieuw, robuust en reproduceerbaar kweeksysteem om driedimensionale sferoïden uit Caco2 colon adenocarcinoomcellen te genereren en te laten groeien. De resultaten vormen de eerste proof-of-concept voor de geschiktheid van deze aanpak om kankerstamcelbiologie te bestuderen, inclusief de respons op chemotherapie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Colorectale kankers worden gekenmerkt door heterogeniteit en een hiërarchische organisatie bestaande uit een populatie van kankerstamcellen (CSC's) die verantwoordelijk zijn voor tumorontwikkeling, onderhoud en resistentie tegen geneesmiddelen. Een beter begrip van CSC-eigenschappen voor hun specifieke targeting is daarom een vereiste voor effectieve therapie. Er is echter een tekort aan geschikte preklinische modellen voor diepgaand onderzoek. Hoewel in vitro tweedimensionale (2D) kankercellijnen waardevolle inzichten bieden in tumorbiologie, repliceren ze de fenotypische en genetische tumor heterogeniteit niet. Driedimensionale (3D)-modellen daarentegen pakken bijna-fysiologische kankercomplexiteit en cel heterogeniteit aan en reproduceren deze. Het doel van dit werk was om een robuust en reproduceerbaar 3D-cultuursysteem te ontwerpen om CSC-biologie te bestuderen. De huidige methodologie beschrijft de ontwikkeling en optimalisatie van omstandigheden om 3D-sferoïden, die homogeen van grootte zijn, te genereren uit Caco2 colon adenocarcinoomcellen, een model dat kan worden gebruikt voor langetermijncultuur. Belangrijk is dat binnen de sferoïden de cellen die waren georganiseerd rond lumenachtige structuren, werden gekenmerkt door differentiële celproliferatiepatronen en door de aanwezigheid van CSC's die een paneel van markers uitdrukken. Deze resultaten vormen de eerste proof-of-concept voor de geschiktheid van deze 3D-benadering om cel heterogeniteit en CSC-biologie te bestuderen, inclusief de respons op chemotherapie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Colorectale kanker (CRC) blijft de tweede belangrijkste oorzaak van kanker-geassocieerde sterfgevallen in de wereld1. De ontwikkeling van CRC is het resultaat van een progressieve verwerving en accumulatie van genetische mutaties en/of epigenetische veranderingen2,3, met inbegrip van de activering van oncogenen en inactivatie van tumoronderdrukkergenen3,4. Bovendien kunnen niet-genetische factoren (bv. het micromilieu) bijdragen tot en de oncogene transformatie bevorderen en zo deelnemen aan de ontwikkeling van CRC's5. Belangrijk is dat CRC's bestaan uit verschillende celpopulaties, waaronder ongedifferentieerde CSC's en bulktumorcellen die enkele differentiatiekenmerken vertonen, die een hiërarchische structuur vormen die doet denken aan de organisatie van het epitheel in een normale coloncrypte 6,7.

CSC 's worden geacht verantwoordelijk te zijn voor het verschijnen vantumoren 8, het onderhoud en de groei ervan, de gemetastaseerde capaciteit en de resistentie tegen conventionele therapieën6,7. Binnen tumoren vertonen kankercellen, waaronder CSC's, een hoog niveau van heterogeniteit en complexiteit in termen van hun verschillende mutatie- en epigenetische profielen, morfologische en fenotypische verschillen, genexpressie, metabolisme, proliferatiepercentages en gemetastaseerd potentieel9. Daarom, om kankerbiologie, tumorprogressie en het verwerven van resistentie tegen therapie en de vertaling ervan in effectieve behandelingen beter te begrijpen, zijn menselijke preklinische modellen die deze kanker heterogeniteit en hiërarchie vastleggen belangrijk10,11.

In vitro 2D-kankercellijnen worden al lange tijd gebruikt en bieden waardevolle inzichten in tumorontwikkeling en de mechanismen die ten grondslag liggen aan de werkzaamheid van therapeutische moleculen. Hun beperking met betrekking tot het ontbreken van de fenotypische en genetische heterogeniteit gevonden in de oorspronkelijke tumoren wordt nu echter algemeen erkend12. Bovendien worden nutriënten, zuurstof, pH-gradiënten en het micromilieu van de tumor niet gereproduceerd, waarbij het micromilieu vooral belangrijk is voor het behoud van verschillende celtypen, waaronder CSC's11,12. Om deze belangrijkste nadelen te overwinnen, zijn verschillende 3D-modellen ontwikkeld om de complexiteit en heterogeniteit van kankers experimenteel aan te pakken en te reproduceren. In feite vatten deze modellen tumor cellulaire heterogeniteit, cel-cel interacties en ruimtelijke architectuur samen, vergelijkbaar met die waargenomen in vivo12,13,14. Primaire tumororganoïden die zijn vastgesteld op basis van verse tumoren, evenals van cellijn afgeleide sferoïden, worden grotendeels gebruikt15,16.

Sferoïden kunnen op een steigervrije of steigergebaseerde manier worden gekweekt om de cellen te dwingen zich te vormen en te groeien in celaggregaten. Steigervrije methoden zijn gebaseerd op de cultuur van cellen onder niet-aanhangende omstandigheden (bv. de ophangingsmethode of ultralage bevestigingsplaten), terwijl steigermodellen afhankelijk zijn van natuurlijke, synthetische of hybride biomaterialen voor kweekcellen12,13,14. Op steigers gebaseerde sferoïden hebben verschillende nadelen, omdat de uiteindelijke sferoïdevorming afhankelijk is van de aard en samenstelling van het gebruikte (bio)materiaal. Hoewel de tot nu toe beschikbare steigervrije sferoïdemethoden niet afhankelijk zijn van de aard van het substraat, genereren ze sferoïden die variëren in structuur en grootte17,18.

Dit werk was gericht op het ontwerpen van een robuust en reproduceerbaar 3D-kweeksysteem van sferoïden, die homogeen van grootte zijn, samengesteld uit Caco2 colon adenocarcinoomcellen om CSC-biologie te bestuderen. Caco2-cellen zijn van bijzonder belang vanwege hun vermogen om in de loop van de tijd19,20te differentiëren , wat sterk wijst op een stamachtig potentieel. Dienovereenkomstig onthulde de langetermijncultuur van de sferoïden de aanwezigheid van verschillende CSC-populaties met verschillende reacties op chemotherapie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: De details van alle reagentia en materialen zijn opgenomen in de tabel met materialen.

1. Sferoïde vorming

  1. Sferoïde cultuurmedia
    1. Bereid basaal medium bestaande uit Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 4 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide.
    2. Bereid DMEM compleet medium met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine (Pen/Strep) in basaal medium vanaf stap 1.1.1.
    3. Bereid DMEM/keldermembraanmatrixmedium voor met 2,5% keldermembraanmatrix, 10% FBS en 1% Pen/Strep in basaal medium vanaf stap 1.1.1.
  2. Voorbereiding van platen voor sferoïde vorming
    1. Warm basaal en DMEM/keldermembraanmatrixmedium bij kamertemperatuur (RT) gedurende ongeveer 20 min.
    2. Voorbehandel de putten van een 24-put plaat gewijd aan sferoïde vorming door 500μL anti-therapie spoeloplossing aan elke put toe te voegen.
      OPMERKING: In deze platen bestaat elke put uit 1.200 microwells.
    3. Centrifugeer de plaat op 1.200 × g gedurende 5 minuten in een schommelende emmerrotor met adapters voor platen.
      OPMERKING: Als er slechts één plaat wordt gebruikt, bereid dan een extra standaardplaat gevuld met water voor om het gewicht tegen te gaan.
    4. Spoel elke put af met 2 ml warm basaal medium en aspireer het medium uit de putten.
    5. Let op de plaat onder de microscoop om er zeker van te zijn dat de bellen volledig uit de microwells zijn verwijderd. Als de bellen vastzitten, centrifugeer dan opnieuw op 1.200 × g gedurende 5 minuten om de bellen te verwijderen.
    6. Herhaal de spoelstappen 1.2.4-1.2.5.
    7. Voeg 1 ml warme DMEM / keldermembraanmatrix medium toe aan elke put.
  3. Generatie van sferoïden
    1. Kweek de Caco2-cellen in een 2D-monolaag in DMEM-medium aangevuld met 10% FBS en 1% Pen/Strep bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2 (hierna 37 °C/5% CO2genoemd).
      OPMERKING: Het maximum aantal te gebruiken celpassages is 80.
    2. Wanneer 80% van de samenvloeiing is bereikt, wast u de cellen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) 1x (5 ml voor een schaal van 10 cm), voegt u trypsine-ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) (2 ml voor een schaal van 10 cm) toe en incubeert u gedurende 2-5 minuten bij 37 °C/5% CO2.
    3. Controleer de celloslating onder de microscoop en neutraliseer de trypsine door 4 ml DMEM compleet medium per schaal van 10 cm toe te voegen.
    4. Tel cellen met behulp van een hemocytometer om het totale aantal cellen te bepalen.
    5. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten op 1.200 × g. Gooi het supernatant weg en resuspend de pellet in een geschikt volume DMEM/keldermembraanmatrixmedium.
    6. Raadpleeg tabel 1 om het aantal cellen te bepalen dat per put nodig is om het gewenste aantal cellen per microwell te bereiken. U kunt ook het aantal cellen berekenen met behulp van de volgende formule voor een plaat met 24 putten, aangezien elke put 1.200 microwells bevat
      Vereist aantal cellen per put = Gewenst aantal cellen per microwell × 1.200
    7. Voeg het vereiste volume van de celsuspensie toe aan elke put om het gewenste celnummer te bereiken in een eindvolume van 1 ml.
    8. Voeg 1 ml DMEM/keldermembraanmatrixmedium toe aan elke put om het uiteindelijke volume van 2 ml per put te bereiken (zie ook stap 1.2.7).
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u geen bellen in de microwells brengt.
    9. Centrifugeer de plaat onmiddellijk op 1.200 × g gedurende 5 minuten om de cellen in de microwells op te vangen. Indien nodig, tegenwicht van de centrifuge met een standaardplaat gevuld met water.
    10. Observeer de plaat onder de microscoop om te controleren of de cellen gelijkmatig over de microwells zijn verdeeld.
    11. Incubeer de plaat bij 37 °C/5% CO2 gedurende 48 uur zonder de plaat te verstoren.
      OPMERKING: Volgens het oorspronkelijke protocol21, hoewel veel cellijnen binnen 24 uur sferoïden kunnen vormen, vereisen sommige een langere incubatietijd. In dit protocol is 48 uur voldoende voor sferoïde vorming.
  4. Het oogsten van de sferoïden uit de microwells
    1. Verwarm het basale en DMEM/keldermembraanmatrixmedium bij RT gedurende ongeveer 20 minuten.
    2. Verwijder met behulp van een serologische pipet de helft van het kweekmedium (1 ml) uit elke put.
    3. Voeg het medium terug toe aan het oppervlak van de put om de sferoïden uit de microwells te verdrijven.
      OPMERKING: Raak de sferoïden niet aan of tritureer ze niet.
    4. Plaats een omkeerbare zeef van 37 μm (of een standaardzeef van 40 μm) op de bovenkant van een conische buis van 15 ml om de sferoïden te verzamelen.
      OPMERKING: Als u een standaardzeef van 40 μm gebruikt, plaatst u deze ondersteboven.
    5. Aspireer voorzichtig de losgeraakte sferoïden (vanaf stap 1.4.3) en passeer de sferoïde suspensie door de zeef.
      OPMERKING: De sferoïden blijven op het filter achter; enkele cellen stromen door met het medium.
    6. Doseer met behulp van een serologische pipet 1 ml van het warme basale medium over het hele oppervlak van de put om eventuele resterende sferoïden los te maken en op de zeef te herstellen.
    7. Herhaal deze wasstap 1.4.6 tweemaal.
    8. Let op de plaat onder de microscoop om er zeker van te zijn dat alle sferoïden uit de microwells zijn verwijderd. Herhaal de was indien nodig (stappen 1.4.6-1.4.7).
    9. Keer de zeef om en plaats deze op een nieuwe conische buis van 15 ml. Verzamel de sferoïden door de zeef te wassen met DMEM/keldermembraanmatrixmedium.
      OPMERKING: De verzamelde sferoïden zijn klaar voor downstream toepassingen en analyses.
  5. Langetermijncultuur van sferoïden
    1. Bereid 1,5% agarose-oplossing in basaal medium en steriliseer deze door autoclaaf (standaardcyclus).
    2. Terwijl de agarose-oplossing warm en nog vloeibaar is, bedek de putten van standaard kweekplaten of gerechten, zoals beschreven in tabel 2.
      OPMERKING: Het opwarmen van de schaal/plaat in de oven vergemakkelijkt de coatingstap. Gecoate borden/borden kunnen maximaal 10 dagen bij RT worden bewaard in een steriele omgeving en beschermd tegen het licht.
    3. Zaai de geoogste sferoïden (vanaf stap 1.4.9) in de met agarose bedekte platen en voeg DMEM/keldermembraanmatrixmedium toe om het uiteindelijke volume te bereiken, afhankelijk van de grootte van de plaat.
      OPMERKING: Om sferoïde aggregaten te voorkomen, zaait u ze met de optimale dichtheid van 22 sferoïden/cm2. Merk op dat de coating niet perfect vlak is en naar de rand stijgt, waardoor een lichte concaviteit in het midden van de plaat ontstaat. Als het aantal sferoïden te hoog is, hebben ze meer kans om zich aan elkaar te hechten.
    4. Incubeer de plaat bij 37 °C/5% CO2 tot de sferoïden voor specifieke analyses worden teruggewinningd.
  6. Behandeling van sferoïden met chemotherapeutische geneesmiddelen
    1. Plaat sferoïden uit stap 1.5.4, en kweek ze gedurende 2 dagen. Behandel ze vanaf dag 3 (D3) met FOLFIRI (5-Fluorouracil, 50 μg/ml; Irinotecan, 100 μg/ml; Leucovorine, 25 μg/ml) of met FOLFOX (5-Fluorouracil, 50 μg/ml; Oxaliplatine, 10 μg/ml; Leucovorine, 25 μg/ml) chemotherapeutische regimecombinaties die routinematig worden gebruikt voor de behandeling van CRC-patiënten22,23,24,25, of om ze in (controle)niet-behandelde (NT) toestand te houden.
    2. Verzamel de sferoïden na 3 dagen behandeling met behulp van een pipet met de tip afgesneden (1.000 μL tip), zodat elke aandoening wordt vertegenwoordigd door ten minste drie replica's. Centrifugeer ze op 1000 × g gedurende 3 minuten en verwijder vervolgens het supernatant.
    3. Bevestig de pellets in 2% paraformaldehyde (PFA) voor histologische analyse (zie rubriek 3), of gebruik de pellets voor RNA-extractie (zie rubriek 4).
    4. Om celdood te analyseren, incubeer de sferoïden vanaf stap 1.6.1 in zwarte kweekputplaten in DMEM / keldermembraanmatrixmedium gedurende 30 minuten met een nucleïnezuurvlek (1:5000 verdunning) die geen levende cellen doordringt, maar de aangetaste membranen van dode cellen doordringt26. Meet de accumulatie van fluorescentie met een microplaatlezer.

2. Monitoring van sferoïde groei

  1. Verkrijg met behulp van een omgekeerde microscoop representatieve beelden van sferoïden die gedurende de dagen in cultuur onder verschillende omstandigheden worden bewaard.
  2. Analyseer de beelden door drie verschillende representatieve diameters van elke sferoïde te meten met behulp van de juiste software.
  3. Gebruik de volgende formule om het geschatte bolvolume te verkrijgen.
    figure-protocol-1

    OPMERKING: De termen d1, d2 en d3 zijn de drie diameters van de sferoïde.

3. Immunofluorescentie (IF) en histologische kleuring

  1. Fixatie en paraffine inbedding
    1. Verzamel de sferoïden op geselecteerde tijdstippen met behulp van een pipet met de punt afgesneden zoals beschreven in stap 1.6.2, en bevestig ze gedurende 30 minuten bij RT in 2% PFA.
      OPMERKING: U kunt de monsters ook bij deze stap bij 4 °C bewaren tot verder gebruik.
    2. Voor paraffine-inbedding, was de sferoïden 3x met PBS 1x en resuspend ze in 70% ethanol. Voer na paraffine-inclusie en -doorsnede hematoxyline & eosine (H&E) kleuring uit voor histologische analyse.
  2. Immunolabeling van paraffinesecties
    OPMERKING: Gebruik 5-μm dikke secties voor indirecte immunostaining.
    1. Incubeer dia's bij 60 °C gedurende 2 uur om de was te smelten en de deparaffinisatie te verbeteren.
    2. Was de dia's tweemaal gedurende 3 minuten in methylcyclohexaan.
    3. Was de dia's gedurende 3 minuten in 1:1 methylcyclohexaan:100% ethanol.
    4. Was de dia's twee keer gedurende 3 minuten in 100% ethanol.
      OPMERKING: Voer alle manipulaties uit voor stap 3.2.2 tot stap 3.2.4 in een chemische kap.
    5. Was de dia's 3 min in 90% ethanol.
    6. Was de dia's 3 min in 75% ethanol.
    7. Was de dia's 3 min in 50% ethanol.
    8. Was de glijbanen onder leidingwater.
    9. Rehydrateer de dia's gedurende 5 minuten in gedestilleerd water.
    10. Bereid 700 ml citraatbuffer van 0,01 m, pH 6,0, en voeg deze toe aan een geschikte container (breedte: 11,5 cm, lengte: 17 cm, hoogte: 7 cm); dompel de dia's erin. Verwarm de container in de magnetron gedurende 9-10 minuten op 700 W en wanneer het koken begint, vermindert u het vermogen tot 400-450 W. Incubeer nog eens 10 minuten.
    11. Laat de dia's ongeveer 30-40 minuten afkoelen in de buffer naar RT.
    12. Was de dia's tweemaal in PBS gedurende 5 minuten.
    13. Teken een cirkel rond de secties met een markeerstift om een barrière te creëren voor vloeistoffen die op de secties worden aangebracht.
    14. Incubeer elke sectie met 50 μL blokkerende buffer (10% normaal geitenserum, 1% runderserumalbumine (BSA) en 0,02% Triton X-100 in PBS) gedurende ten minste 30 minuten bij RT.
    15. Verwijder de blokkerende buffer en voeg 50 μL primaire antilichamen toe die zijn verdund in de incubatiebuffer (1% normaal geitenserum, 0,1% BSA en 0,02% Triton X-100 in PBS). Incubeer gedurende 2 uur bij RT of 's nachts bij 4 °C.
    16. Verwijder de primaire antilichamen en was de dia's 3x in PBS gedurende 5 minuten.
    17. Incubeer de dia's met 50 μL fluorescerende secundaire antilichamen verdund in de incubatiebuffer gedurende 1 uur bij RT.
    18. Verwijder de secundaire antilichamen en was de dia's 3x in PBS gedurende 5 minuten.
    19. Voeg 50 μL montagemedium met 4′,6-diamidino-2-fenylindole toe aan elke sectie en plaats een glazen afdeklip over de sectie.

4. RNA-extractie, omgekeerde transcriptie-polymerasekettingreactie (RT-PCR) en kwantitatieve RT-PCR (qRT-PCR)

  1. Verzamel sferoïden op verschillende tijdstippen, elk punt vertegenwoordigd door ten minste drie replica's. Centrifugeer ze op 1000 × g gedurende 3 minuten en verwijder vervolgens het supernatant.
    OPMERKING: Pellets kunnen direct worden gebruikt voor RNA-extractie of worden opgeslagen bij -20 °C tot verder gebruik.
  2. Isoleer het totale RNA met behulp van een commerciële RNA-isolatiekit, volgens de instructies van de fabrikant.
  3. Transcriberen 500 ng van elk RNA-monster in complementair DNA (cDNA) met een commerciële kit volgens de instructies van de fabrikant.
  4. Voer na omgekeerde transcriptie een PCR-analyse uit op 1 μL cDNA om een huishoudelijk gen te versterken met primers in verschillende exons.
    OPMERKING: Deze stap maakt het mogelijk om de afwezigheid van genomische DNA-besmetting in de RNA-preparaten te verifiëren. Voor dit protocol werden peptidylprolyl isomerase B(PPIB) primers gebruikt.
  5. Voer qPCR-versterking uit op 4 μL eerder verdund cDNA (1:10 in RNAsevrij dubbel gedestilleerd water) met primers die specifiek zijn voor de genen van belang. Kwantificeer in elk monster specifieke mRNA-expressie met behulp van de ΔΔCt-methode en waarden die zijn genormaliseerd ten opzichte van een huishoudgenniveau.
    OPMERKING: Voor dit protocol is β-actin (ACTB) geselecteerd. Primers die in dit protocol worden gebruikt, worden vermeld in tabel 3.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aangezien het gebrek aan homogeniteit in de grootte van sferoïden een van de belangrijkste nadelen is van de momenteel beschikbare 3D-sferoïdekweeksystemen13, was het doel van dit werk om een betrouwbaar en reproduceerbaar protocol op te zetten om homogene sferoïden te verkrijgen. Ten eerste werden verschillende aantallen Caco2-cellen getest om ideale werkomstandigheden vast te stellen, variërend van 50 tot 2.000 cellen per microwell/spheroid met behulp van special...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vitro 3D-modellen overwinnen de belangrijkste experimentele nadelen van 2D-kankercelculturen, omdat ze betrouwbaarder lijken te zijn bij het samenvatten van typische tumorkenmerken, waaronder micromilieu en cel heterogeniteit. Veelgebruikte 3D-modellen van sferoïden zijn steigervrij (gekweekt in omstandigheden met weinig bevestiging) of steigergebaseerd (met behulp van biomaterialen om cellen te gekweekt). Deze methoden vertonen verschillende nadelen omdat ze afhankelijk zijn van de aard van de gebruikte steiger of aa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We erkennen de platforms voor beeldvorming en Anipath recherche histologie (CRCL, CLB). We zijn de apotheek van het Centre Léon Bérard (CLB) Hospital schatplichtig voor het soort geschenk van FOLFOX en FOLFIRI. We danken brigittemanship ook voor het kritisch lezen van het manuscript. Het werk werd ondersteund door de FRM (Equipes FRM 2018, DEQ20181039598) en door de Inca (PLBIO19-289). MVG en LC kregen steun van de FRM en CF kreeg steun van arc foundation en het Centre Léon Bérard.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
37 µm Reversible Strainer, Large STEMCELL Technologies27250Te gebruiken met 50 mL conische buizen
5-FluorouracilGift van de Apotheek van het Centre Leon Berard (CLB)-stockoplossing, 5 mg/100 mL; uiteindelijke concentratie, 50 µg/mL
Agarose SigmaA9539
Aggrewell 400 24-well platenSTEMCELL Technologies344111.200 microputjes per putje voor sfeervorming en groei
Anti Caspase3 - KonijnCell Signaling9661verdunning 1:200
Anti Musashi-1 (14H1) - RateBioscience/Thermo Fisher14-9896-82verdunning 1:500
Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mLSTEMCELL Technologies07010
Anti-CD133 (13A4) - RatInvitrogen14-133-82verdunning 1:100
Anti-CD44 - KonijnAbcamab157107verdunning 1:2000
Anti-PCNA - MuisDakoM0879verdunning 1:1000
Anti-β-catenin - MuisSanta Cruz Biotechnologysc-7963verdunning 1:50
Zwarte multiwell platenThermo Fisher Scientific237108
CitroenzuurmonohydraatSigmaC1909
CLARIOstar apparaat BMG Labtechmicroplaatlezer
Dako penstift om cirkels op dia's te markeren voor het maken van barrières voor vloeistoffen
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) secundair antilichaam, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA21202verdunning 1:1000
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) secundair antilichaam, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA10037verdunning 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) sterk geadsorbeerd secundair antilichaam, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA21206verdunning 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) sterk geadsorbeerd secundair antilichaam, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA10042verdunning 1:1000
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide)Gibco10569010
Fetaal bovien serum (FBS)Gibco16000044
Fluorogel montagemedium met DAPIInterchimFP-DT094B
Goat anti-Rat IgG (H+L) geadsorbeerd secundair antilichaam, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA11077verdunning 1:1000
ImageJ softwareSfeer beeldanalyse
Irinotecan Gift van de Apotheek CLB-stockoplossing, 20 mg/mL; uiteindelijke concentratie, 100 µg/mL
iScript reverse transcriptase Bio-Rad1708891
LeucovorinGift van de Apotheek CLB-stockoplossing, 50 mg/mL; uiteindelijke concentratie, 25 µg/mL
Matrigel Basement Membrane MatrixCorning354234Basement membrane matrix
Nucleospin RNA XS KitMacherey-Nagel740902 .250
OxaliplatinGift van de Apotheek CLB-stockoplossing, 100 mg/20 mL; eindconcentratie, 10 µg/mL
Penicilline-streptomycineGibco15140130
Fosfaatbufferoplossing (PBS)Gibco14190250
SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)TakaraRR420B
SYTOX- GreenThermo Fisher ScientificS7020nucleïnezuurkleuring; verdunning 1:5000
Trypsin-EDTA (0,05 %)Gibco25300062
Zeiss-Axiovert microscoopinversiemicroscoop voor het verkrijgen van beelden van sferen

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
  2. Fearon, E. R., Vogelstein, B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell. 61 (5), 759-767 (1990).
  3. Rao, C. V., Yamada, H. Y. Genomic instability and colon carcinogenesis: from the perspective of genes. Frontiers in Oncology. 3, 130(2013).
  4. Fearon, E. R. Molecular genetics of colorectal cancer. Annual Review of Pathology. 6 (1), 479-507 (2011).
  5. Tran, T. Q., et al. α-Ketoglutarate attenuates Wnt signaling and drives differentiation in colorectal cancer. Nature Cancer. 1 (3), 345-358 (2020).
  6. Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
  7. Clevers, H. The cancer stem cell: premises, promises and challenges. Nature Medicine. 17 (3), 313-319 (2011).
  8. Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
  9. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  10. Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. Xenograft and organoid model systems in cancer research. The EMBO Journal. 38 (15), 101654(2019).
  11. Kawai, S., et al. Three-dimensional culture models mimic colon cancer heterogeneity induced by different microenvironments. Scientific Reports. 10 (1), 3156(2020).
  12. Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. Design of spherically structured 3D in vitro tumor models -Advances and prospects. Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).
  13. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).
  14. Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).
  15. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  16. Weiswald, L. -B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
  17. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  18. Silva-Almeida, C., Ewart, M. -A., Wilde, C. 3D gastrointestinal models and organoids to study metabolism in human colon cancer. Seminars in Cell & Developmental Biology. 98, 98-104 (2020).
  19. Chantret, I., Barbat, A., Dussaulx, E., Brattain, M. G., Zweibaum, A. Epithelial polarity, villin expression, and enterocytic differentiation of cultured human colon carcinoma cells: A survey of twenty cell lines. Cancer Research. 48 (7), 1936-1942 (1988).
  20. Caro, I., et al. Characterisation of a newly isolated Caco-2 clone (TC-7), as a model of transport processes and biotransformation of drugs. International Journal of Pharmaceutics. 116 (2), 147-158 (1995).
  21. Antonchuk, J. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWellTM plates. Methods in Molecular Biology. 946, 523-533 (2013).
  22. Wolpin, B. M., Mayer, R. J. Systemic treatment of colorectal cancer. Gastroenterology. 134 (5), 1296-1310 (2008).
  23. Yaffee, P., Osipov, A., Tan, C., Tuli, R., Hendifar, A. Review of systemic therapies for locally advanced and metastatic rectal cancer. Journal of Gastrointestinal Oncology. 6 (2), 185-200 (2015).
  24. Fujita, K., Kubota, Y., Ishida, H., Sasaki, Y. Irinotecan, a key chemotherapeutic drug for metastatic colorectal cancer. World Journal of Gastroenterology. 21 (43), 12234-12248 (2015).
  25. Mohelnikova-Duchonova, B., Melichar, B., Soucek, P. FOLFOX/FOLFIRI pharmacogenetics: the call for a personalized approach in colorectal cancer therapy. World Journal of Gastroenterology. 20 (30), 10316-10330 (2014).
  26. Jordan, N. J., et al. Impact of dual mTORC1/2 mTOR kinase inhibitor AZD8055 on acquired endocrine resistance in breast cancer in vitro. Breast Cancer Research. 16 (1), 12(2014).
  27. Mohr, J. C., et al. The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).
  28. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  29. Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), 59689(2013).
  30. Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  31. Nusse, R., Clevers, H. Wnt/β-catenin signaling, disease, and emerging therapeutic modalities. Cell. 169 (6), 985-999 (2017).
  32. Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biology and Toxicology. 21 (1), 1-26 (2005).
  33. Vermeulen, L., Snippert, H. J. Stem cell dynamics in homeostasis and cancer of the intestine. Nature Reviews Cancer. 14 (7), 468-480 (2014).
  34. van der Heijden, M., Vermeulen, L. Stem cells in homeostasis and cancer of the gut. Molecular Cancer. 18 (1), 66(2019).
  35. Barker, N., Bartfeld, S., Clevers, H. Tissue-resident adult stem cell populations of rapidly self-renewing organs. Cell Stem Cell. 7 (6), 656-670 (2010).
  36. van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
  37. Potten, C. S., et al. Identification of a putative intestinal stem cell and early lineage marker; musashi-1. Differentiation. 71 (1), 28-41 (2003).
  38. Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
  39. Clark, D. W., Palle, K. Aldehyde dehydrogenases in cancer stem cells: potential as therapeutic targets. Annals of Translational Medicine. 4 (24), 518(2016).
  40. Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., Hara, A. Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer. Oncotarget. 7 (10), 11018-11032 (2016).
  41. Zoetemelk, M., Rausch, M., Colin, D. J., Dormond, O., Nowak-Sliwinska, P. Short-term 3D culture systems of various complexity for treatment optimization of colorectal carcinoma. Scientific Reports. 9 (1), 7103(2019).
  42. Garcia-Mayea, Y., Mir, C., Masson, F., Paciucci, R., Leonart, M. E. Insights into new mechanisms and models of cancer stem cell multidrug resistance. Seminars in Cancer Biology. 60, 166-180 (2020).
  43. Marusyk, A., Janiszewska, M., Polyak, K. Intratumor heterogeneity: The Rosetta Stone of therapy resistance. Cancer Cell. 37 (4), 471-484 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

3D sfero dkweekCaco2 cellensfero dvormingkankerstamcelmarkersrespons op chemotherapielumenvormingcelproliferatiepatronenbasaalmembraanmatrixhomogene sfero dgrootte

Gerelateerde artikelen