We beschrijven een single-molecule benadering van antigeen-antilichaam affiniteit metingen met behulp van massa fotometrie (MP). Het MP-gebaseerde protocol is snel, nauwkeurig, gebruikt een zeer kleine hoeveelheid materiaal en vereist geen eiwitmodificatie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Snelle bepaling van antilichaam-antigeen affiniteit door massa fotometrie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Metingen van de specificiteit en affiniteit van antigeen-antilichaam interacties zijn van cruciaal belang voor medische en onderzoekstoepassingen. In dit protocol beschrijven we de implementatie van een nieuwe single-molecule techniek, massa fotometrie (MP), voor dit doel. MP is een label- en immobilisatievrije techniek die moleculaire massa's en populaties van antilichamen en antigeen-antilichaamcomplexen op één molecuulniveau detecteert en kwantificeert. MP analyseert het antigenantilichaammonster binnen enkele minuten, waardoor de bindingsaffiniteit nauwkeurig kan worden bepaald en tegelijkertijd informatie kan worden verstrekt over de stoichiometrie en de oligomeric toestand van de eiwitten. Dit is een eenvoudige en eenvoudige techniek die alleen picomole hoeveelheden eiwit en geen dure verbruiksgoederen vereist. Dezelfde procedure kan worden gebruikt om eiwit-eiwitbinding te bestuderen voor eiwitten met een moleculaire massa groter dan 50 kDa. Voor multivalente eiwitinteracties kunnen de affiniteiten van meerdere bindingsplaatsen in één meting worden verkregen. Echter, de single-molecule wijze van meting en het ontbreken van etikettering legt een aantal experimentele beperkingen. Deze methode geeft de beste resultaten wanneer toegepast op metingen van sub-micromolar interactie affiniteiten, antigenen met een moleculaire massa van 20 kDa of groter, en relatief zuivere eiwitmonsters. We beschrijven ook de procedure voor het uitvoeren van de vereiste montage- en berekeningsstappen met behulp van basisgegevensanalysesoftware.
Inleiding
Antilichamen zijn alomtegenwoordige instrumenten van moleculaire biologie geworden en worden op grote schaal gebruikt in zowel medische als onderzoekstoepassingen. In de geneeskunde zijn ze van cruciaal belang in de diagnostiek, maar hun therapeutische toepassingen worden ook uitgebreid en nieuwe op antilichamen gebaseerde therapieën worden voortdurend ontwikkeld1,2,3,4. De wetenschappelijke toepassingen van antilichamen omvatten vele onmisbare laboratoriumtechnieken zoals immunofluorescentie5,immunoprecipitatie
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bereid de stroomkamers voor
- Maak de glazen hesjes schoon
- Met behulp van wasflessen met gedestilleerd water, ethanol en isopropanol, spoel de 24 mm x 50 mm covers in de volgende volgorde: water, ethanol, water, isopropanol, water. Droog de coverslips met een stroom van schone stikstof. Het is belangrijk om de coverslips van boven naar beneden te spoelen, waarbij de onderste hoek met zachte tangen wordt vastgehouden. Droog de afdekken in dezelfde richting om besmetting van de tangen te voorkomen (figuur 2A).
- Spoel ook de 24 mm x 24 mm coverslips af met gedestilleerd water, ethanol en gedestilleerd water. Droo....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We hebben eerder onderzocht de interactie van de menselijke α-trombin (HT) en muis monoklonale anti-menselijke trombine antilichaam (AHT) met behulp van de MP gebaseerde test11. Aangezien de moleculaire massa van de HT (37 kDa) onder de detectiegrens van 40 kDa ligt, kan de maximale steekproefconcentratie de concentratiebeperking van 50 nM MP overschrijden zonder de resolutie van massaverdelingen negatief te beïnvloeden. Het experiment was gepland als een titratieserie met het AHT-antilichaam bij .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het op massafotometrie gebaseerde protocol dat hier wordt beschreven, biedt een snelle en nauwkeurige methode voor het meten van antigeen-antilichaambindingsafdijningen. MP-analyse maakt gebruik van een zeer kleine hoeveelheid materiaal, en aanvullende informatie, waaronder stoichiometrie, oligomerisatie en zuiverheid, kan worden beoordeeld aan de hand van dezelfde gegevens(figuur 5). Zonder wijzigingen is deze methode van toepassing op de metingen van dissociatieconstanten in het ongeveer 5.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij danken Keir Neuman voor zijn kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door het intramurale programma van de NHLBI, NIH.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| AcquireMP | Refeyn | MP data collectie software | |
| Anti-human thrombin | Haematologic Technologies | AHT-5020 | RRID: AB_2864302 |
| Katoenen applicators | Thorlabs | CTA10 | katoenen optische wattenstaafjes voor lensreiniging |
| Dekglasjes 24x24 mm | Globe Scientific | 1405-10 | |
| Dekglasjes 24x50 mm | Fisher Scientific | 12-544-EP | |
| DiscoverMP | Refeyn | MP dataverwerkingssoftware | |
| Pincet | Electron Microscopy Sciences | 78080-CF | pincet met zachte punt voor het hanteren van dekglasjes |
| Human α-thrombin | Haematologic Technologies | HCT-0020 | |
| Immersiol | Thorlabs | MOIL-30 | |
| Isopropanol | Alfa Aesar | 36644 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | spreadsheet | |
| OneMP | Refeyn | Mass Photometry instrument | |
| Origin | OriginLab | wetenschappelijke grafische software | |
| PBS | Corning | 46-013-CM | 10x stockoplossing |
| Spuitfilter | Millipore | SLGSR33SS | buffer- en monsterfiltratie |
Referenties
- Francis, R. J., et al. A phase I trial of antibody directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) in patients with advanced colorectal carcinoma or other CEA producing tumours. British Journal of Cancer. 87 (6), 600-607 (2002).
- van Dyck, C. H.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
