Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Snelle bepaling van antilichaam-antigeen affiniteit door massa fotometrie

7.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61784

⸱

8 februari 2021

 , 
1Biophysics Core Facility, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een single-molecule benadering van antigeen-antilichaam affiniteit metingen met behulp van massa fotometrie (MP). Het MP-gebaseerde protocol is snel, nauwkeurig, gebruikt een zeer kleine hoeveelheid materiaal en vereist geen eiwitmodificatie.

Samenvatting

Metingen van de specificiteit en affiniteit van antigeen-antilichaam interacties zijn van cruciaal belang voor medische en onderzoekstoepassingen. In dit protocol beschrijven we de implementatie van een nieuwe single-molecule techniek, massa fotometrie (MP), voor dit doel. MP is een label- en immobilisatievrije techniek die moleculaire massa's en populaties van antilichamen en antigeen-antilichaamcomplexen op één molecuulniveau detecteert en kwantificeert. MP analyseert het antigenantilichaammonster binnen enkele minuten, waardoor de bindingsaffiniteit nauwkeurig kan worden bepaald en tegelijkertijd informatie kan worden verstrekt over de stoichiometrie en de oligomeric toestand van de eiwitten. Dit is een eenvoudige en eenvoudige techniek die alleen picomole hoeveelheden eiwit en geen dure verbruiksgoederen vereist. Dezelfde procedure kan worden gebruikt om eiwit-eiwitbinding te bestuderen voor eiwitten met een moleculaire massa groter dan 50 kDa. Voor multivalente eiwitinteracties kunnen de affiniteiten van meerdere bindingsplaatsen in één meting worden verkregen. Echter, de single-molecule wijze van meting en het ontbreken van etikettering legt een aantal experimentele beperkingen. Deze methode geeft de beste resultaten wanneer toegepast op metingen van sub-micromolar interactie affiniteiten, antigenen met een moleculaire massa van 20 kDa of groter, en relatief zuivere eiwitmonsters. We beschrijven ook de procedure voor het uitvoeren van de vereiste montage- en berekeningsstappen met behulp van basisgegevensanalysesoftware.

Inleiding

Antilichamen zijn alomtegenwoordige instrumenten van moleculaire biologie geworden en worden op grote schaal gebruikt in zowel medische als onderzoekstoepassingen. In de geneeskunde zijn ze van cruciaal belang in de diagnostiek, maar hun therapeutische toepassingen worden ook uitgebreid en nieuwe op antilichamen gebaseerde therapieën worden voortdurend ontwikkeld1,2,3,4. De wetenschappelijke toepassingen van antilichamen omvatten vele onmisbare laboratoriumtechnieken zoals immunofluorescentie5,immunoprecipitatie6, stroomcytometrie7,ELISA en westerse blotting. Voor elk van deze toepassingen is het verkrijgen van nauwkeurige metingen van de bindende eigenschappen van het antilichaam, inclusief bindende affiniteit en specificiteit, van cruciaal belang.

Sinds de introductie van het eerste commerciële oppervlakteplasmon resonantie (SPR) instrument in 1990 zijn optische biosensoren de "gouden standaard" van antilichaamkarakterisering geworden, maar andere technieken, waaronder ELISA, worden ook routinematig gebruikt om antilichaamaffinities8,9te meten . Deze methoden vereisen meestal immobilisatie of etikettering van de geanalyseerde moleculen, die mogelijk van invloed kunnen zijn op de interactie van belang. Ze zijn ook relatief traag, waarbij meerdere teststappen voordat de resultaten kunnen worden verzameld voor gegevensanalyse. Een onlangs ontwikkelde single-molecule methode, massa fotometrie (MP), detecteert moleculen direct in oplossing wanneer ze landen op het oppervlak van de microscoop coverslip10,11. De op lichtverstrooiing gebaseerde optische detectie die MP gebruikt, vereist geen eiwitlabeling of modificatie. Individuele eiwitmoleculen worden geregistreerd door de interferometrische verstrooiingsmicroscoop als donkere vlekken die in de afbeelding verschijnen(figuur 1D), en enkele duizenden moleculen kunnen worden gedetecteerd tijdens de data-acquisitie van één minuut12. Het signaal dat door elk afzonderlijk deeltje wordt gegenereerd, wordt gekwantificeerd en de contrastwaarde (relatieve duisternis) wordt berekend. De interferometrische contrastwaarden zijn evenredig aan de moleculaire massa's van de eiwitten, waardoor gebonden en vrije soorten in het antigeen-antilichaammengsel kunnen worden geïdentificeerd. Tegelijkertijd meet MP door moleculaire landingsgebeurtenissen te tellen rechtstreeks de soortenpopulaties. Dit geeft MP gebaseerde methoden een unieke mogelijkheid om onafhankelijk te kwantificeren affiniteiten van meerdere bindende sites.

Binding van de antigeen (Ag)moleculen aan de twee bindende plaatsen van het intacte antilichaam (Ab) kan worden omschreven als:
figure-introduction-1
met de evenwichtsassociatie constanten Ka1 en Ka2 gedefinieerd als:
figure-introduction-2
waar ci en fi respectievelijk concentratie en fractie van het onderdeel ivertegenwoordigen. De totale antigeenconcentratie (cAg)tot kan worden uitgedrukt als:
figure-introduction-3

Aangezien de totale concentraties van het antilichaam (cAb)tot en antigeen (cAg)tot bekend zijn, kan deze vergelijking worden gebruikt om rechtstreeks te passen bij de experimentele componentfracties verkregen uit de MP-metingen en de evenwichtsstifies Ka1 en Ka2 te berekenen (zie Aanvullende informatie).

De MP-gegevens kunnen ook worden gebruikt om de samenwerking tussen de twee antilichaambindende sites11te schatten . Voor twee antilichaamparatopes met identieke microscopische bindende constanten, de statistische factoren die het proces van bevolking van Abbeschrijven · Ag en Ab· Ag2 complexen dicteren dat de schijnbare macroscopische evenwichtsconstanten Ka1 en Ka2 zal niet numeriek gelijk zijn, en Ka1 = 4Ka2. Daarom wijzen de experimentele waarden van Ka1 < 4Ka2 op een positieve samenwerking tussen de twee antilichaambindingslocaties. K a1 > 4Ka2 geeft ook negatieve samenwerking aan.

MP-metingen van de antigeen-antilichaambinding zijn snel en vereisen een kleine hoeveelheid materiaal. De MP-massaverdelingen die worden gebruikt voor evenwichtsconstante berekeningen bieden aanvullende informatie over de eigenschappen van het monster en maken de beoordeling van de monsterzuiverheid, oligomerisatie en aggregatie in één experiment mogelijk. Dezelfde methode kan worden gebruikt om hoge affiniteit eiwit-eiwit binding te meten, en MP is vooral nuttig voor studies van multi-valent eiwit interacties. Multi-eiwit complexen hebben meestal grote moleculaire massa's, optimaal voor MP detectie, en single-molecule gegevens kunnen worden gebruikt om stoichiometrie te meten en affinities van meerdere bindende sites tegelijk te berekenen. Deze informatie is meestal moeilijk te verkrijgen met behulp van bulk-gebaseerde methoden.

Zonder wijzigingen is het huidige protocol geschikt voor metingen van relatief hoge affiniteit, submicromolar interacties met antigenen van een moleculaire massa van 20 kDa of groter. Voor optimale resultaten moeten eiwitvoorraden van hoge zuiverheid zijn, maar er zijn geen specifieke buffervereisten. Door mp te gebruiken, kan de antigeen-antilichaambinding in minder dan vijf minuten worden beoordeeld. Het verzamelen en analyseren van gegevens die nodig zijn voor nauwkeurige Kd-berekeningen kan binnen 30 minuten worden uitgevoerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bereid de stroomkamers voor

  1. Maak de glazen hesjes schoon
    1. Met behulp van wasflessen met gedestilleerd water, ethanol en isopropanol, spoel de 24 mm x 50 mm covers in de volgende volgorde: water, ethanol, water, isopropanol, water. Droog de coverslips met een stroom van schone stikstof. Het is belangrijk om de coverslips van boven naar beneden te spoelen, waarbij de onderste hoek met zachte tangen wordt vastgehouden. Droog de afdekken in dezelfde richting om besmetting van de tangen te voorkomen (figuur 2A).
    2. Spoel ook de 24 mm x 24 mm coverslips af met gedestilleerd water, ethanol en gedestilleerd water. Droog de coverslips met een stroom van schone stikstof.
    3. Identificeer de werkzijde van de coverslip, plaats een druppel gedestilleerd water op het oppervlak van de schone coverslip en volg de stappen 3.1–3.2 van het protocol. Meestal slechts een kant van de 24 mm x 50 mm coverslip heeft de optische kwaliteit geschikt voor MP metingen.
      OPMERKING: Na het scherpstellen mogen er geen significante oppervlakteonvolkomenheden worden gedetecteerd en moet de "signaal"-waarde in de software voor het verzamelen van gegevens minder dan 0,05% bedragen(figuur 1A-C). De werkende kanten van alle coverslips in de doos zijn in dezelfde richting georiënteerd. Dezelfde procedure moet worden gebruikt om de efficiëntie van de coverslip reiniging te testen.
  2. De stroomkamer monteren
    1. Plaats de 24 mm x 24 mm coverslip op een stuk aluminiumfolie. Plaats stroken dubbelzijdige tape bovenop de 24 mm x 24 mm coverslip zoals afgebeeld in figuur 2B en snijd de tape langs de rand van het glas. Scheid de coverslip van de aluminiumfolie en bevestig deze aan de werkzijde van de 24 mm x 50 mm coverslip (figuur 2C).
      LET OP: De kanaalgrootte kan variëren, maar een breedte van 3 mm–5 mm wordt aanbevolen. Bredere kanalen vereisen grotere steekproefvolumes en zeer smalle kanalen kunnen moeilijk te laden zijn. Meestal kunnen twee parallelle kanalen eenvoudig worden gemaakt op de 24 mm x 24 mm coverslip. Protocol kan hier worden onderbroken.

2. Bereid de antilichaam-antigeenmonsters voor op de affiniteitsmetingen

  1. Filter ten minste 2 mL van de PBS-buffer met 0,22 μm spuitfilters om stofdeeltjes of aggregaten te verwijderen. Centrifugeren de eiwitvoorraad gedurende 10 minuten bij de maximale snelheid van de centrifuge van het tafelblad (ongeveer 16.000 x g).
    OPMERKING: PBS is de aanbevolen buffer voor dit protocol, maar MP heeft geen specifieke buffervereisten en andere biologische buffers zijn ook aanvaardbaar. Hoge glycerolconcentraties (>10%) en zeer lage ionische sterktes (zoutconcentratie <10 mM) kunnen de beeld- en gegevenskwaliteit beïnvloeden en worden niet aanbevolen.
  2. Bepaal de werkelijke concentraties van de antilichaam- en antigeenvoorraden door hun 280 nm UV-absorptie te meten.
  3. Bereken de meetconcentraties van het antigeen-antilichaammengsel. Als de geschatte waarde van de antilichaambindende affiniteit niet bekend is, plan dan om een monster te bereiden met 30 nM-antigeen en 20 nM-antilichaamconcentratie. Wanneer de geschatte affiniteit bekend is, moeten het antilichaam tegen antigeenverhouding en hun concentraties worden geoptimaliseerd op basis van de verwachte Kd-waarden. Gebruik de totale antigeenconcentratie in het mengsel gelijk aan de som van de verwachte Kd en de totale concentratie van antilichamen in de onderstaande vergelijking. Uitgaande van Kd1 = Kd2 voor de twee paratopen van het antilichaam, zal dit resulteren in vergelijkbare concentraties van het vrije antilichaam en de antilichaam-antigeencomplexen in het monster.
    figure-protocol-1
    Pas de concentratie van antilichamen aan om de totale eiwitconcentratie in het monster binnen het bereik van 10 nM en 50 nM te houden. De beste resultaten worden verkregen met behulp van mengsels met antilichaamconcentraties tussen 5 nM en 25 nM.
    OPMERKING: MP detecteert eiwitten met een moleculaire massa groter dan 40 kDa. Bijgevolg kunnen monsterconcentraties van antigenen met een moleculaire massa kleiner dan 40 kDa de typische 50 nM-limiet overschrijden. Bij concentraties hoger dan ongeveer 100 nM kunnen zelfs lage moleculaire massaantigenen echter de beeldkwaliteit en nauwkeurigheid van de Kd-bepaling beïnvloeden.
  4. Bereid 50 μL van het antilichaam-antigeenmengsel voor bij de uiteindelijke meetconcentratie, berekend in stap 2.3.
    OPMERKING: Voor de Kd-bepaling is slechts één monster van het antigeen-antilichaammengsel vereist. Het voorbereiden van verschillende monsters met verschillende antigeen-antilichaamverhoudingen kan echter helpen bij het optimaliseren van de monsterconcentratie. Als gegevens van meerdere monsters worden verzameld, kunnen ze worden geanalyseerd via een globale pasvorm.
  5. Het antigeen-antilichaammengsel(s) ongeveer 10 minuten bij kamertemperatuur uitbroeden om de bindingsreactie in staat te stellen het chemische evenwicht te bereiken. Vermijd onnodig lange incubatietijden.
    OPMERKING: De incubatietijd kan variëren afhankelijk van de bindende kinetiek. Om te bevestigen dat het chemische evenwicht is bereikt, kunnen steekproefmetingen op verschillende incubatietijden worden herhaald. Time-invariant Kd-waarden geven voldoende lange incubatie aan. Langdurige incubatie kan leiden tot aanzienlijke eiwitadsorptie aan het oppervlak van het plastic labware en bijgevolg tot aanzienlijke fouten in de bepaling van de eiwitconcentratie. Om deze reden wordt labware met een lage hechting sterk aanbevolen voor MP-monstervoorbereiding13.

3. Verzamel de massafotometriegegevens

  1. Breng een druppel microscoop onderdompelingsolie aan op de MP-instrumentdoelstelling en plaats de geassembleerde stroomkamer op het microscoopstadium. Zorg ervoor dat de olie de kloof tussen de coverslip en het doel omspant.
  2. Laad de stroomkamer en focus de massafotometer.
    1. Deponeren 10 μL van een schone, gefilterde bufferoplossing aan het ene uiteinde van het kanaal van de stroomkamer dat in stap 1 is voorbereid. Vloeistof zal het kanaal binnendreeen door capillaire actie.
    2. Pas de Z-positie van de stage aan om de microscoop te richten op het werkoppervlak van de 24 x 50 mm coverslip.
      1. Gebruik op het tabblad Focusbeheer van de software voor het verzamelen van gegevens de grof gefasede beweging Omhoog en Omlaag om de eerste aanpassingen te maken.
      2. Klik op de knop Scherpte om de uitlezing van het scherptesignaal weer te geven en gebruik de fijne aanpassingsknoppen Omhoog en Omlaag om de scherptewaarde te maximaliseren.
      3. Klik op de knoppen Focus en Focus instellen om de focustrackingfunctie te activeren. Een goed gericht beeld (figuur 1A,C) moet de "signaal" waarde onder 0,05% hebben.
        OPMERKING: Als de "signaal"-waarde op de maximale scherptepositie boven 0,05% ligt, kan dit duiden op onzuiverheden op het glasoppervlak of in de buffer.
  3. Met behulp van hetzelfde kanaal laad je 20 μL van het antilichaam-antigeenmonster door het aan de ene kant van het kanaal te deponeren en de vloeistof van het andere uiteinde te besmloten met een klein stukje vloeipapier(figuur 2D).
    LET OP: Het volume van een 3-5 mm breed kanaal is ongeveer 10 μL. Het extra monstervolume wordt aanbevolen om de in het kanaal aanwezige buffer volledig te vervangen en monsterverdunning te voorkomen.
  4. Na het laden van het monster, onmiddellijk op de knop Opnemen om te beginnen met het verzamelen van gegevens, het verwerven van een 100 s video (Figuur 1D).
  5. Voer aan het einde van de gegevensverzameling de bestandsnaam in en klik op OK om het gegevensbestand op te slaan.
  6. Gooi de coverslips weg en veeg de olie van de objectieve lens met wattenstaafjes nat met isopropanol.
    LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken.

4. Analyseer de MP-gegevens

  1. Verwerk het verzamelde videobestand met behulp van de MP-gegevensverwerkingssoftware om de landingsgebeurtenissen te identificeren.
    1. Gebruik de menuoptie Bestand/Openen om het bestand voor de analyse te laden en klik op Analyseren.
    2. Klik op de knop Laden om de kalibratiefunctie te laden en sla de geanalyseerde gegevens op met de menuoptie Resultaten bestand/opslaan als.
  2. Pas de moleculaire massaverdeling aan met Gaussische functies om relatieve concentraties van elke soort in het monster te verkrijgen. Deze analyse kan worden uitgevoerd met behulp vaneen gemeenschappelijke wetenschappelijke grafische software (zie Tabel van materialen ).
    1. Importeer het bestand 'eventsFitted.csv' in de software en plot de moleculaire massaverdeling (kolom M in het .csv-bestand) met behulp van de functie Plot/Statistieken/Histogram.
    2. Dubbelklik op het histogram om het venster Ploteigenschappen te openen. Schakel automatische binning uit en selecteer een opslaglocatiegrootte van 2,5 kDa. Klik op de knoppen Toepassen en Ga om de gegevens Bin Centers and Counts te maken.
    3. Selecteer de kolommen Bin Centers and Counts en gebruik de menufunctie Analysis/Peaks en Baseline/Multiple Peak Fit om het histogram te passen bij Gaussian-functies. Dubbelklik om de geschatte piekposities op het distributieperceel aan te geven en klik vervolgens op de knop NLFit openen.
    4. Controleer de vaste selectievakjes voor de "xc" piekcentra en stel hun waarden in op de verwachte moleculaire massa's van het vrije antilichaam en de enkele en dubbele antigeen-antilichaam complexen. Controleer de optie Delen op de breedteparameters. Klik op de knop Aanpassen. De ingerichte piekhoogtewaarden van de Gaussische componenten vertegenwoordigen de relatieve concentratie van elke soort in het monster11.
      OPMERKING: De opslaglocatiegrootte kan worden aangepast om de resolutie van het massadistributieperceel te optimaliseren. De MP-precisielimiet is ongeveer 1 kDa en kleinere bakgroottes kunnen het geluid van de distributie versterken, zonder extra informatie te onthullen. Zeer grote bak maten zal verduisteren de fijne details van massaverdelingen.
  3. Bereken de concentratiefractie van elke soort aan de hand van de volgende vergelijking:
    figure-protocol-2
    wanneer de waarden hi en fi respectievelijk piekhoogten en concentratiefracties van het vrije antilichaam en het enkel- en dubbelgebonden antilichaam in het monster vertegenwoordigen.

5. Bereken evenwichtsconstante waarden

  1. Pas de concentratiefracties van de interactiesoorten die in stap 4.3 met Eq. 1 en 2 zijn berekend met behulp van een geschikte analytische software. Hier demonstreren we een methode om evenwichtsconstanten te berekenen met behulp van een spreadsheetprogramma14 (zie Aanvullende informatie).
    1. Open het werkblad 'Kd-berekening.xlsx'. In dit werkblad kunnen de celwaarden in de in geel gemarkeerde rijen 1 tot en met 10 worden gewijzigd om de berekeningen van de evenwichtsconstanten uit te voeren.
    2. Voer de geschatte Kd-waarden in nanomolar-eenheden in de cellen B1 en B2 in de tabel in. Deze startwaarden worden geoptimaliseerd in de montageprocedure. Als de geschatte Kd-waarden niet bekend zijn, blijven de standaardwaarden in de cellen B1 en B2 ongewijzigd.
    3. Voer de waarden van (cAb)tot en (cAg)tot in nanomolar-eenheden in de cellen D2 en E2 in. Voer de breukwaarden in die in stap 4.3 zijn berekend in de cellen F2, G2 en H2. Indien meerdere monsters met verschillende concentratieverhoudingen worden gemeten, kunnen in rijen 2 tot en met 10 extra concentratiewaarden worden ingevoerd.
    4. Selecteer de menufunctie Gegevens/Oplosser. Typ '$B$15' in het vak 'Objectief instellen' en '$B$1:$B$2' in het vak 'Variabele cellen wijzigen:' Selecteer de knop Min-keuzerondje voor de optie Aan: Schakel het selectievakje Niet-negatieve variabelen maken en selecteer GRG Nonlinear als oplosmethode. Klik op de knop Oplossen. De beste Kd1- en Kd2-waarden worden weergegeven in cel B1 en B2 en de uiteindelijke som van vierkante fouten in cel B15.
      OPMERKING: Als de functie Oplosser niet actief is, selecteert u Opties onder het menu Bestand in het spreadsheetprogramma. Selecteer in de categorie Invoegtoepassingen de invoegtoepassing Oplosser onder de invoegtoepassingen voor inactieve toepassingen en klik op de knop Ga. Schakel het selectievakje Invoegtoepassing op solver in en klik op OK.

figure-protocol-3
Figuur 1: Massa fotometrie beelden. (A) Representatieve native view beeld van de beeldvorming buffer verzameld op een schone coverslip en (B) op een coverslip met oppervlakte onvolkomenheden. (C) Differentiële ratiometrische beeld van de beeldverffer en (D) de AHT· HT-oplossing. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-protocol-4
Figuur 2: MP flow chamber voorbereiding en laden. a) De positie van coverslip voor de reinigingsprocedure. (B) Uitlijning van de 24 x 24 mm coverslip (middelste laag) en de dubbelzijdige tape (bovenste laag) op het oppervlak van aluminiumfolie (onderste laag, niet getoond). Blauwe stippellijnen tonen de locatie van snijlijnen. (C) Boven- en zijaanzicht van de geassembleerde stroomkamer met twee monsterkanalen en een afbeelding van de geassembleerde stroomkamer. (D) Procedure voor het laden van monsters in een stroomkanaal dat eerder met buffer was gevuld. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

We hebben eerder onderzocht de interactie van de menselijke α-trombin (HT) en muis monoklonale anti-menselijke trombine antilichaam (AHT) met behulp van de MP gebaseerde test11. Aangezien de moleculaire massa van de HT (37 kDa) onder de detectiegrens van 40 kDa ligt, kan de maximale steekproefconcentratie de concentratiebeperking van 50 nM MP overschrijden zonder de resolutie van massaverdelingen negatief te beïnvloeden. Het experiment was gepland als een titratieserie met het AHT-antilichaam bij ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het op massafotometrie gebaseerde protocol dat hier wordt beschreven, biedt een snelle en nauwkeurige methode voor het meten van antigeen-antilichaambindingsafdijningen. MP-analyse maakt gebruik van een zeer kleine hoeveelheid materiaal, en aanvullende informatie, waaronder stoichiometrie, oligomerisatie en zuiverheid, kan worden beoordeeld aan de hand van dezelfde gegevens(figuur 5). Zonder wijzigingen is deze methode van toepassing op de metingen van dissociatieconstanten in het ongeveer 5...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken Keir Neuman voor zijn kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door het intramurale programma van de NHLBI, NIH.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AcquireMPRefeynMP data collectie software
Anti-human thrombinHaematologic TechnologiesAHT-5020RRID: AB_2864302
Katoenen applicatorsThorlabsCTA10katoenen optische wattenstaafjes voor lensreiniging
Dekglasjes 24x24 mmGlobe Scientific1405-10
Dekglasjes 24x50 mmFisher Scientific12-544-EP
DiscoverMPRefeynMP dataverwerkingssoftware
PincetElectron Microscopy Sciences78080-CFpincet met zachte punt voor het hanteren van dekglasjes
Human α-thrombinHaematologic TechnologiesHCT-0020
ImmersiolThorlabsMOIL-30
IsopropanolAlfa Aesar36644
Microsoft ExcelMicrosoftspreadsheet
OneMPRefeynMass Photometry instrument
OriginOriginLabwetenschappelijke grafische software
PBSCorning46-013-CM10x stockoplossing
SpuitfilterMilliporeSLGSR33SSbuffer- en monsterfiltratie

Referenties

  1. Francis, R. J., et al. A phase I trial of antibody directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) in patients with advanced colorectal carcinoma or other CEA producing tumours. British Journal of Cancer. 87 (6), 600-607 (2002).
  2. van Dyck, C. H. Anti-Amyloid-beta Monoclonal Antibodies for Alzheimer's Disease: Pitfalls and Promise. Biological Psychiatry. 83 (4), 311-319 (2018).
  3. Vennepureddy, A., Singh, P., Rastogi, R., Atallah, J. P., Terjanian, T. Evolution of ramucirumab in the treatment of cancer - A review of literature. Journal of Oncology Pharmacy Practice. 23 (7), 525-539 (2017).
  4. Waldmann, T. A. Immunotherapy: past, present and future. Nature Medicine. 9 (3), 269-277 (2003).
  5. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
  6. Rosenberg, M. I. Protein Analysis and Purification. , Birkhauser. Basel. (2005).
  7. Picot, J., Guerin, C. L., Le Van Kim, C., Boulanger, C. M. Flow cytometry: Retrospective, fundamentals and recent instrumentation. Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).
  8. Khan, S. H., Farkas, K., Kumar, R., Ling, J. A versatile method to measure the binding to basic proteins by surface plasmon resonance. Analytical Biochemistry. 421 (2), 385-390 (2012).
  9. Lofgren, J. A., et al. Comparing ELISA and surface plasmon resonance for assessing clinical immunogenicity of panitumumab. The Journal of Immunology. 178 (11), 7467-7472 (2007).
  10. Young, G., et al. Quantitative mass imaging of single biological macromolecules. Science. 360 (6387), 423-427 (2018).
  11. Wu, D., Piszczek, G. Measuring the affinity of protein-protein interactions on a single-molecule level by mass photometry. Analytical Biochemistry. 592, 113575(2020).
  12. Cole, D., Young, G., Weigel, A., Sebesta, A., Kukura, P. Label-free single-molecule imaging with numerical-aperture-shaped interferometric scattering microscopy. ACS Photonics. 4 (2), 211-216 (2017).
  13. Soltermann, F., et al. Quantifying protein-protein interactions by molecular counting with mass photometry. Angewandte Chemie International Edition in English. 59 (27), 10774-10779 (2020).
  14. Kemmer, G., Keller, S. Nonlinear least-squares data fitting in Excel spreadsheets. Nature Protocols. 5 (2), 267-281 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Meting van bindingsaffiniteitenkelmolecuultechniekeiwit-eiwitbindingantigeen-antilichaamcomplexdissociatieconstantemoleculaire massaverdelingtitratiereeksGaussische fitting
Snelle bepaling van antilichaam-antigeen affiniteit door massa fotometrie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.