Methodenartikel

Uitgebreide workflow van op massaspectrometrie gebaseerde Shotgun Proteomics van weefselmonsters

DOI:

10.3791/61786

⸱

13 november 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biosciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology Bombay

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het beschreven protocol biedt een geoptimaliseerde kwantitatieve proteomics-analyse van weefselmonsters met behulp van twee benaderingen: labelgebaseerde en labelvrije kwantificering. Labelgebaseerde benaderingen hebben het voordeel van een nauwkeurigere kwantificering van eiwitten, terwijl een labelvrije aanpak kosteneffectiever is en wordt gebruikt om honderden monsters van een cohort te analyseren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Recente ontwikkelingen in massaspectrometrie hebben geresulteerd in diepe proteomische analyse samen met het genereren van robuuste en reproduceerbare datasets. Ondanks de aanzienlijke technische vooruitgang vormt de monstervoorbereiding van biospecimens zoals patiëntenbloed, csf en weefsel echter nog steeds aanzienlijke uitdagingen. Voor het identificeren van biomarkers biedt weefselproteomics vaak een aantrekkelijke monsterbron om de onderzoeksresultaten van de bank naar de kliniek te vertalen. Het kan potentiële kandidaat-biomarkers onthullen voor vroege diagnose van kanker en neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, enz. Weefselproteomics levert ook een schat aan systemische informatie op basis van de overvloed aan eiwitten en helpt om interessante biologische vragen aan te pakken.

Kwantitatieve proteomics-analyse kan worden gegroepeerd in twee brede categorieën: een labelgebaseerde en een labelvrije aanpak. In de labelgebaseerde benadering worden eiwitten of peptiden gelabeld met behulp van stabiele isotopen zoals SILAC (stabiele isotoopetikettering met aminozuren in celkweek) of door chemische tags zoals ICAT (isotoopgecodeerde affiniteitstags), TMT (tandem mass tag) of iTRAQ (isobare tag voor relatieve en absolute kwantificering). Labelgebaseerde benaderingen hebben het voordeel van een nauwkeurigere kwantificering van eiwitten en met behulp van isobare labels kunnen meerdere monsters in één experiment worden geanalyseerd. De labelvrije aanpak biedt een kosteneffectief alternatief voor labelgebaseerde benaderingen. Honderden patiëntmonsters die tot een bepaald cohort behoren, kunnen worden geanalyseerd en vergeleken met andere cohorten op basis van klinische kenmerken. Hier hebben we een geoptimaliseerde kwantitatieve proteomics-workflow beschreven voor weefselmonsters met behulp van labelvrije en labelgebaseerde proteoomprofileringsmethoden, wat cruciaal is voor toepassingen in de biowetenschappen, met name op biomarkerontdekking gebaseerde projecten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteomics-technologieën hebben het potentieel om de identificatie en kwantificering van potentiële kandidaat-markers mogelijk te maken die kunnen helpen bij de detectie en voorspelling van de ziekte1. Recente ontwikkelingen op het gebied van massaspectrometrie hebben het klinisch onderzoek op eiwitniveau versneld. Onderzoekers proberen de uitdaging van gecompliceerde pathobiologie van verschillende ziekten aan te pakken met behulp van op massaspectrometrie gebaseerde proteomica, die nu een verhoogde gevoeligheid biedt voor eiwitidentificatie en kwantificering2. Nauwkeurige kwantitatieve meting van eiwitten is cruciaal om de dynamische en ruimtelijke samenwerking tussen eiwitten bij gezonde en zieke individuen tebegrijpen 3; een dergelijke analyse op proteoombrede schaal is echter niet eenvoudig.

Een belangrijke beperking van proteomische profilering van klinische monsters is de complexiteit van biologische monsters. Veel verschillende soorten monsters zijn onderzocht om de ziekte proteoom te bestuderen, zoals cellijnen, plasma en weefsels4,5. Cellijnen worden veel gebruikt als modellen in in vitro experimenten om verschillende stadia van ziekteprogressie na te bootsen. Een belangrijke beperking met cellijnen is echter dat ze gemakkelijk genotypische en fenotypische veranderingen krijgen tijdens het proces van celkweek6. Lichaamsvloeistoffen zoals plasma kunnen een aantrekkelijke bron zijn voor de ontdekking van biomarkers; vanwege de zeer overvloedige eiwitten en het dynamische bereik van eiwitconcentratie is plasmaproteomics echter een beetje uitdagender7. Hier kunnen peptiden afkomstig van de meest voorkomende eiwitten die zijn afgeleid van de weinig voorkomende eiwitten onderdrukken, zelfs als de massa / ladingsverhouding hetzelfde is6. Hoewel er de afgelopen jaren vooruitgang is geboekt in de uitputtings- en fractioneringstechnologieën, blijft het verkrijgen van een goede dekking nog steeds een belangrijke beperking van plasmaproteomics8,9. Het gebruik van weefsels voor proteomisch onderzoek van ziektebiologie heeft de voorkeur omdat weefselmonsters het meest proximaal zijn voor de ziekteplaatsen en hoge fysiologische en pathologische informatie bieden om betere inzichten in de ziektebiologie te bieden10,11.

In dit manuscript hebben we een vereenvoudigd protocol gegeven voor de kwantitatieve proteomics van weefselmonsters. We hebben een buffer met 8 M ureum gebruikt voor het weefsellysaatpreparaat, omdat deze buffer compatibel is met op massaspectrometrie gebaseerd onderzoek. Het is echter verplicht om de peptiden te reinigen om zouten te verwijderen voordat ze in de massaspectrometer worden geïnjecteerd. Een belangrijk punt om te onthouden is om de ureumconcentratie te verlagen tot minder dan 1 M voordat trypsine wordt toegevoegd voor eiwitvertering, omdat trypsine een lage activiteit vertoont bij een ureumconcentratie van 8 M. We hebben twee benaderingen van kwantitatieve wereldwijde proteomics uitgelegd: labelgebaseerde kwantificering met behulp van iTRAQ (isobare tags voor relatieve en absolute kwantificering) en labelvrije kwantificering (LFQ). De op iTRAQ gebaseerde kwantitatieve proteomics wordt voornamelijk gebruikt voor het vergelijken van meerdere monsters die variëren in hun biologische toestand (bijv. Normale versus ziekte of behandelde monsters). De aanpak maakt gebruik van isobare reagentia om de N-terminale primaire amines van peptiden te labelen12. De iTRAQ-reagentia bevatten één N-methyl piperazine reportergroep, een balancergroep en één N-hydroxy succinimide-estergroep die reageert met N-terminale primaire amines van peptiden13. Verteerde peptiden van elke aandoening worden gelabeld met een bepaald iTRAQ-reagens. Na de etikettering wordt de reactie gestopt en worden gelabelde peptiden uit verschillende omstandigheden samengevoegd in een enkele buis. Dit gecombineerde monstermengsel wordt geanalyseerd met een massaspectrometer voor identificatie en kwantificering. Na de MS/MS-analyse worden reporter-ionfragmenten met lage moleculaire massa's gegenereerd en worden de ionenintensiteiten van deze reporterionen gebruikt voor de kwantificering van de eiwitten.

Een andere benadering, labelvrije kwantificering, wordt gebruikt om het relatieve aantal eiwitten in complexe monsters te bepalen zonder peptiden te labelen met stabiele isotopen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd beoordeeld en goedgekeurd door institutionele review boards en de ethische commissie van het Indian Institute of Technology Bombay (IITB-IEC/2016/026). De patiënten/deelnemers hebben hun schriftelijke toestemming gegeven om deel te nemen aan dit onderzoek.

1. Weefsellysaatpreparaat

OPMERKING: Voer alle volgende stappen uit op het ijs om de proteasen inactief te houden. Zorg ervoor dat de scalpels en eventuele gebruikte buizen steriel zijn om kruisbesmetting te voorkomen.

  1. Neem ~30 mg weefsel in een kraalklu, voeg 200 μL 1x fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) toe en vortex het.
    OPMERKING: In deze studie werden vers ingevroren menselijke hersentumorweefsels genomen voor het lysaatpreparaat. Het protocol kan worden gebruikt voor elk vers ingevroren weefsel met enkele veranderingen, afhankelijk van het type weefsels (zachte of harde weefsels) en de cellulaire complexiteit van de weefsels.
  2. Draai daarna aan de buis om het weefsel te laten bezinken en verwijder de PBS voorzichtig met een pipet. Voer nog een PBS-wasbeurt uit als er nog bloedsporen in het weefsel achterblijven.
  3. Voeg 300 μL ureumlysisbuffer (8 M ureum, 50 mM Tris pH 8,0, 75 mM NaCl, 1 mM MgCl2) en proteaseremmercocktail (PIC) toe volgens het protocol van de fabrikant.
    OPMERKING: Het volume van de lysisbuffer moet voldoende zijn om het weefsel tijdens het ultrasoonapparaatproces te malen en om op te schorten wat wordt geëxtraheerd. Te weinig lysisbuffer kan resulteren in inefficiënte weefsellysis, terwijl te veel lysisbuffer het eiwit lysaat zal verdunnen.
  4. Plaats de buis op ijs en soniceer het weefsel met een amplitude van 40% gedurende 2,5 minuten met pulscycli van 5 s (respectievelijk AAN / UIT).
  5. Voeg zirkoniumparels toe aan de buizen en homogeniseer het weefsel met behulp van een kralenklopper gedurende 90 s met 5 minuten incubatie op ijs. Herhaal deze stap twee keer.
  6. Zodra het weefsel voldoende is gehomogeniseerd, incubeer je de buis gedurende 10 minuten op ijs.
  7. Centrifugeer het monster na incubatie gedurende 15 minuten bij 4 °C bij 6,018 x g om het celresten van het supernatant te scheiden.
  8. Verzamel het supernatant in de vers gelabelde tube en bewaar bij -80 °C als aliquots tot verder gebruik.

2. Eiwitkwantificering en kwaliteitscontrole van weefsellysaten

  1. Kwantificeer de eiwitconcentratie in het weefsellysaat met behulp van Bradford's reagens zoals beschreven in het aanvullend dossier 1.
  2. Voer na de eiwitkwantificering 10 μg weefsellysaat uit op een 12% SDS-PAGE-gel om de kwaliteit van het lysaat te controleren.
    OPMERKING: Verdere downstream-verwerking mag alleen worden uitgevoerd voor de lysaten die de kwaliteitscontroles uitvoeren.

3. Enzymatische vertering van eiwitten

OPMERKING: De stappen voor enzymatische spijsvertering zijn weergegeven in figuur 1a.

  1. Neem voor de spijsvertering 50 μg eiwitten en voeg ddH2O toe om het volume op 20 μL te brengen.
  2. Bereid nu 20 mM Tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP) uit de bouillon (0,5 M TCEP) door 0,8 μL uit voorraad toe te voegen aan het eiwit lysaat om de disulfidebindingen in de eiwitten te verminderen en het monster gedurende 60 minuten bij 37 °C te incuberen.
  3. Bereid 40 mM jodoacetamide (IAZ) in ddH2O en voeg 1,6 μL toe om de gereduceerde cysteïneresiduen te alkylaat. Incubeer in het donker gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Voeg een verdunningsbuffer met 25 mM Tris pH 8,0 en 1 mM CaCl2 toe in een verhouding van 1:8 om de ureumconcentratie in het monster te verdunnen tot minder dan 1 M. Controleer op dit punt de pH.
    OPMERKING: Als u trypsine als spijsverteringsenzym gebruikt, zorg er dan voor dat de concentratie ureum lager is dan 1 M.
  5. Om de spijsvertering uit te voeren, voegt u trypsine toe in een enzym/substraatverhouding van 1:50. Incubeer de buizen bij 37 °C in een schuddend droog bad gedurende 16 uur voor een nachtelijke vertering.
    OPMERKING: Het trypsine-enzym is een zeer reactief protease dat gevoelig is voor zelfvertering. Wees extra voorzichtig en voer de toevoeging van trypsine snel uit over het ijs.
  6. Droog na 16 uur incubatie de verteerde peptiden in een vacuümconcentrator.

4. Ontsalting van verteerde peptiden

OPMERKING: Om het ontsalden van peptiden uit te voeren, gebruikt u C18-fasetips.

  1. Activeer de C18-trappunt door 50 μL methanol toe te voegen. Centrifugeer de punt bij 1.000 x g gedurende 2 minuten bij RT. Gooi het filtraat dat op de bodem van de buis is verzameld weg. Herhaal dit twee keer.
  2. Voeg 50 μL acetonitril toe in 0,1% mierenzuur om de podiumpunt te wassen. Centrifugeer de buis bij 1.000 x g gedurende 2 minuten bij RT. Gooi het filtraat dat op de bodem van de buis is opgevangen weg. Herhaal deze stap twee keer.
  3. Voeg 50 μL van 0,1% (v/v) FA toe om de kolom in evenwicht te brengen. Nogmaals, voer de centrifugatie uit bij 1.000 x g gedurende 2 minuten bij RT en gooi het filtraat weg.
  4. Reconstitueer de gedroogde verteerde peptiden in 50 μL van 0,1% mierenzuur.
    OPMERKING: Vermijd luchtbelvorming in de podiumpunten tijdens het passeren van het monster. De fasepunten mogen niet volledig worden gedroogd tijdens de centrifugatiestap, omdat drogen kan leiden tot peptideverlies.
  5. Voeg de gereconstitueerde peptiden toe aan de geactiveerde fasepunt en passeer het monster door de fasepunt door centrifugatie bij 1.000 x g gedurende 2 minuten. Herhaal deze stap minstens vier keer. Bewaar de doorstroom bij 4 °C.
  6. Voeg om het monster te wassen 50 μL mierenzuur van 0,1% (v/v) toe. Herhaal de centrifugatiestap en gooi het filtraat weg.
  7. Voeg voor de elutie van peptiden 50 μL van 40% (v/v) ACN toe in 0,1% mierenzuur (v/v) en passeer het door de punt van het stadium door centrifugatie. Verzamel het filtraat in een verse tube. Herhaal de stap met 50% en 60% ACN in 0,1% mierenzuur en vangt het filtraat op in dezelfde verse buis.
  8. Droog de ontsalde peptiden verzameld in de verse buis met behulp van een vacuümconcentrator.
    OPMERKING: De gedroogde ontsalfde peptiden zijn klaar om te worden geïnjecteerd, of het kan worden bewaard bij -20 °C gedurende 6 maanden. Voor langdurige opslag (>6 maanden), bewaar de peptiden bij -80 °C.

5. Kwantificering van ontsalde peptiden

  1. Reconstitueer de gedroogde ontsalfde peptiden in 0,1% FA.
  2. Veeg de fotometrische meetplaat af met pluisvrij weefsel met 70% ethanol.
  3. Gebruik 2 μL van 0,1% FA om de blanco in te stellen.
  4. Voeg 2 μL gereconstitueerde monsters in replicaties toe aan de plaat.
  5. Plaats de plaat in de spectrofotometer en meet de absorptie bij 205 nm en 280 nm.
  6. Bereken molaire absorptiviteit (ε) met behulp van de volgende formule:
    ε = 27 / [1 - 3,85 * A280 / A205]
    OPMERKING: Molaire absorptie (ε) is een maat voor de waarschijnlijkheid van de elektronische overgang of hoe goed een soort de specifieke golflengte van straling absorbeert die erop wordt invallen. De waarde van ε moet in het bereik liggen van 31 ml mg-1cm-1 tot 33 ml mg-1cm-1. Als de waarde niet in het bereik valt, geeft dit aan dat de monsters niet goed worden verteerd.
  7. Bereken de peptideconcentratie in μg/μL met behulp van de volgende formule:
    Concentratie van peptide = Netto OD (205) / 0,051 * ε

6. Labelvrije kwantificering (LFQ) van de verteerde peptiden

OPMERKING: Gebruik voor labelvrije kwantificering de parameters LC en MS die worden vermeld in het aanvullend bestand 2. Een hoge dekkingsgegevens werden verkregen wanneer drie biologische replicaties van hetzelfde type monster werden uitgevoerd in de massaspectrometer.

  1. Opstelling van vloeistofchromatografie
    1. Na de kwantificering van ontsalde peptiden, neem 2 μg peptiden in een injectieflacon en maak het volume aan tot 10 μL met behulp van 0,1% FA. De concentratie van ontzalfde peptiden zal 200 ng/μL zijn.
    2. Open de auto-sampler van het vloeistofchromatografiesysteem (zie Materiaaltabel)en plaats de injectieflacon in de autosampler.
    3. Gebruik 0,1% (v/v) FA om de voorkolom en de analytische kolom in evenwicht te brengen.
    4. Neem 1 μg ontspit verteerd peptide uit de injectieflacon en laad het op de kolom.
    5. Stel het LC-verloop in op basis van de complexiteit van het monster. In dit experiment werd LC-gradiënt gedurende 120 minuten gebruikt voor labelvrije kwantificering van de weefselmonsters.
  2. MS-opstelling: Voordat u proteomics-assays optimaliseert, voert u een kwaliteitscontrole van het instrument uit door enkele peptiden van Bovine Serum Albumin (BSA) te controleren met behulp van software voor systeemgeschiktheid en het analyseren van de dekking van BSA(Figuur 2A,B). De acquisitieparameters werden in het instrument ingesteld met behulp van de MS-software voor gegevensverzameling (zie tabel met materialen).
    1. Open de software, dubbelklik op Instrument Set Up en selecteer de sjabloon van peptides-ID met standaardparameters.
    2. Stel de MS-parameters in met aanvullend bestand 2 en sla het op als een nieuwe methode.
    3. Open nu de software om de voorbeelddetails in te vullen; dubbelklik op de Sequence Setupen vul de details in zoals sampletype, samplenaam, locatie voor het opslaan van bestanden, instrumentmethodebestand, het injectievolume en de positie van het sample.
    4. Zodra alle informatie is ingevuld, selecteert u de rij en start u de knop Uitvoeren.

7. Label-gebaseerde kwantificering (iTRAQ) van verteerde peptiden

OPMERKING: Labelgebaseerde kwantificering kan worden uitgevoerd met behulp van verschillende isobare labels zoals iTRAQ- of TMT-reagentia, enz. Hier werd iTRAQ 4-plex gebruikt voor het labelen van verteerde peptiden uit drie weefselmonsters. De procedure van iTRAQ 4-plex etikettering wordt hieronder vermeld.

  1. Etikettering van verteerde peptiden met behulp van iTRAQ-reagentia.
    OPMERKING: In dit experiment worden peptiden uit drie weefselmonsters gebruikt. Van elk weefselmonster wordt 80 μg verteerde peptiden in vier buizen genomen voor etikettering met iTRAQ-reagentia (114, 115, 116 en 117) (zie aanvullend dossier 3 voor de gedetailleerde experimentele parameters).
    1. Breng voordat u het iTRAQ-reagens gebruikt elke injectieflacon met het reagens op kamertemperatuur (ongeveer 5 minuten). Geef een korte draai van ongeveer 30 s om de oplossing op de bodem van elke injectieflacon te brengen.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat in elke injectieflacon 10-15 μL oplossing aanwezig moet zijn.
    2. Voor iTRAQ-etikettering reconstitueer je de gedroogde peptiden in 20 μL oplossingsbuffer in de iTRAQ-etiketteringskit.
    3. Reconstitueer de etiketten door 70 μL ethanol uit de injectieflacon in de kit toe te voegen en meng de oplossing gedurende 30 s en draai deze gedurende 10 s.
      OPMERKING: Het is raadzaam dat alle stappen worden uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant.
    4. Voeg de homogeen gemengde iTRAQ-labels (114, 115, 116 en 117) toe aan hun respectievelijke buizen met peptidemonsters en laat de etiketteringsreactie plaatsvinden.
    5. Meng de componenten van elke buis door de buis gedurende 30 s te vortexen en draai vervolgens de buis gedurende 10 s om het mengsel terug naar de bodem van de buis te brengen.
      OPMERKING: Controleer de pH van de oplossing met pH-papier. de pH moet hoger zijn dan 8; zo niet, voeg dan tot 10 μL van de oplossingsbuffer toe om de pH aan te passen.
    6. Incubeer elke buis bij kamertemperatuur gedurende 90 minuten. Doof aan het einde van de reactie overtollig ongebonden label in de buis door water van MS-kwaliteit toe te voegen.
    7. Incubeer de buizen bij kamertemperatuur gedurende 30 min tot 1 uur.
    8. Zodra de incubatie voorbij is, breng je alle gelabelde inhoud over in een enkele buis en droog je de gelabelde peptiden in een vacuümconcentrator.
      OPMERKING: Een vergelijkbare etiketteringsprocedure kan worden gevolgd voor TMT-etikettering.
  2. Opstelling van vloeistofchromatografie
    1. Reconstitueer de monsters in 0,1% mierenzuur, open de autosampler van nano-LC en plaats de monsters in de autosampler. Gebruik de parameters die worden vermeld in Aanvullend bestand 2 voor het instellen van LC.
    2. Stel het LC-verloop in op basis van de complexiteit van het monster. In dit experiment werd een LC-gradiënt van 180 minuten gebruikt voor labelgebaseerde kwantificering (iTRAQ) van de weefselmonsters.
      OPMERKING: Voor minder complexe monsters kan een korte gradiënt de meeste peptiden efficiënt scheiden. Als het monster echter erg complex is, gebruik dan een langere gradiënt voor een betere scheiding van peptiden.
  3. MS setup voor iTRAQ techniek
    1. Stel alle MS-parameters voor op etiketten gebaseerde kwantificering op dezelfde manier in als gebruikt voor de labelvrije kwantificering, behalve voor de botsingsenergie, die was ingesteld op 35 % voor MS/MS-fragmentatie in de op etiketten gebaseerde kwantificering.

8. Data-analyse

  1. Analyseer de ruwe (MS /MS spectrum) bestanden verkregen van LC-massaspectrometer met behulp van een commercieel beschikbare analysesoftware (zie Tabel met materialen).
    OPMERKING: De Human Reference Proteome-database van Uniprot (UP000005640) bestaande uit 71.785 eiwitsequenties werd gebruikt om eiwitidentiteiten te verkrijgen met behulp van Sequest HT en Mascot (v2.6.0) zoekmachines. De parameters voor labelvrije kwantificering en labelgebaseerde kwantificering worden beschreven in aanvullend dossier 4.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben twee verschillende benaderingen gebruikt voor ontdekkingsproteomics: labelvrije en labelgebaseerde proteomics-benaderingen. Het eiwitprofiel van weefselmonsters op SDS-PAGE toonde de intacte eiwitten en kon in aanmerking komen voor proteomische analyse(figuur 2A). De kwaliteitscontrole van het instrument werd gemonitord via systeemgeschiktheidssoftware en toonde de dagelijkse variatie in de instrumentprestaties(figuur 2B). We zagen 91% sequent...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Weefselproteomica van biologische monsters stelt ons in staat om nieuwe potentiële biomarkers te verkennen die verband houden met verschillende stadia van ziekteprogressie. Het verklaart ook het mechanisme van signalering en routes geassocieerd met ziekteprogressie. Het beschreven protocol voor weefsel kwantitatieve proteomics analyse biedt reproduceerbare goede dekkingsgegevens. De meeste stappen zijn aangepast aan de instructies van de fabrikant. Om gegevens van hoge kwaliteit te verkrijgen, zijn de volgende stappen he...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We erkennen MHRD-UAY Project (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), project #34_IITB SS en MASSFIITB Facility in IIT Bombay ondersteund door het Department of Biotechnology (BT / PR13114 / INF / 22/206/2015) om alle MS-gerelateerde experimenten uit te voeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagentia
Acetonitrile (MS-kwaliteit)Fisher ScientificA/0620/21
Bovien Serum AlbumineHiMediaTC194-25G
CalciumchlorideFischer ScienificBP510-500
Mierenzuur (MS-kwaliteit)Fisher Scientific147930250
IodoacetamideSigma1149-25G
Isopropanol (MS-kwaliteit)Fisher ScientificQ13827
MagnesiumchlorideFischer ScienificBP214-500
Methanol (MS-kwaliteit)Fisher ScientificA456-4
MS-kwaliteit waterPierce51140
Fosfaat Buffer SalineHiMediaTL1006-500ML
Protease inhibitor cocktailRoche Diagnostics11873580001
NatriumchlorideMerckDF6D661300
TCEPSigma646547
Tris BaseMerck648310
Trypsine (MS-kwaliteit)Pierce90058
Bradford ReagentBio-Rad5000205
UreaMerckMB1D691237
Benodigdheden
Hypersil Gold C18 kolomThermo25002-102130
MicropipettenGilsonF167380
Stage tipsMilliPoreZTC18M008
Zirconia/Silica kralenBioSpec producten11079110z
Apparatuur
Bead beater (Homogenisator)Bertin MinilysP000673-MLYS0-A
Microplate reader (spectrofotometer)ThermoMultiSkan Go
pH meterEutechCyberScan pH 510
Probe SonicatorSonics Materials, IncVCX 130
Shaking DrybathThermo88880028
Orbitrap Fusion massaspectrometerThermoFSN 10452
Nano LCThermoEASY-nLC1200
Vacuum concentratorThermoSavant ISS 110
Software
Proteome DiscovererThermoProteome Discoverer 2.2.0.388

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Petricoin, E., Wulfkuhle, J., Espina, V., Liotta, L. A. Clinical proteomics: revolutionizing disease detection and patient tailoring therapy. Journal of Proteome Research. 3 (2), 209-217 (2004).
  2. Geho, D. H., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. Blasting into the microworld of tissue proteomics: a new window on cancer. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 10 (3), 825-827 (2004).
  3. Hashimoto, Y., Greco, T. M., Cristea, I. M. Contribution of mass spectrometry-based proteomics to discoveries in developmental biology. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1140, 143-154 (2019).
  4. Faria, S. S., et al. A timely shift from shotgun to targeted proteomics and how it can be groundbreaking for cancer research. Frontiers in Oncology. 7, 13(2017).
  5. Ray, S., et al. Proteomic technologies for the identification of disease biomarkers in serum: advances and challenges ahead. Proteomics. 11 (11), 2139-2161 (2011).
  6. Chen, E. I., Yates, J. R. Cancer proteomics by quantitative shotgun proteomics. Molecular Oncology. 1 (2), 144-159 (2007).
  7. Geyer, P. E., Holdt, L. M., Teupser, D., Mann, M. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942(2017).
  8. Ray, S., et al. Proteomic analysis of Plasmodium falciparum induced alterations in humans from different endemic regions of India to decipher malaria pathogenesis and identify surrogate markers of severity. Journal of Proteomics. 127, 103-113 (2015).
  9. Ray, S., et al. Clinicopathological analysis and multipronged quantitative proteomics reveal oxidative stress and cytoskeletal proteins as possible markers for severe vivax malaria. Scientific Reports. 6, 24557(2016).
  10. Sharma, S., et al. Multipronged quantitative proteomic analyses indicate modulation of various signal transduction pathways in human meningiomas. Proteomics. 15 (2-3), 394-407 (2015).
  11. Sharma, S., Ray, S., Moiyadi, A., Sridhar, E., Srivastava, S. Quantitative proteomic analysis of meningiomas for the identification of surrogate protein markers. Scientific Reports. 4, 7140(2014).
  12. Aslam, B., Basit, M., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. Proteomics: Technologies and their applications. Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).
  13. Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research. Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).
  14. Rudnick, P. A., et al. A description of the Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) common data analysis pipeline. Journal of Proteome Research. 15 (3), 1023-1032 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Proteomics met massaspectrometrievoorbereiding van weefselmonsterslabelvrije kwantificeringlabelgebaseerde kwantificeringiTRAQ labelingOrbitrap FusionLC MS analyseprote nedigestiepeptide ontziltingbiomarker ontdekking

Gerelateerde artikelen