De genetisch trekbare nematode Caenorhabditis elegans kan worden gebruikt als een eenvoudig en goedkoop model voor het ontdekken van geneesmiddelen. Hier wordt een protocol beschreven om antikankertherapieën te identificeren die de downstream signalering van RAS- en EGFR-eiwitten remmen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Identificatie van EGFR- en RAS-remmers met Caenorhabditis elegans
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De veranderingen in de plasmamembraanlokalisatie van de epidermale groeifactorreceptor (EGFR) en de downstream-effector RAS zijn betrokken bij verschillende ziekten, waaronder kanker. De vrijlevende nematode C. elegans bezit een evolutionaire en functioneel geconserveerde EGFR-RAS-ERK MAP signaalcascade die centraal staat voor de ontwikkeling van de vulva. Toename van functiemutaties in RAS-homologe LET-60 en EGFR-homolog LET-23 induceert de generatie van zichtbare niet-functionele ectopische pseudovulva langs de ventrale lichaamswand van deze wormen. Eerder is aangetoond dat het multivulvale (Muv) fenotype in deze wormen wordt geremd door kleine chemische moleculen. Hier beschrijven we een protocol voor het gebruik van de worm in een vloeistofgebaseerde test om remmers te identificeren die de activiteiten van EGFR- en RAS-eiwitten afschaffen. Met behulp van deze test tonen we R-fendiline, een indirecte remmer van K-RAS, onderdrukt het Muv fenotype uitgedrukt in de let-60(n1046) en let-23(sa62) mutant wormen. De test is eenvoudig, goedkoop, is niet tijdrovend om in te stellen en kan worden gebruikt als een eerste platform voor de ontdekking van antikankertherapieën.
Inleiding
De cellulaire paden die ontwikkelingsgebeurtenissen in organismen reguleren, zijn sterk geconserveerd onder alle metazoën. Een van die routes is de EGFR-RAS-ERK mitogen activated protein kinase (MAPK) signaleringscascade, een kritieke route die de celproliferatie, differentiatie, migratie en overlevingregelt 1,2. Defecten in dit signaleringstraject kunnen leiden tot pathologische of ziektetoestanden zoals kanker. De epidermale groeifactorreceptor (EGFR) is sterk uitgedrukt in menselijke tumoren, waaronder 50% van orale plaveiselcelcarcinomen, en draagt bij aan de ontwikkeling van kwaadaardige tumoren
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Nematoden groeimedium (NGM) plaatvoorbereiding
- Voeg 2,5 g pepton en 3 g NaCl toe aan 970 ml gedeïoniseerd water in een 2 L Erlenmeyer. Roer de inhoud met behulp van een magnetische roerstaaf. Voeg daarna 20 g agar toe aan de kolf. Autoclaaf de inhoud van de kolf bij 121 °C en een druk van 15 lb/in2 gedurende 30 min. Plaats de kolf na sterilisatie op een roerplaat en laat het medium afkoelen tot de temperatuur 50 °C bereikt.
- Om de NGM-platen te bereiden, voegt u de volgende reagentia toe aan het gekoelde medium: 25 ml kaliumfosfaatbuffer van 1 M (pH = 6,0), 1 ml van 1 M MgSO4, 1 ml van 1 M CaCl2, 1 ml (5 mg/ml in ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We tonen eerst aan dat R-fendiline in staat is om het Muv fenotype te onderdrukken in de let-60(n1046) mutant stam in vergelijking met de DMSO behandelde wormen. Onze gegevens tonen aan dat R-fendiline in staat is om het Muv fenotype in de let-60(n1046) op een dosisafhankelijke manier te blokkeren (Figuur 2A,B). Echter, niet-omkering van het Muv fenotype werd waargenomen in de lin-1 null mutant stam als reactie op toenemende concentraties van R-fen.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De test die we beschrijven met behulp van de worm zijn eenvoudig en goedkoop om remmers van EGFR en RAS-functie te identificeren. C. elegans is een aantrekkelijk model voor het ontdekken van geneesmiddelen omdat het gemakkelijk te kweken is in het lab vanwege de korte levenscyclus (3 dagen bij 20 °C) en het vermogen om grote aantallen larven te genereren. Wat nog belangrijker is, de EGFR-RAS-ERK MAPK-route is evolutionair en functioneel geconserveerd met zoogdieren die een genetisch tracteerbaar systeem bieden o.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
We danken Dr. Swathi Arur (MD Anderson Cancer Center) voor het leveren van de let-60(n1046). We danken ook Dr. David Reiner (Texas A&M Health Science Center Institute of Biosciences &Technology in Houston) voor de lin-1 soort. Tot slot bedanken we Dr. Danielle Garsin en haar lab (De Universiteit van Texas, McGovern Medical School) voor het verstrekken van enkele van de reagentia. Sommige wormstammen werden geleverd door de CGC, die wordt gefinancierd door NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Dit onderzoek werd ondersteund door de Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) subsidie RP200047 aan JF Hancock.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Media en chemicaliën | |||
| Agarose | Millipore Sigma | A9539-50G | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium pPhosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| R-Fendiline | Commercieel Gesynthetiseerd (Farmaceutische kwaliteit) | ||
| Sodium Azide | Millipore Sigma | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | Bleach | ||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| (−)-Tetramisole Hydrochloride | Millipore Sigma | L9756 | |
| UO126 (MEK remmer) | Millipore Sigma | 19-147 | |
| Consumables | |||
| 15mL Conische Steriele Polypropyleen Centrifugebuizen | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| 50mL Conische Steriele Polypropyleen Centrifugebuizen | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| Weggeef Polystyreen Serologische Pipetten 10mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Weggeef Polystyreen Serologische Pipetten 25mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| No. 1.5 18 mm X 18 mm Dekglas | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petrischaal met Heldere Deksel (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petrischalen met Heldere Deksel (100X15mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Vlakke Glazen Microscoopglazen (75 x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| 12- Well Tissue Cultuur Platen | Fisher Scientific | 50-197-4804 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterie Stammen | |||
| E. coli OP50 | |||
| Worm Stammen | |||
| Stamm | Genotype | Transgene | Bron |
| MT2124 | let-60(n1046) IV. | CGC | |
| MT7567 | lin-1(sy254) IV. | CGC | |
| PS1839 | let-23(sa62) II. | CGC |
Referenties
- Marshall, M. Interactions between Ras and Raf: key regulatory proteins in cellular transformation. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 493-499 (1995).
- Whelan, J. T., Hollis, S. E., Cha, D. S., Asch, A. S., Lee, M. H.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
