Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Blootstelling aan sigarettenrook bij muizen met behulp van een inhalatiesysteem voor het hele lichaam

7.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61793

⸱

22 oktober 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Program in Immunology, Baylor College of Medicine, 2Department of Pediatrics, Section of Infectious Diseases, Baylor College of Medicine, 3Department of Medicine - Immunology Allergy and Rheumatology, Baylor College of Medicine, 4Department of Medicine, Pulmonary, Critical Care, Sleep Medicine, Baylor College of Medicine, 5Department of Pathology and Immunology, Baylor College of Medicine, 6Department of Pediatrics, Research and Department of Epigenetics and Molecular Carcinogenesis, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 7Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 8Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID), Michael E. DeBakey VA Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol toont de studie van de pathofysiologische effecten van sigarettenrook (CS) met een in eigen huis gebouwd inhalatiesysteem (WBI) voor het hele lichaam (WBIS). Dit systeem kan dieren blootstellen aan CS onder gecontroleerde herhaalbare omstandigheden voor onderzoek naar CS-gemedieerde effecten op longemfyseem en hematopoiese.

Samenvatting

Bijna 14% van de volwassenen in de Verenigde Staten zou in 2018 sigaretten roken. De effecten van sigarettenrook (CS) op longen en hart- en vaatziekten zijn uitgebreid bestudeerd, maar de impact van CS in andere weefsels en organen zoals bloed en beenmerg blijft onvolledig gedefinieerd. Het vinden van het juiste systeem om de effecten van CS bij knaagdieren te bestuderen kan onbetaalbaar zijn en vereist de aankoop van commercieel beschikbare systemen. Daarom wilden we een betaalbaar, betrouwbaar en veelzijdig systeem bouwen om de pathologische effecten van CS bij muizen te bestuderen. Deze opstelling van het hele lichaam inhalatieblootstellingssysteem (WBIS) bootst het ademen en puffen van sigaretten na door afwisselend blootstelling aan CS en schone lucht. Hier laten we zien dat dit doe-het-zelf (DIY) systeem luchtwegontsteking en longemfyseem veroorzaakt bij muizen na 4 maanden blootstelling aan sigarettenrook. De effecten van inademing van cs (WBI) in het hele lichaam op hematopoëtische stamcellen en voorlopercellen (HSPCs) in het beenmerg met behulp van dit apparaat worden ook aangetoond.

Inleiding

Het roken van sigaretten blijft een van de belangrijkste oorzaken van vermijdbare ziekten in de VS, ondanks de gestage daling van het aantal volwassenen dat sigaretten rookt in de afgelopen 50-60 jaar1. Het is algemeen bekend dat roken verband houdt met meerdere ziekten van de longen en het bloed, waaronder chronische obstructieve longziekte (COPD), een groep ziekten die emfyseem en chronische bronchitis2,3,4omvat . Volgens het Center for Disease Control (CDC) was COPD in 2014 de derde belangrijkste doodsoorzaak in de Verenigde Staten met meer dan 15 miljoen Amerikanen die aan deze ziekte leden5.

CS is onlangs ook geassocieerd met een hoger risico op het ontwikkelen van klonale hematopoiese (CH)6,7, een aandoening waarbij een enkele hematopoëtische stamcel onevenredig een groot percentage van iemands perifere bloed produceert. Deze bevinding wijst op een mogelijk verband tussen roken en beenmergfunctie. Gezien de wijdverbreide en zeer significante gevolgen voor de gezondheid van CS en gezien het feit dat muriene modellen van ziekten een hoeksteen zijn van de vooruitgang in biomedisch onderzoek, is het nuttig om efficiënte en betaalbare systemen te ontwikkelen om CS bij muizen te modelleren.

Hier bieden we een stapsgewijze handleiding voor het bouwen van een betaalbaar systeem voor de behandeling en studie van de in vivo effecten van CS op longemfyseem en beenmerghomeostase. De assemblage van deze apparatuur vereist niet dat de gebruiker gespecialiseerde kennis heeft en maakt dus zelfmontage mogelijk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dieren die betrokken zijn bij de experimenten en de ontwikkeling van deze techniek zijn onder ons diergebruiksprotocol goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) en onder Baylor College of Medicine en MD Anderson-instellingen die zijn geaccrediteerd door de Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC).

1. Bouw van het apparaat

  1. Montage van de luchtcompressor met het ventielsysteem.
    1. Sluit de flowmeters (twee 15 L/min met Y bar en 2 power takeoffs) aan op de miniatuur drukregelaar met behulp van een 1/8 inch schroefdraad mannelijke adapter nippel fitting. Zorg ervoor dat u de draadafdichtingstape in alle draadeinden gebruikt.
    2. Sluit de gemonteerde drukregelaar met de debietmeter aan op het medische luchtcompressorinstrument met behulp van het volgende: een 1/8 inch zeskantnippel op de luchtuitlaat van de compressor, een 1/8 inch schroefdraadkoppeling en een 1/8 inch schroefdraad mannelijke adapternippelfitting die verbinding maakt met de drukregelaar.
    3. Installeer de zuurstof draaibare prikkeldraadconnector op elke (4) flowmeter.
    4. Installeer een mannelijke adapter op de bovenste luchtuitlaat van de luchtcompressor (onderdeel meegeleverd met het instrument voor medische luchtcompressor).
  2. Montage van blootstellingskamers (maak 4 eenheden)
    1. Snijd een 3/4 inch gechloreerde polyvinylchloride (CPVC) pijp in acht 4 inch segmenten.
    2. Plaats elk segment op een 3/4 inch 90° elleboog CPVC fitting en bevestig de fitting kant van de elleboog aan een 3/4 inch diameter CPVC mannelijke adapter. Er moeten acht CPVC-segmenten zijn, elk bevestigd aan één CPVC-elleboogfitting en één CPVC-mannelijke adapter.
    3. Boor twee gaten (1 1/4 inch diameter) aan tegenovergestelde zijden die het verst van elkaar verwijderd zijn van een luchtdichte container van 8,5 L (11,25 x 7,75 x 6 inch) met een deksel (zie figuur 1 belichtingskamer). De positionering van de gaten moet van boven naar beneden en van links naar rechts worden gecentreerd.
    4. Plaats de schroefdraadzijden van de CPVC-adapter die eerder zijn gemonteerd in elk gat in de containers.
    5. Bevestig aan de andere kant een 3/4 inch CPVC-dop (kamerrookingang) en aan de ene kant een 3/4 inch CPVC Drip irrigatie-vrouwelijke adapter (kamerrookuitgang).
    6. Boor vijf gaten van 3 mm aan de bovenkant van de CPVC-dop van de rookafgifte van de kamer in een quincunx (douchekop) patroon. Hierdoor kan de sigarettenrook met een hogere snelheid de kamer binnenkomen en zorgt ervoor dat deze zich in alle richtingen gelijkmatig in de kamer verspreidt.
  3. Het assembleren van sigarettenkamers (maakt tot 4 muriene blootstellingseenheden)
    1. Neem een rubberen stop met één gat (fabrikantmaat 8.5) en plaats een 1/4 inch Y-connector met weerhaken aan de bredere kant en een rechte fitting met weerhaken (opening van 8 mm) aan de smallere kant. De sigaret wordt hier geplaatst tijdens de rookprocedure (sigarettenonderstel).
    2. Sluit het ene uiteinde van een 12 inch lange vinylbuis van medische kwaliteit aan op een van de connectoren met weerhaken op de Y-connector die aan de rubberen stop is bevestigd en het andere uiteinde op een 1/4 inch fitting en plaats de andere kant van deze fitting op een rubberen stop met één gat (fabrikantmaat 1).
    3. Plaats op een andere rubberen stop (fabrikantmaat 8.5) een 1/4 inch rechte slangconnector aan de bredere kant van de stop en sluit het buitenste uiteinde van de fitting aan op een 7 ft vinylpijp van medische kwaliteit.
    4. Sluit de twee rubberen stopconstructies die eerder in stap 1.3.1–1.3.3 zijn gemonteerd aan op een glazen cilinder van 8 inch x 1,75 inch uit een glazen afvoerbuis van het laboratorium.
  4. Klepbesturingssysteem
    1. Het systeem wordt aangestuurd door een ritmische opening en sluiting van magneetventielen die inademing (puffen) van sigarettenrook en schone lucht simuleren. Het systeem dat de magneetventielen aanberegelt is commercieel ontworpen (zie Tabel met materialen).
  5. Alle componenten samen monteren (zie figuur 1)
    1. Monteer vier magneetventielen aan de zijkanten van het klepbesturingssysteem met behulp van 1 inch bevestigingsmiddelen.
    2. Sluit de magneetventielen aan op het klepbesturingssysteem volgens de instructies van de fabrikant.
    3. Bevestig een rechte connector met schroefdraad van 10–32 (M) op de uitlaataansluiting ("EXH") op de magneetklep en een schroefdraadpoortadapter op de aansluitingen "IN" en "OUT" van dezelfde magneetklep.
    4. Sluit de debietmeter die aan de compressor is bevestigd aan op de magneetklep via de "OUT"-aansluiting met behulp van een 7 ft vinylslang van medische kwaliteit.
    5. Sluit de 7 ft vinylbuis gemonteerd aan met de rubberen stop in stap 1.3.3. op de "IN"-connector op de magneetklep.
    6. Plaats de kleine rubberen stop van de sigarettenkamer op de rooktoevoer van de kamer.
    7. Sluit de magneetklep aan op de tweede aansluiting van de Y-connector met weerhaken op het in stap 1.3.1 gemonteerde sigarettenonderstel.

figure-protocol-1
Figuur 1: Schematische weergave van de verbindingen van onze WBIS voor blootstelling aan CS. Deze figuur laat zien hoe alle componenten worden geassembleerd tot een werkend apparaat. De afbeelding toont slechts één geassembleerde rookkamer van de vier die de machine kan bedienen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

2. Blootstelling aan sigarettenrook

LET OP: Vermijd blootstelling aan sigarettenrook uit de tweede en derde hand. Sigaretten- en blootstellingskamers moeten worden gebruikt in een klasse II type B2 laminaire stroom biologische veiligheidskasten. Tijdens het uitvoeren van de rookblootstellingsexperimenten (d.w.z. maskers, handschoenen, haarnet, toga) moet een goede PBM worden gedragen.

  1. Druk en luchtstroom instellen
    1. Zodra alle onderdelen zijn gemonteerd zoals weergegeven in figuur 1,schakelt u de luchtcompressor in en wacht u tot het veiligheidsalarm vanzelf wordt uitgeschakeld.
    2. Stel de druk van de luchtcompressor in op 40-50 psi door aan de knop op de drukregelaar te draaien.
    3. Stel de luchtstroom van de luchtcompressor in op 5 L met behulp van de debietmeter.
    4. Zet de klepregelaar aan.
    5. Stel de digitale timer op de klepregelaar in op de PULSE-C (op het display weergegeven als "Pu-c") bedrijfsmodus door op de SET/LOCK-toets te drukken terwijl u de UP-toets op het eerste cijfer van de timer ingedrukt houdt. Druk vervolgens op de UP-toets totdat de Pu-c-modus is bereikt. Druk op de RESET-toets om de weergegeven bedrijfsmodus (d.w.z. Pu-C) in te stellen als werkmodus.
    6. Druk op de SET/LOCK om timer 1 te wijzigen (op het display weergegeven als "T1").
    7. Druk op de toetsen UP of DOWN om de T1 in te stellen op 20 s.
    8. Druk op de SET/LOCK om timer 2 te wijzigen (op het display weergegeven als "T2").
    9. Druk op de toetsen UP of DOWN om de T2 in te stellen op 3 s.
      OPMERKING: De stappen 2.1.5 tot en met 2.1.9 zijn afgestemd op het gebruik met de specifieke timer (zie materiaaltabel). Raadpleeg de bijbehorende gebruikershandleiding voor verdere instructies over ander gebruik van dit product.
  2. De rookbehandeling van de sigaret
    OPMERKING: Dit systeem maakt het gebruik van 1-4 muriene blootstellingskamers tegelijkertijd mogelijk.
    1. Schakel de luchtcompressor in en wacht tot het veiligheidsalarm vanzelf af gaat.
    2. Zet de klepregelaar aan.
    3. Breng 5 muizen over in elk van de vier blootstellingskamers met luchtdichte verwijderbare deksels met een volume van 8,5 L. Plaats de vier blootstellingskamers met muizen binnen een klasse II Type B2 Laminaire Stroom Biologische Veiligheidskasten.
    4. Binnen de laminaire stroom biologische veiligheidskast, steek een sigaret op en steek de sigaret binnen van de sigaretkamer in. Gebruik in de handel verkrijgde sigaretten die 15 mg/cig teer en 1,1 mg/cig nicotine8 bevatten in vergelijking met Kentucky 3RF4 onderzoekssigaretten (9,5 mg/cig teer en 0,73 mg/cig nicotine)9.
    5. Schakel de kleppen op de klepregelaar in die overeenkomen met de kamers die momenteel in gebruik zijn. De blootstelling is verdeeld in 2 fasen: (T1) schone lucht wordt gedurende 20 s in de blootstellingskamer gepompt en (T2) luchtstroom zorgt ervoor dat de sigaret brandt en rook uit de sigarettenkamer gedurende 3 s in de blootstellingskamer wordt gepompt. Laat de sigaret volledig uitbranden totdat deze het filter bereikt.
      1. Pas de timerinstellingen aan om gemiddeld ~ 10 rookwolken / sigaretten uit te voeren over een periode van ~ 4 minuten. Merk op dat de timer en het systeem gemakkelijk kunnen worden aangepast voor het verbeteren of verlagen van het CS-doseringsregime volgens de onderzoeksbehoeften van de onderzoekers.
    6. Verwijder het sigarettenfilter en gooi het weg door de sigarettenpeuk in een glazen beker met water te plaatsen om de vlam te doven en de geur te dempen.
    7. Zorg ervoor dat de sigarettenkamer weer gesloten is en zonder sigaret. Laat de machine 10 minuten lucht reinigen. Het is van het grootste belang om de gewervelde dieren die aan CS worden blootgesteld, voortdurend in de gaten te houden. Dit blootstellingsregime is geoptimaliseerd voor 5 vrouwelijke muizen ouder dan 9 weken per blootstellingskamer.
    8. Herhaal stap 2.3.4 tot en met 2.3.7 driemaal voor in totaal 4 sigaretten per kamer per dag. Deze procedure wordt 5 dagen per week herhaald zolang de onderzoeker nodig heeft voor hun experimenten.
    9. Verwijder de muizen uit de blootstellingskamers terug in hun overeenkomstige kooien.
    10. Schakel de klepregelaar en de luchtcompressor uit.
    11. Verwijder de blootstellings- en sigarettenkamers en was met water en zeep om eventuele resten van teer te verwijderen.
    12. Laat de kamers volledig drogen voordat u ze opnieuw gebruikt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een van de belangrijkste kenmerken van CS-blootstelling is emfyseem dat wordt gekenmerkt door de schade en vernietiging van luchtzakken (longblaasjes) in de long. De eerste experimenten richtten zich dus op het vermogen van het doe-het-zelfsysteem om emfysemateuze veranderingen in de longen van vrouwelijke muizen uit te lokken bij herhaalde blootstelling van het hele lichaam aan CS. Het CS-doseringsschema werd gekozen op basis van onze eerdere publicaties waarin we het hier beschreven doe-het-zelfsysteem gebruikten om mu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier verstrekken we de informatie die nodig is voor de bouw van een apparaat voor WBIS van muizen aan CS. Na installatie van het systeem is het van cruciaal belang dat onderzoekers het systeem kalibreren op basis van de geleverde dosis nicotine of cotinine bij dieren. Het apparaat bevat een timer en manometers die kunnen worden gebruikt om het rookwolkvolume, de rookfrequentie, de gecombineerde rookblootstellingsperiode en rustintervallen die dieren tussen elke sigaret ontvangen, aan te passen. Bovendien kan het werkelij...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Dankbetuigingen

AR, XH en PE werden ondersteund door NIH-subsidie R01HL140398 en een Gilson Longenbaugh Foundation-subsidie. DEMM en KK werden ondersteund door de NIH-subsidies R01HL136333 en R01HL134880 (KYK) en een subsidie van de Helis Medical Research Foundation. DEMM wordt ook ondersteund door de Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Gilliam Fellowship for Advanced Study. PE wordt ook ondersteund door training in precision environmental health sciences NIEHS T32 ES027801 Fellowship Program. JC en MF worden ondersteund door Tobacco Research Funds van het Department of Epigenetics and Molecular Carcinogenesis en door het Center for Epigenetics (Scholar Award to MF) bij MD Anderson. FK en YZ worden ondersteund door NIH-subsidies R01 ES029442-01 en R01 AI135803-01 en VA Merit-subsidie CX000104. Dit project werd ondersteund door de Cytometrie- en Celsorteerkern van het Baylor College of Medicine met financiering van de CPRIT Core Facility Support Award (CPRIT-RP180672), de NIH (CA125123 en RR024574) en de hulp van Joel M. Sederstrom.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 in fastenerLowes756990
1/4 in Barbed Y connectorVWR89093-282
1/4 in straight tubing connectorVWR62866-378
1/8 hex nippleLowes877221
1/8 in threaded coupling fittingLowes877208
1/8 in threaded male adapter nipple fittingLowes877243
10/32 (M) threaded straight connectorBimbaEB60
3/4 in 90-degree elbow CPVC fittingLowes22643
3/4 in chlorinated polyvinyl chloride (CPVC) pipeLowes23814
3/4 in CPVC capLowes23773
3/4 in CPVC Drip irrigation female adapterLowes194629
3/4 in diameter CPVC male adapterLowes23766
8.5 L airtight container with lid (11.25in x 7.75in x 6 in)KomaxN/AVermeld als "Komax Biokips Large Bread Box | (280-oz) Large Storage Container"
Glass drain tube (1.75 in diameter x 8 in length)KIMAX6500
Isonic Solenoid ValvesBimbaV2A02-AW1
Marlboro Red 100'sMarlboroN/A
Oxygen swivel barbed connectorGlobal Medical SolutionsRES002
Panasonic Timer LT4H-WPanasonicLT4HWItem was built-in the valve controller by Shepherd Controls & Associates
Pressure regulatorAllied Electronics and Automation70600552Ook vermeld als "Norgren R07-100-RGKA"
Rubber stopper # 1 (one hole)VWR59581-163
Rubber stopper # 8.5 (one hole)VWR59581-389
Scireq inExpose systemScireq and Emka TechnologiesN/ACommercieel systeem gebruikt voor vergelijking met onze DIY WBIS
Straight barbed fitting (8mm opening)VWR10028-872
Thread Sealant tapeLowes1184243
Threaded port adaptorBimbaP1SA1
Timeter Aridyne 2000 Medical Air CompressorMFI MedicalAHC-TE20
Timeter flowmeterAllied Healthcare Products15006-03YP2Ook vermeld als "Puritan Air Meter"
Valve Control systemShepherd Controls and AssociatesN/ABedrijf ontwierp op maat het klepregelsysteem voor dit model.
Vinyl pipesVitality MedicalRES3007

Referenties

  1. Current Cigarette Smoking Among Adults in the United States. Center for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/tobacco/data_statistics/fact_sheets/adult_data/cig_smoking/index.htm (2018).
  2. Salvi, S. Tobacco smoking and evironmental risk factors for chronic obstructive pulmonary disease. Clinics in Chest Medicine. 35, 17-27 (2014).
  3. Sunyer, J., et al. Longitudinal relation between smoking and white blood cells. American Journal of Epidemiology. 144, 734-741 (1996).
  4. Freedman, D. S., Flanders, D., Barboriak, J. J., Malarcher, A. M., Gates, L. Cigarette smoking and leukocyte subpopulations in men. Annals of Epidemiology. 6, 299-306 (1996).
  5. Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD). Center for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/copd/basics-about.html (2019).
  6. Genovese, G., et al. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence. New England Journal of Medicine. , (2014).
  7. Steensma, D. P. Clinical implications of clonal hematopoiesis. Mayo Clinic Proceedings. 93, 1122-1130 (2018).
  8. Tobacco. Federal Trade Comission. , Available at: . Accessed: 4th (2020).
  9. 3R4F Cigarettes. University of Kentucky - College of Agriculture Food and Environment. , Available from: https://ctrp.uky.edu/products/gallery/Reference Cigarettes/detail/936 (2020).
  10. Shan, M., et al. Cigarette smoke induction of osteopontin (SPP1) mediates T H 17 inflammation in human and experimental emphysema. Science Translational Medicine. 4, 1-10 (2012).
  11. Yuan, X., et al. Activation of C3a receptor is required in cigarette smoke-mediated emphysema. Nature Mucosal Immunology. 8, 874-885 (2014).
  12. Yuan, X., et al. Cigarette smoke - induced reduction of C1q promotes emphysema. JCI Insight. 4, 1-17 (2019).
  13. Shan, M., et al. Agonistic induction of PPAR g reverses cigarette smoke - induced emphysema Find the latest version: Agonistic induction of PPAR γ reverses cigarette smoke - induced emphysema. Journal of Clinical Investigation. 124, 1371-1381 (2014).
  14. Hong, M. J., et al. Protective role of gd T cells in cigarette smoke and influenza infection. Nature Mucosal Immunology. 11, 834-908 (2018).
  15. Kim, M., et al. Cigarette smoke induces intestinal inflammation via a Th17 cell-neutrophil axis. Frontiers in Immunology. 10, 1-11 (2019).
  16. Lu, W., et al. The microRNA miR-22 inhibits the histone deacetylase HDAC4 to promote T H 17 cell - dependent emphysema. Nature Immunology. 16, 1185-1194 (2015).
  17. Hendrix, A. Y., Kheradmand, F. The Role of Matrix Metalloproteinases in Development, Repair, and Destruction of the Lungs. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 148, Elsevier Inc. (2017).
  18. Siggins, R. W., Hossain, F., Rehman, T., Melvan, J. N., Welsh, D. A. Cigarette smoke alters the hematopoietic stem cell niche. Med Sci. 2, 37-50 (2014).
  19. Kheradmand, F., You, R., Gu, B. H., Corry, D. B. Cigarette smoke and DNA cleavage promote lung inflammation and emphysema. Transactions of the American Clinical and Climatological Association. 128, 222-233 (2017).
  20. Ha, M. A., et al. Menthol attenuates respiratory irritation and elevates blood cotinine in cigarette smoke exposed mice. PLoS ONE. , 1-16 (2015).
  21. Moreno-Gonzalez, I., Estrada, L. D., Sanchez-Mejias, E., Soto, C. Smoking exacerbates amyloid pathology in a mouse model of Alzheimer's disease. Nature Communications. 4, 1-10 (2013).
  22. Madison, M. C., et al. Electronic cigarettes disrupt lung lipid homeostasis and innate immunity independent of nicotine. Journal of Clinical Investigation. 129, 4290-4304 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Muizenmodelluchtweginflammatielongemfyseemhematopo tische stamprogenitorcellenflowcytometriebeenmerganalyseDIY inhalatiesysteemchronische rookblootstelling
Blootstelling aan sigarettenrook bij muizen met behulp van een inhalatiesysteem voor het hele lichaam
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.