Methodenartikel

Carrier-assisted one-pot monstervoorbereiding voor gerichte proteomics-analyse van kleine aantallen menselijke cellen

DOI:

10.3791/61797

⸱

6 november 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory, 2NHC Key Laboratory of Cancer Proteomics, Department of Oncology, Xiangya Hospital, Central South University, 3Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, 4Department of Critical Care Medicine, The First Affiliated Hospital of Nanchang University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een door een eiwitdrager ondersteunde eenpotmonstervoorbereiding in combinatie met vloeistofchromatografie (LC) - geselecteerde reactiemonitoring (SRM), cLC-SRM genaamd, is een handige methode voor gemultiplexte gerichte proteomics-analyse van kleine aantallen cellen, inclusief afzonderlijke cellen. Het maakt gebruik van overmatig exogeen eiwit als drager en LC-SRM met hoge specificiteit voor gerichte kwantificering.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eiwitanalyse van kleine aantallen menselijke cellen wordt voornamelijk bereikt door gerichte proteomics met op antilichamen gebaseerde immunoassays, die inherente beperkingen hebben (bijv. lage multiplex en onbeschikbaarheid van antilichamen voor nieuwe eiwitten). Op massaspectrometrie (MS) gebaseerde gerichte proteomics is naar voren gekomen als een alternatief omdat het antilichaamvrij is, een hoge multiplex heeft en een hoge specificiteit en kwantificeringsnauwkeurigheid heeft. Recente ontwikkelingen in MS-instrumentatie maken op MS gebaseerde gerichte proteomics mogelijk voor gemultiplexte kwantificering van zeer overvloedige eiwitten in afzonderlijke cellen. Er is echter een technische uitdaging voor het effectief verwerken van afzonderlijke cellen met minimaal monsterverlies voor MS-analyse. Om dit probleem aan te pakken, hebben we onlangs een handige, door eiwitdragers ondersteunde eenpotmonstervoorbereiding ontwikkeld in combinatie met vloeistofchromatografie (LC) - geselecteerde reactiemonitoring (SRM), cLC-SRM genaamd, voor gerichte proteomics-analyse van kleine aantallen menselijke cellen. Deze methode maakt gebruik van het gecombineerde overmatige exogene eiwit als drager en eenpotverwerking met een laag volume om de adsorptieverliezen aan het oppervlak aanzienlijk te verminderen, evenals LC-SRM met hoge specificiteit om het verhoogde dynamische concentratiebereik als gevolg van de toevoeging van exogeen dragereiwit effectief aan te pakken. Het nut ervan is aangetoond door nauwkeurige kwantificering van de meest matig overvloedige eiwitten in kleine aantallen cellen (bijv. 10-100 cellen) en zeer overvloedige eiwitten in afzonderlijke cellen. De eenvoudig te implementeren functies en het ontbreken van specifieke apparaten maken deze methode gemakkelijk toegankelijk voor de meeste proteomics-laboratoria. Hierin hebben we een gedetailleerd protocol opgesteld voor cLC-SRM-analyse van kleine aantallen menselijke cellen, inclusief celsortering, cellyse en -vertering, LC-SRM-analyse en data-analyse. Verdere verbeteringen in detectiegevoeligheid en monsterdoorvoer zijn nodig in de richting van gerichte single-cell proteomics-analyse. We verwachten dat cLC-SRM breed zal worden toegepast in biomedisch onderzoek en systeembiologie met het potentieel om precisiegeneeskunde mogelijk te maken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Recente technologische ontwikkelingen in genomica (transcriptomics) maken een uitgebreide en nauwkeurige analyse van het genoom (transcriptoom) in afzonderlijke cellen mogelijk 1,2,3. Single-cell proteomics-technologieën lopen echter ver achter, maar zijn net zo belangrijk als genomics-technologieën (transcriptomics) 4,5,6,7,8. Bovendien kan de eiwitovervloed niet noodzakelijkerwijs worden afgeleid uit de mRNA-overvloed9 en is het proteoom complexer en dynamischer dan het transcriptoom10. Gezien deze uitdagingen wordt over het algemeen een groot aantal gemengde populaties van cellen (d.w.z. bulkcellen) gebruikt om uitgebreide proteoomgegevens te genereren 11,12,13. Dergelijke bulkmetingen gemiddelden echter stochastische variaties van individuele cellen uit, waardoor belangrijke cel-tot-cel variabiliteit (d.w.z. celheterogeniteit) wordt verdoezeld4,14. De beperkingen van dergelijke bulkmetingen worden nog ernstiger wanneer de cellen van belang slechts een klein deel van de totale populaties cellen uitmaken (bijv. kankerstamcellen in tumoren in een vroeg stadium van kanker). Daarom is er een enorme kenniskloof tussen single-cell proteomics en genomics (transcriptomics).

Op antilichamen gebaseerde immunoassays (bijv. flow- of massacytometrie) worden voornamelijk gebruikt voor gerichte proteomische analyse van afzonderlijke cellen 6,7,15,16,17,18. Ze lijden echter aan een lage multiplex, beperkte specificiteit en het niet beschikbaar zijn van antilichamen voor nieuwe interessante eiwitten. Op massaspectrometrie (MS) gebaseerde gerichte proteomics is naar voren gekomen als een alternatief voor nauwkeurige eiwitkwantificering vanwege de antilichaamvrije, hoge multiplex (≥150 eiwitten in een enkele analyse19), hoge kwantificeringsnauwkeurigheid (absolute hoeveelheden of concentraties) en hoge specificiteit en reproduceerbaarheid (≤10% CV)20,21,22,23. Recente aanzienlijke vooruitgang in de monstervoorbereiding heeft op MS gebaseerde eencellige proteomics mogelijk gemaakt voor kwantitatieve analyse van zeer overvloedige eiwitten uit afzonderlijke menselijke cellen. Op MS gebaseerde eencellige proteomics bevindt zich echter nog in de vroege kinderschoenen. Het meest geavanceerde MS-platform in combinatie met RPLC-stroomsnelheden met ultralage stroom kan bijvoorbeeld alleen labelvrije MS-detectie en kwantificering van ~670-870 eiwitten van de in totaal ≥12.000 eiwitten in afzonderlijke HeLa-cellen24,25 mogelijk maken.

Momenteel zijn er zes op MS gebaseerde eencellige proteomics-benaderingen beschikbaar voor analyse van afzonderlijke zoogdiercellen, waarvan er vier voor wereldwijde proteomics zijn (nanoPOTS: nanowell-based Preparation in One pot for Trace Samples26; iPAD-1: geïntegreerd proteoomanalyse-apparaat voor analyse van één cel27; OAD (olie-luchtdruppel) chip-gebaseerde eencellige proteomische analyse28; SCoPE-MS: single cell proteomics by mass spectrometry29) en de andere twee zijn voor gerichte proteomics (cLC-SRM: carrier-assisted liquid chromatography (LC) - selected reaction monitoring (SRM)30; cPRISM-SRM: carrier-assisted high-pressure high-resolution separations met intelligente selectie en multiplexing gekoppeld aan SRM31). Al deze benaderingen hebben echter technische nadelen. nanoPOTS, iPAD-1 en OAD verkleinen het monsterverwerkingsvolume tot 2-200 nL en zijn niet klaar voor brede benchtop-toepassingen 26,27,28. Voor SCoPE-MS wordt een TMT-drager (tandem mass tag) toegevoegd na verwerking van één cel, zodat deze niet effectief kan voorkomen dat oppervlakteadsorptieverliezen tijdens de monsterverwerking worden gebruikt wanneer een enkele buis wordt gebruikt voor verwerking van één cel29, wat resulteert in een lage reproduceerbaarheid met een correlatiecoëfficiënt van slechts ~0,2-0,4 tussen replicaten32. Voor cLC-SRM en cPRISM-SRM is het gebruik van exogene eiwitten als drager meer geschikt voor gerichte proteomics, omdat peptiden van overmatige exogene eiwitten vaak worden gesequenced door MS/MS, wat de kans op sequentiebepaling van laag overvloedige endogene peptiden aanzienlijk vermindert30,31. In tegenstelling tot wereldwijde proteomics voor relatieve kwantificering, kunnen de twee gerichte proteomics-benaderingen een nauwkeurige of absolute eiwitanalyse bieden van kleine aantallen cellen met een hoge reproduceerbaarheid met behulp van zware isotoop-gelabelde interne standaarden bij bekende concentraties. In vergelijking met cPRISM-SRM, dat voorafgaande PRISM-fractionering met hoge resolutie vereist, wat resulteert in veel fractiemonsters die moeten worden geanalyseerd, heeft cLC-SRM een aanzienlijk voordeel in monsterdoorvoer zonder fractionering en kan het tegelijkertijd honderden eiwitten kwantificeren in een enkele analyse, maar met een relatief lagere detectiegevoeligheid30. Daarom is cLC-SRM toegankelijker en zou het bredere bruikbaarheid moeten hebben voor nauwkeurige gemultiplexte eiwitanalyse van kleine aantallen cellen en voor monsters met een beperkte massa.

Hierin beschrijven we een gedetailleerd protocol om cLC-SRM uit te voeren voor gemakkelijke, gerichte proteomics-analyse van kleine aantallen menselijke cellen, inclusief afzonderlijke cellen. Het protocol bestaat uit de volgende belangrijke stappen: celsortering door FACS (fluorescentie-geactiveerde celsortering), cellyse en vertering verwerkt in low-volume single polymerase chain reaction (PCR)-buisjes, LC-SRM-gegevensverzameling en SRM-gegevensanalyse met behulp van openbaar beschikbare Skyline-software (Figuur 1). Het brede nut ervan werd samen met onze eerder gevestigde SRM-assays aangetoond door absoluut gerichte kwantificering van EGFR/MAPK-route-eiwitten in 1-100 MCF7- of MCF10A-cellen en bepaling van route-eiwitkopieën per cel bij een breed dynamisch bereik van concentraties30. We verwachten dat met het gedetailleerde protocol de meeste proteomics-onderzoekers cLC-SRM gemakkelijk in hun laboratoria kunnen implementeren voor nauwkeurige eiwitanalyse van ultrakleine monsters (bijv. zeldzame tumorcellen) om aan hun projectbehoeften te voldoen.

figure-introduction-1
Figuur 1: Overzicht van alle stappen in cLC-SRM (geassisteerde eenpotmonstervoorbereiding in combinatie met līquid c.romatografie - s gekozen actiemördinatie). Lysaatdigesten van niet-menselijke cellen (bijv. Shewanella oneidensis) worden gebruikt om PCR-buisjes voor te behandelen voor het coaten van het buisoppervlak. Kleine aantallen menselijke cellen of afzonderlijke cellen gesorteerd door FACS worden verzameld in voorbehandelde PCR-buisjes. BSA-eiwit (of proteoom van niet-menselijke cellysaat), zware interne standaard (IS) en TFE (of DDM) worden achtereenvolgens aan monsterbuisjes toegevoegd om cellyse te vergemakkelijken en adsorptieverliezen aan het oppervlak te verminderen. Conceptueel gezien zal de gecombineerde proteoomdrager van DDM en niet-humane cellysaat goed werken voor cLC-SRM. Cellyse wordt uitgevoerd door sonicatie en eiwitdenaturatie wordt bereikt door verhitting bij hoge temperatuur. DTT- en IAZ-reagentia worden gebruikt voor respectievelijk reductie en alkylering (deze stap is optioneel). Trypsine wordt toegevoegd voor de spijsvertering met veel hogere verhoudingen van trypsine ten opzichte van de eiwithoeveelheid dan die voor de standaard trypsinevertering. De dop van het monsterbuisje wordt verwijderd en vervolgens wordt het PCR-buisje in de LC-injectieflacon ingebracht voor directe LC-SRM-analyse. Verzamelde SRM-gegevens worden geanalyseerd met behulp van openbaar beschikbare Skyline-software. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: De stapsgewijze cLC-SRM-analyse wordt weergegeven in figuur 1.

1. Voorbehandeling van PCR-buisjes

  1. Voeg 100 μL niet-menselijke (bijv. Shewanella oneidensis) cellysaatdigesten van 0,2 μg/μL toe aan PCR-buisjes. Incubeer een nacht bij kamertemperatuur om het oppervlak van de PCR-buis te coaten.
  2. Verwijder de cellysaatverteringen door te pipetteren, spoel de PCR-buisjes 3 keer met water van HPLC-kwaliteit en laat de PCR-buisjes vervolgens aan de lucht drogen in een zuurkast.
  3. Bewaar gecoate PCR-buisjes in een vriezer van 4 °C tot verder gebruik.

2. FACS-sortering

  1. Lijn een fluorescentie-geactiveerde celsorteerder (FACS) (zie Materiaaltabel) uit op een PCR-plaat met 96 putjes met behulp van fluorescerende kralen met kleurstoffen die door de laserbron kunnen worden geëxciteerd om betrouwbare referentiesignalen te leveren.
  2. Controleer of de FACS-machine goed is gericht op het sorteren van cellen op de bodem van PCR-platen.
    1. Stel de hoek van de sorteerstroom in op het laagst mogelijke om het slagingspercentage te maximaliseren dat de cellen op de bodem van putten worden gesorteerd in plaats van de zijkanten te raken.
    2. Om de machine te richten, gebruikt u de teststroom om druppels PBS-buffer (bijv. 100 druppels) op het putje van een lege plaat te 'sorteren' om er zeker van te zijn dat de verzamelde druppels zich op de bodem bevinden. Als de druppels niet op de juiste positie terechtkomen, kalibreer dan de celsorteerder opnieuw en herhaal dit totdat de druppels in de sorteerstroom correct zijn opgevangen.
  3. Plaats de gecoate PCR-buisjes in een rek met 96 putjes voor PCR-buisjes.
  4. Sorteer het gewenste aantal menselijke borstcellen (MCF7 of MCF10A) in voorgecoate PCR-buisjes.
  5. Centrifugeer de gesorteerde borstcellen onmiddellijk 100 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om ze op de bodem van het buisje te houden en mogelijk celverlies te voorkomen.
  6. Bewaar de gesorteerde cellen in een vriezer van -80 °C tot verdere analyse.

3. Toevoeging van eiwitdrager, zware interne standaarden en TFE

  1. Voeg 4 μl 25 mM NH4HCO3 toe aan PCR-buisjes met verzamelde cellen.
  2. Voeg 1 μl 10 ng/μl runderserumalbumine (BSA) in 25 mM NH4HCO3 toe aan de monsterbuisjes.
  3. Voeg 0,3 μL 100 fmol/μL ruwe zware peptidestandaarden (totaal 30 fmol) toe aan monsterbuisjes.
    OPMERKING: Aliquots van ruwe zware peptidestandaarden voor EGFR/MAPK-route-eiwitten worden gemaakt in een nominale concentratie van 100 fmol/μL in 25 mM NH4HCO3. Doseer het kleine volume ruwe zware peptidestandaarden bij 100 fmol/μL in het midden van de oplossing en zorg ervoor dat er geen vloeistof in de pipetpunt achterblijft.
  4. Voeg 9 μL 100% TFE toe aan monsterbuisjes met de uiteindelijke concentratie van ~60% TFE.
  5. Centrifugeer 5 minuten op 1500 x g en draai vervolgens gedurende 3 minuten zachtjes op 100 x g.

4. Cellyse en eiwitdenaturatie

  1. Sonicate FACS-gesorteerde borstcellen op ijs gedurende 1 minuut met intervallen van 1 minuut voor een totaal van 5 cycli met een amplitude van 70% en 0,5 Hz.
  2. Incubeer de monsters gedurende 1 uur bij 90 °C voor eiwitdenaturatie met behulp van een PCR-thermocycler met de optie voor verwarmd deksel.
    OPMERKING: TFE is een vluchtig oplosmiddel met een kookpunt van 74 °C, en daarom is de optie met verwarmd deksel geselecteerd om volledige droging met aanzienlijk monsterverlies te voorkomen.
  3. Koel de monsters af tot kamertemperatuur met centrifugeren op 1500 x g gedurende 3 minuten.

5. Reductie en alkylering (optioneel)

  1. Voeg 0,6 μL 50 mM DTT toe voor een uiteindelijke concentratie van 2 mM.
    OPMERKING: DTT-oplossing moet elke keer vers worden bereid. Weeg 77,5 mg DTT af en los vervolgens op in 1 ml 25 ml NH4HCO3 om 500 ml DTT te maken. 10 μL 500 mM DTT wordt vervolgens toegevoegd aan 90 μL 25 mM NH4HCO3 om 50 mM DTT te maken.
  2. Centrifugeer 5 minuten op 1500 x g en meng vervolgens voorzichtig gedurende 3 minuten op 850 tpm.
  3. Incubeer gedurende 1 uur bij 56°C en schud zachtjes op 100 x g.
  4. Koel de monsters af tot kamertemperatuur en centrifugeer gedurende 3 minuten op 1500 x g .
  5. Voeg 0,5 μL 60 mM IAZ toe aan de RT-PCR-buis met de uiteindelijke concentratie van ~2 mM.
    OPMERKING: IAA-oplossing moet elke keer vers worden bereid. Weeg 74,3 mg IAZ af en los vervolgens op in 1 ml 25 mM NH4HCO3 om 400 mM IAZ te maken. 15 μl 400 mM IAZ wordt toegevoegd aan 85 μl 25 mM NH4HCO3 om 60 mM IAZ te maken.
  6. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten en schud zachtjes op 100 x g.
    OPMERKING: De reductie- en alkyleringsstappen zijn optioneel wanneer er geen cysteïnehoudende peptiden zijn geselecteerd voor doeleiwitten.

6. Trypsine spijsvertering

  1. Verminder het monstervolume tot ~4 μL met behulp van een SpeedVac-concentrator.
    OPMERKING: TFE is een vluchtig oplosmiddel met een kookpunt van 74°C. Een hoog percentage TFE remt de vertering van trypsine.
  2. Voeg 9 μl 25 mM NH4HCO3 en 1-3 μl 15 ng/μl trypsine toe voor de spijsvertering met een uiteindelijke trypsineconcentratie van 1-3 ng/μl.
    OPMERKING: Voor 10 FACS-gesorteerde menselijke borstcellen (~1 ng) is de verhouding van trypsine-enzym ten opzichte van eiwit ≥15:1, 750 keer hoger dan die bij standaard trypsinevertering (de verhouding van 1:50).
  3. Meng voorzichtig bij 100 x g gedurende 3 minuten en incubeer een nacht (~16 uur) bij 37 °C.
  4. Voeg 0,5 μL 5% mierenzuur toe om de enzymatische reactie te stoppen.
  5. Centrifugeer gedurende 1 uur bij 1500 x g.
  6. Bewaar in een vriezer van -80 °C tot verdere LC-SRM-analyse of in een vriezer van 4 °C voor onmiddellijke analyse.

7. Voorbereiding op directe LC-SRM-analyse

  1. Verwijder de dop van het PCR-buisje dat is gebruikt voor het verzamelen (stap 2) en verwerken (stap 6) van FACS-gesorteerde borstcellen.
  2. Plaats het PCR-buisje in de LC-injectieflacon.
  3. Sluit de LC-injectieflacon voor LC-SRM-analyse.
    OPMERKING: Voor kleine aantallen cellen die zijn verwerkt in een PCR-plaat met 96 putjes, wordt de matafdekking toegevoegd om de plaat af te dichten voor directe LC-SRM-analyse.

8. LC-SRM-analyse

  1. Analyseer monsters met behulp van UPLC gekoppeld aan een drievoudige quadrupoolmassaspectrometer.
  2. Sluit capillaire C18-kolommen (75 μm i.d. × 20 cm voor standaard gradiënt en 100 μm i.d. × 10 cm voor korte gradiënt) aan op een chemisch geëtste 20 μm i.d. gesmolten silica elektrospray-emitter via een roestvrijstalen metalen verbinding.
  3. Gebruik een monsterlus van 20 μl om het hele monster (~15 μl in totaal) rechtstreeks in de LC-kolom te laden om de detectiegevoeligheid te maximaliseren.
  4. Gebruik 0,1% mierenzuur in water en 0,1% mierenzuur in 90% acetonitril als mobiele fase A en B voor capillaire RPLC-scheiding.
  5. Gebruik de binaire LC-gradiënt bij debieten van 300 nL/min voor een standaardgradiënt wanneer grote aantallen doeleiwitten (>10) worden gemeten. Standaard gradiënt: 5-20% B in 26 min, 20-25% B in 10 min, 25-40% B in 8 min, 40-95% B in 1 min en bij 95% B gedurende 7 min voor een totaal van 52 minuten en de analytische kolom opnieuw in evenwicht gebracht op 99,5% A gedurende 8 min.
  6. Gebruik de binaire LC-gradiënt bij debieten van 400 nL/min voor een korte gradiënt wanneer kleine aantallen doeleiwitten (≤10) worden gemeten. Korte gradiënt voor snelle scheiding: 5-95% B in 5 minuten en de analytische kolom opnieuw in evenwicht gebracht op 99,5% A gedurende 5 minuten met een totale LC-looptijd van 10 minuten.
  7. Gebruik de QQQ-massaspectrometer met ionensproeispanningen van 2.400 ± 100 V, een capillaire offsetspanning van 35 V, een skimmer-offcheckerspanning van -5 V en een capillaire inlaattemperatuur van 220° C.
  8. Verkrijg de andere QQQ MS-parameters uit automatische afstemming en kalibratie zonder verdere optimalisatie.
  9. Spike verschillende concentraties van ruwe zware peptidestandaarden in 20-50 ng/μL niet-menselijke cellysaatverteringen vóór LC-SRM-analyse van monsters om de retentietijd (RT) van peptide LC te bepalen voor het bouwen van een geplande SRM-methode en mogelijke interferentieovergangen voor nauwkeurige kwantificering.
  10. Gebruik de RT geplande SRM-modus voor gemultiplexte kwantificering met het scanvenster van ≥6 min.
    OPMERKING: Het scanvenster wordt dienovereenkomstig aangepast, afhankelijk van het aantal overgangen in een bepaald tijdvenster.
  11. Stel de totale cyclustijd in op 1 s en de verblijftijd voor elke overgang wordt automatisch aangepast, afhankelijk van het aantal overgangen dat wordt gescand bij verschillende retentietijdvensters. Voor elke SRM-overgang is een minimale verblijftijd van 10 ms nodig. Alle doeleiwitten kunnen tegelijkertijd worden bewaakt in een enkele LC-SRM-analyse

9. Gegevensanalyse

  1. Importeer onbewerkte gegevensbestanden in openbaar beschikbare Skyline-software33 voor gegevensvisualisatie van elk doelpeptide om hun detecteerbaarheid te bepalen.
  2. Gebruik twee criteria om SRM-piekdetectie en -integratie te bepalen: 1) dezelfde LC-retentietijd; 2) ongeveer dezelfde relatieve SRM-piekintensiteitsratio's over meerdere overgangen tussen endogene (lichte) peptiden en hun overeenkomstige (zware) isotoop-gelabelde peptide-interne standaarden.
  3. Inspecteer alle SRM-gegevens handmatig om er zeker van te zijn dat de SRM-piektoewijzing en SRM-piekgrens correct zijn voor een betrouwbare kwantificering met behulp van de bovenstaande twee criteria.
  4. Gebruik de beste overgang met een hoog SRM-signaal maar zonder matrixinterferentie voor eiwitkwantificering, en gebruik de andere overgangen als referentie.
  5. Gebruik meerdere replicaten om de standaarddeviatie (SD) en variatiecoëfficiënt (CV) te verkrijgen.
  6. Bereken de signaal-ruisverhouding (S/N) aan de hand van de piekintensiteit van de top over het gemiddelde achtergrondgeluid binnen een retentietijdgebied van ±15 s voor de standaardgradiënt en ±6 s voor de korte gradiënt. De aantoonbaarheidsgrens (LOD) en de bepaalbaarheidsgrens (LOQ) worden gedefinieerd als de laagste concentratiepunten waarbij de S/N-verhouding respectievelijk ten minste 3 en 7 bedraagt.
  7. Pas naast S/N ≥7 nog een aanvullend criterium toe voor het conservatief bepalen van de LOQ-waarden: surrogaatpeptiderespons tegen verschillende celaantallen moet binnen het lineaire dynamische bereik liggen.
  8. Gebruik de Excel-software om alle kalibratiecurves uit te zetten. Laad de RAW-gegevens van QQQ MS in openbaar beschikbare Skyline-software om grafieken weer te geven van geëxtraheerde ionchromatogrammen (XIC's) van meerdere overgangen van gecontroleerde doeleiwitten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kleine hoeveelheden MCF7-cellysaten (0,5-20 ng gelijk aan 5-200 cellen) werden eerst gebruikt om de prestaties van cLC-SRM te evalueren door gerichte kwantificering van EGFR/MAPK-route-eiwitten, omdat ze uniformer zijn met minder variaties in vergelijking met kleine aantallen cellen gesorteerd door FACS. Zoals te zien is in figuur 2A, tonen XIC's duidelijk de detectie van SRM-overgangen voor ATADDELSFK afgeleid van GRB2 aanwe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

cLC-SRM is een handige, gerichte proteomics-methode die een nauwkeurige gemultiplexte eiwitanalyse van kleine aantallen cellen, waaronder afzonderlijke cellen, mogelijk maakt. Deze methode maakt gebruik van door eiwitdragers ondersteunde eenpotmonstervoorbereiding, waarbij alle stappen, waaronder celverzameling, meerstaps cellyse en -vertering, en overdracht van peptide-digesten naar capillaire LC-kolom voor MS-analyse, worden uitgevoerd in één pot (bijv. enkele buis of enkele put) (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door NIH Grant R21CA223715 (TS) en UG3CA256967 (TS en HL). Het experimentele werk dat hierin wordt beschreven, werd uitgevoerd in het Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, een nationale wetenschappelijke gebruikersfaciliteit die wordt gesponsord door het Amerikaanse ministerie van Energie onder contract DE-AC05-76RL0 1830.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2 mL glazen LC-vialMicrosolv 9502S-WCVVessel om PCR-buisje vast te houden voor autosample injectie
BSASigma-AldrichP0834-10×1mLCarrier-eiwit voor aanzienlijke vermindering van oppervlakte adsorptie verliezen
DTTThermo ScientificA39255Reagens voor reductie
Formic acidThermo Scientific28905Reagens voor het stoppen van enzymreactie
IAAThermo ScientificA39271Reagens voor alkylering
Peptide interne standaardenNew England peptideDoelgerichte kwantificering van EGFR/MAPK pad eiwitten
RT-PCR buisje GeneMate BioexpressT-3035-10,2 mL PCR-buisje voor one-pot monstervoorbereiding 
Skyline softwareUniversity of WashingtonPubliek beschikbaar voor SRM data analyse
SonicatorHielscher Ultrasound TechnologyUTR200Sonicatie op ijs voor cel lysis
Speed Vac concentratorThermo ScientificVermindering van het percentage TFE voor effectieve trypsine vertering
TFESigma-Aldrich18370-10×1mL60% TFE voor cel lysis
Thermocycler met verwarmd dekselPeltier Thermal Cycler PTC-200Verwarming voor eiwit denaturatie
Trypsine GoldPromegaV528AEnzym voor eiwit vertering 
Waters BEH C18 kolomWatersC18 kolom voor peptide scheiding

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
  2. Miyamoto, D. T., et al. RNA-Seq of single prostate CTCs implicates noncanonical Wnt signaling in antiandrogen resistance. Science. 349 (6254), 1351-1356 (2015).
  3. Wang, Y., Navin, N. E. Advances and applications of single-cell sequencing technologies. Molecular Cell. 58 (4), 598-609 (2015).
  4. Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
  5. Gavasso, S., Gullaksen, S. E., Skavland, J., Gjertsen, B. T. Single-cell proteomics: potential implications for cancer diagnostics. Expert Review of Molecular Diagnostics. 16 (5), 579-589 (2016).
  6. Wu, M., Singh, A. K. Single-cell protein analysis. Current Opinion in Biotechnology. 23 (1), 83-88 (2012).
  7. Hughes, A. J., et al. Single-cell western blotting. Nature Methods. 11 (7), 749-755 (2014).
  8. Peterson, V. M., et al. Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells. Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).
  9. Liu, Y., Beyer, A., Aebersold, R. On the Dependency of Cellular Protein Levels on mRNA Abundance. Cell. 165 (3), 535-550 (2016).
  10. Choudhary, C., Mann, M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (6), 427-439 (2010).
  11. Mertins, P., et al. Proteogenomics connects somatic mutations to signalling in breast cancer. Nature. 534 (7605), 55-62 (2016).
  12. Zhang, H., et al. Integrated Proteogenomic Characterization of Human High-Grade Serous Ovarian Cancer. Cell. 166 (3), 755-765 (2016).
  13. Zhang, B., et al. Proteogenomic characterization of human colon and rectal cancer. Nature. 513 (7518), 382-387 (2014).
  14. Gaudet, S., Miller-Jensen, K. Redefining Signaling Pathways with an Expanding Single-Cell Toolbox. Trends in Biotechnology. 34 (6), 458-469 (2016).
  15. Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
  16. Di Palma, S., Bodenmiller, B. Unraveling cell populations in tumors by single-cell mass cytometry. Current Opinion in Biotechnology. 31, 122-129 (2015).
  17. Schulz, K. R., Danna, E. A., Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Single-cell phospho-protein analysis by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. , Chapter 8 Unit 8 11-20 (2012).
  18. Willison, K. R., Klug, D. R. Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies. Current Opinion in Biotechnology. 24 (4), 745-751 (2013).
  19. Lee, J. Y., et al. Detection of Head and Neck Cancer Based on Longitudinal Changes in Serum Protein Abundance. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 29 (8), 1665-1672 (2020).
  20. Shi, T., et al. Advancing the sensitivity of selected reaction monitoring-based targeted quantitative proteomics. Proteomics. 12 (8), 1074-1092 (2012).
  21. Shi, T., et al. Advances in targeted proteomics and applications to biomedical research. Proteomics. 16 (15-16), 2160-2182 (2016).
  22. Lange, V., Picotti, P., Domon, B., Aebersold, R. Selected reaction monitoring for quantitative proteomics: a tutorial. Molecular Systems Biology. 4, 222(2008).
  23. Picotti, P., Aebersold, R. Selected reaction monitoring-based proteomics: workflows, potential, pitfalls and future directions. Nature Methods. 9 (6), 555-566 (2012).
  24. Zhu, Y., et al. Proteomic Analysis of Single Mammalian Cells Enabled by Microfluidic Nanodroplet Sample Preparation and Ultrasensitive NanoLC-MS. Angewandte Chemie International Edition. 57 (38), 12370-12374 (2018).
  25. Cong, Y., et al. Improved Single-Cell Proteome Coverage Using Narrow-Bore Packed NanoLC Columns and Ultrasensitive Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 92 (3), 2665-2671 (2020).
  26. Zhu, Y., et al. Nanodroplet processing platform for deep and quantitative proteome profiling of 10-100 mammalian cells. Nature Communications. 9 (1), 882(2018).
  27. Shao, X., et al. Integrated Proteome Analysis Device for Fast Single-Cell Protein Profiling. Analytical Chemistry. 90 (23), 14003-14010 (2018).
  28. Li, Z. Y., et al. Nanoliter-Scale Oil-Air-Droplet Chip-Based Single Cell Proteomic Analysis. Analytical Chemistry. 90 (8), 5430-5438 (2018).
  29. Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation. Genome Biology. 19 (1), 161(2018).
  30. Zhang, P., et al. Carrier-Assisted Single-Tube Processing Approach for Targeted Proteomics Analysis of Low Numbers of Mammalian Cells. Analytical Chemistry. 91 (2), 1441-1451 (2019).
  31. Shi, T., et al. Facile carrier-assisted targeted mass spectrometric approach for proteomic analysis of low numbers of mammalian cells. Communications Biology. 1, 103(2018).
  32. Vitrinel, B., Iannitelli, D. E., Mazzoni, E. O., Christiaen, L., Vogel, C. Simple Method to Quantify Protein Abundances from 1000 Cells. ACS Omega. 5 (25), 15537-15546 (2020).
  33. MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
  34. Shi, T., et al. Conservation of protein abundance patterns reveals the regulatory architecture of the EGFR-MAPK pathway. Science Signaling. 9 (436), 6(2016).
  35. Addona, T. A., et al. Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma. Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).
  36. He, J., et al. Analytical platform evaluation for quantification of ERG in prostate cancer using protein and mRNA detection methods. Journal of Translational Medicine. 13, 54(2015).
  37. Shi, T., et al. Antibody-free, targeted mass-spectrometric approach for quantification of proteins at low picogram per milliliter levels in human plasma/serum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (38), 15395-15400 (2012).
  38. Shi, T., et al. Targeted quantification of low ng/mL level proteins in human serum without immunoaffinity depletion. Journal of Proteome Research. 12 (7), 3353-3361 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Door dragers ondersteunde monstervoorbereidingone pot verwerkingLC SRM analysesingle cell proteomicseiwitdrager methodecellysis digestiedata analyseprotocolreductie van oppervlakte adsorptieexogene eiwitdrager
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen