Computergebaseerde beeldanalyse gebruiken om de kwantificering van longmetastase in het 4T1 Breast Cancer Model te verbeteren

Summary

We beschrijven een meer consistente en snelle methode om longmetastase te kwantificeren in het 4T1 borstkankermodel met behulp van Fiji-ImageJ.

Abstract

Borstkanker is een verwoestende maligniteit, goed voor 40.000 vrouwelijke sterfgevallen en 30% van de nieuwe vrouwelijke kankerdiagnoses in de Verenigde Staten alleen al in 2019. De belangrijkste oorzaak van borstkanker gerelateerde sterfgevallen is de uitgezaaide last. Daarom moeten preklinische modellen voor borstkanker gemetastaseerde belasting analyseren om klinisch relevant te zijn. Het 4T1 borstkankermodel biedt een spontaan metastaserend, kwantificeerbaar muismodel voor stadium IV borstkanker bij de mens. Echter, de meeste 4T1 protocollen kwantificeren de uitgezaaide last door handmatig te tellen gekleurde kolonies op weefselkweek platen. Hoewel dit voldoende is voor weefsels met een lagere uitgezaaide belasting, veroorzaakt menselijke fout in handmatig tellen inconsistente en variabele resultaten wanneer platen samenvloeiend en moeilijk te tellen zijn. Deze methode biedt een computergebaseerde oplossing voor menselijke telfouten. Hier evalueren we het protocol met behulp van de long, een zeer uitgezaaid weefsel in het 4T1-model. Afbeeldingen van methyleen blauw bevlekte platen worden verworven en geüpload voor analyse in Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ bepaalt vervolgens het percentage van het geselecteerde gebied van de afbeelding dat blauw is, wat het percentage van de plaat met uitgezaaide last vertegenwoordigt. Deze computergebaseerde aanpak biedt consistentere en snellere resultaten dan handmatig tellen of histopathologische evaluatie voor zeer uitgezaaide weefsels. De consistentie van fiji-ImageJ resultaten hangt af van de kwaliteit van het beeld. Kleine variaties in de resultaten tussen beelden kunnen optreden, dus het wordt aanbevolen dat meerdere beelden worden genomen en resultaten gemiddeld. Ondanks de minimale beperkingen is deze methode een verbetering van het kwantificeren van uitgezaaide belasting in de longen door consistente en snelle resultaten te bieden.

Introduction

Een op de acht vrouwen zal worden gediagnosticeerd met borstkanker in haar leven, en toch ondanks meerdere behandeling opties borstkanker is de tweede belangrijkste oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen bij Amerikaanse vrouwen¹. Deze vrouwen sterven niet aan de primaire tumor in hun borst. In plaats daarvan is de uitgezaaide last verantwoordelijk voor de mortaliteit van deze ziekte omdat deze zich vaak verspreidt naar de longen, het bot, de hersenen, de lever en de lymfeklieren². Daarom moeten borstkankermodellen metastase evalueren om bij te dragen aan het terugdringen van de sterfte van deze ziekte. De 4T1 murine borstkanker model is een prachtig protocol om dit te bereiken. De hier beschreven methode biedt een verbetering van het 4T1-model door Fiji-ImageJ te gebruiken om longmetastase te kwantificeren, wat consistente en snelle resultaten oplevert.

De 4T1 model is goed ingeburgerd, met de meeste laboratoria met behulp van protocollen zoals die beschreven door Pulaski en Ostrand-Rosenberg in 2001³. De 4T1-cellijn is 6-Thioguanine (6TG) resistent en representatief voor stadium IV, drievoudig negatief borstkanker^3,4,5. Het is klinisch relevant omdat het een orthotopisch model is en spontaan uitzaait naar dezelfde organen als bij borstkanker bij de mens^3,4. De 4T1-cellen metastaseren spontaan in een voorspelbaar tempo op basis van de hoeveelheid geïnjecteerde cellen^3,4. Belangrijk is dat genetische verschillen tussen muizen die hier worden gebruikt, de verwachte inter-individuele variabiliteit in gemetastasaire lasten veroorzaakten. Om metastase te evalueren, worden weefsels geoogst om kankercellen in verre gebieden te verzamelen en te kwantificeren met behulp van 6TG-selectie en methyleenblauwe vlekken. Het resultaat is een verzameling weefselkweekplaten met blauwe stippen die uitgezaaide kolonies vertegenwoordigen. Het Pulaski- en Ostrand-Rosenberg-protocol kwantificeert echter gemetastaseerde kolonies door ze handmatig te tellen, en daarom is dit het standaardmiddel geweest om metastase in dit model te evalueren. Hoewel dit gemakkelijk is voor weefsels met een lage uitgezaaide belasting, weefsels zoals de longen zijn vaak beladen met uitzaaiingen. Aangezien longplaten zeer vloeiend kunnen zijn, is het nauwkeurig en nauwkeurig kwantificeren van uitgezaaide gemetastaseerde kolonies door handmatig tellen moeilijk en gevoelig voor menselijke fouten. Om gemetastaseerde lasten beter te kwantificeren, beschrijven we het gebruik van Fiji-ImageJ voor een computergebaseerde oplossing voor menselijke telfouten. Histopathologische analyse met hematoxylin en eosine (H&E) kleuring is een ander middel om longmetastasen te kwantificeren, en interessant is ook verbeterd met Fiji-ImageJ software^6,7. Echter, omdat histopathologische analyse een enkel stukje van de long observeert, kan het onjuist en niet representatief zijn. Dit komt omdat het 4T1-model verschillende uitgezaaide laesies door het hele orgaan veroorzaakt die niet gelijkmatig verdeeld zijn. Hoewel de algemene trends tussen histopathologische analyse en handmatig tellen vergelijkbaar kunnen zijn⁸, kunnen de individuele waarden verschillen en mag histopathologische analyse daarom niet worden gebruikt als enig kwantificeringsmiddel. We tonen het voordeel ten opzichte van histopathologische analyse en de inconsistenties in handmatig tellen tussen verschillende tellers, terwijl ook de consistentie van het gebruik van Fiji-ImageJ aantoont. Bovendien tonen we aan dat deze methode de incubatietijd kan verminderen van 10-14 dagen tot 5 dagen, wat betekent dat onderzoekers gegevens uit hun studie veel eerder kunnen analyseren dan wanneer ze vertrouwen op handmatig tellen.

Deze methode is een verzameling eenvoudige aanpassingen aan het Pulaski en Ostrand-Rosenberg protocol^3. Omdat het 4T1-model veel wordt gebruikt en omdat longmetastase een kritieke parameter is om te meten in preklinische modellen, geloven we dat deze methode op grote schaal kan worden gebruikt en zeer waardevol is voor borstkankeronderzoekers. De enige extra benodigdheden die nodig zijn een camera en toegang tot een computer met Fiji-ImageJ, een gratis software die vaak wordt gebruikt in beeldanalyse⁹. Deze methode richt zich specifiek op longmetastase, maar het kan worden gebruikt voor andere weefsels met een aanzienlijke uitgezaaide last.

Protocol

Alle methoden die hier beschreven zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Virginia Tech en in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Het uitvoeren van dit protocol vereist toestemming van de juiste instellingen en naleving van alle juiste richtlijnen.

1. Celcultuur

1. Maak complete kweekmedia (RPMI + 10% Foetale Runder Serum +1% Pen Strep). Herleef 4T1 cellen volgens ATCC Protocol¹⁰ en broed bij 37 °C en 5% CO₂ in een T-25 kolf tot confluent. Verander media de dag na het herleven om dode cellen te verwijderen, en opnieuw als de media wordt besteed voordat cellen zijn confluent genoeg om passage.
2. Zodra de T-25 kolf is confluent, passage cellen naar een T-75 kolf door het weggooien van media, waskolf met 5 mL van 1x Dulbecco's Fosfaat Gebufferde Zoutoplossing (DPBS), en het toevoegen van 500 μL van Trypsin-EDTA. Incubeer gedurende 5-10 minuten bij 37 °C tot de cellen loskomen.
   1. Eenmaal losgemaakt, voeg 5 mL van opgewarmde complete cultuur media aan cellen. Aspirate en breng de 5 mL over naar een T-75 kolf met 15 mL opgewarmde complete cultuurmedia.
3. Passagecellen in T-75 kolven minstens vier keer. Doe dit zodra de kolf is confluent door het wassen met 8 mL van 1x DPBS, het toevoegen van 1 mL van Trypsin-EDTA voor het losmaken van cellen, het toevoegen van 10 mL van opgewarmde media aan cellen, en verdunnen 1:6-1:8 in een nieuwe T-75 kolf met 20 mL van opgewarmde volledige cultuur media.
4. Passagecellen tot het juiste aantal T-150 kolven met 40 mL opgewarmde volledige kweekmedia voor het aantal te injecteren muizen. De meeste studies vereisen meerdere T-150 kolven om voldoende cellen te garanderen voor injectie.
5. Wanneer muizen klaar zijn om te worden geïnjecteerd (8 weken oud of een gewicht van meer dan 20 g, afhankelijk van de IACUC of institutionele protocollen), oogst cellen door het weggooien van media, het wassen van elke kolf met 10 mL van 1x DPBS en het toevoegen van 2 mL trypsin-EDTA. Incubeer gedurende 5-10 minuten bij 37 °C tot de cellen loskomen.
6. Was kolf met 10 mL volledige media en breng alle inhoud (10 mL media + 2 mL trypsin-EDTA celmengsel) over naar de volgende kolf. Blijf cellen uit elke kolf wassen en verzamelen met dezelfde 10 mL media om te voorkomen dat u een te grote hoeveelheid media gebruikt.
   1. Zodra alle kolven zijn verzameld, breng de inhoud in een 50 mL centrifuge buis. Verzamel een monster van 10 μL voor het tellen in een microcentrifugebuis en centrifugeer de 50 mL conische buis op 125 x g gedurende 5 minuten.
7. Terwijl cellen worden gecentrifugeerd, voeg 10 μL Trypan blauw toe aan 10 μL celmonster. Tel cellen met behulp van een hemocytometer. Zodra het totale aantal cellen is bepaald, berekent u de concentratie cellen die nodig zijn om muizen te injecteren voor 1,2 x 10⁶ cellen per muis (per 100 μL).
8. Na centrifugatie, decanteren media en resuspend cell pellet in de juiste hoeveelheid steriele 1x DPBS voor 1,2 x 10⁶ cellen per 100 μL. Split cel / DPBS mengsel in microcentrifuge buizen voor gemakkelijke toegang met de spuit bij het aspirating cellen voor injectie. Houd cellen op ijs en injecteer kort daarna als cellen zullen beginnen te sterven na langere tijd op ijs te zijn.

2. Injecties

1. Bereid cellen voor op injectie door de microcentrifugebuis te tikken of voorzichtig te mengen om de cellen opnieuw op te zetten en vervolgens 600 μL in een spuit van 1 mL aan te trekken. Draai de spuit naar boven en trek de zuiger naar beneden om cellen weg te brengen van de spuit opening. Tik op de spuit om het te ontdoen van luchtbellen.
2. Bevestig de naaldschuin en geef cellen terug in de microcentrifugebuis tot er slechts 500 μL in de spuit blijft. Zet spuit plat op ijs.
   LET OP: 4T1 cellen vallen snel uit de suspensie. Daarom is het belangrijk om cellen terug te mengen in suspensie door vaak te tikken.
3. Verdoes 8 weken oud/>20 g vrouwelijke BALB/c muis met isoflurane of ander goedgekeurd verdovingsmiddel. Controleer de ademhaling van de muis om de diepte van anesthesie te beoordelen.
4. Zodra de muis goed is verdoofd, zoals aangegeven door gebrek aan hoornvliesreflex, plaats de muis op zijn rug. Houd met de duim, aanwijzer en middelvinger de muis voorzichtig ingedrukt. Gebruik de aanwijzer en middelvingers om het bovenlichaam en de duim van de muis in te houden voor het linkerachterbeen. Wees zachtaardig, maar stevig.
5. Met de schuine kant van de naald omhoog, injecteer 100 μL van cellen onderhuids in de linker buikslachtige vetmat van de muis. Monitor voor een goede bleb en eventuele lekkage, en zorg ervoor dat de muis wakker wordt en beweegt gemakkelijk na de injectie.
   1. Wissel naalden tussen elke muis.
      LET OP: Laat naald niet in de buikholte komen. Dit zou ertoe leiden dat de kanker zich snel verspreidt en niet representatief is voor het model. Om een onderhuidse injectie te garanderen, trek voorzichtig naar boven op de naald wanneer ingebracht in de linker buik borst vet pad. Als de naald gemakkelijk naar boven wordt getild, wordt deze correct onderhuids geplaatst.

3.

1. Monitor muizen ten minste 3 keer per week voor gewicht, lichaamsconditie score, tumor grootte, tumor conditie, ademhaling, activiteit niveau, uiterlijk, en beweging. Zodra de tumor bereikt 0,7-0,8 cm in diameter, beginnen dagelijks te controleren.
   1. Overweeg euthanasie wanneer de tumor grootte bereikt 1,5 cm, of gewichtsverlies bereikt 20%, of ernstige klinische daling van de lichaamsconditie score, tumor conditie, ademhaling, activiteit niveau, uiterlijk, of beweging worden waargenomen op basis van institutionele richtlijnen.
      OPMERKING: Body condition score is cruciaal om te controleren als lichaamsgewicht kan toenemen als de tumor toeneemt in omvang, ontkennen lichaam conditie verlies als gevolg van ziekte last. Exacte monitoringprotocollen zijn afhankelijk van de goedgekeurde IACUC- of institutionele protocollen.

4. Obductie

1. Euthanaseren muis met behulp van CO₂ volgens institutionele richtlijnen.
2. Spray muis met 70% ethanol te desinfecteren. Maak een incisie van de ventrale middellijn van de muis om de lichaamsholte bloot te stellen.
3. Verwijder de nier. Blijf de middellijn snijden totdat het middenrif zichtbaar is. Gebruik een schaar om het middenrif te doorboren om de longen leeg te laten lopen. Knip het middenrif om een betere toegang tot de holte te krijgen.
4. Gebruik een stompe schaar om het midden van de ribbenkast te snijden. Pin ribcage terug om de long en het hart bloot te leggen.
5. Doorsloop het hart met 2 mL van niet-steriele 1x DPBS door het inbrengen van een naald in de top van het hart totdat het zwembaden in de buikholte waar de nier werd verwijderd.
6. Om het hart en de longen te verwijderen, gebruik botte schaar om de slokdarm en luchtpijp direct boven het hart te snijden. Met behulp van tangen, beginnen om het hart weg te trekken van het lichaam en weggesneden op een bindweefsel houden het aan. De longen komen naar buiten met het hart.
7. Identificeer de multi-lobed (rechts) en single-lobed (links) longen. Houd het hart bevestigd voor referentie, maar zodra de longen zijn geïdentificeerd, snijd het hart weg.
8. Label een 12 put plaat met 1x Hank's Balanced Saline Solution (HBSS) in elke put. Elke muis heeft 2 putten nodig. Plaats de multi-gelobde (rechter) long in de 12 put plaat voor metastase evaluatie en houd op ijs. Houd de naburige goed leeg voor nu.
   OPMERKING: Het is belangrijk om dezelfde long (multi-lobed) van elke muis te gebruiken om ervoor te zorgen dat elk monster dicht in grootte is. De single-lobed long kan dan worden gebruikt voor andere analyse, zoals histopathologie.
   LET OP: Monsters zijn stabiel op ijs of op 4 °C voor een paar uur.

5. Verwerkingsweefsels

LET OP: Alle stappen in deze sectie moeten worden gedaan met behulp van steriele techniek.

1. Label 1 15 mL conische buis per muis en voeg 2,5 mL van type IV collagenase mengsel en 30 eenheden elastase aan elke buis. Om het collagenasemengsel van type IV te maken, los 2 mg collagenase van type IV per mL 1x HBSS en steriel filter op. Dit kan tot 12 maanden bij -20 °C worden opgeslagen en ontdooid wanneer dat nodig is.
2. Breng de long naar de tweede, schoon 1x HBSS goed voor dat monster. Wervel met behulp van tangen om het resterende bloed te verwijderen. Breng schone long over naar lege 3,5 cm weefselkweekplaat. Gehaktlong met schaar. Spoel plaat met 2,5 mL van 1x HBSS, breng 1x HBSS en longstukken in een 15 mL conische buis die al collagenase/elastase cocktail bevat (5 mL totaal).
3. Incubeer gedurende 75 minuten bij 4 °C. Blijf gedurende deze tijd monsters mengen, dus plaats buizen op een tuimelschakelaar of roterend wiel. Tijdens deze incubatiestap labelt u 50 mL centrifugebuizen en 10 cm weefselkweekplaten voor elke muis. Bij het doen van een verdunning, etiket genoeg 10 cm weefsel kweekplaten voor de verdunningen.
   LET OP: Label het deksel van de weefselkweekplaten. Als het labelen van de plaat zelf, het schrijven zal interfereren met Fiji-ImageJ analyse.
4. Breng het volume van elke buis tot 10 mL in totaal met 1x HBSS. Giet de inhoud over een 70 μm celzeef in een conische buis van 50 mL voor elk monster. Gebruik de zuiger van een spuit van 1 mL om het monster voorzichtig door de zeef te malen om meer cellen door te laten filteren.
5. Centrifuge gedurende 5 minuten bij 350 x g bij kamertemperatuur (RT). Gooi de supernatant weg en waspellet met 10 mL 1x HBSS. Herhaal deze stap twee keer.
6. Resuspend pellet in 10 mL of 60 μM 6TG complete cultuurmedia, rpmi of IMDM. Plaatmonsters in 10 cm celkweekplaten, indien gewenst met behulp van een verdunningsschema. Incubeer bij 37 °C, 5% CO₂ gedurende 5 dagen.
   OPMERKING: 1:2, 1:10 en 1:100 zijn veelvoorkomende verdunningen die empirisch moeten worden bepaald op basis van studieparameters.
   LET OP: 6TG is giftig. Wees voorzichtig bij het hanteren en volg alle richtlijnen voor milieugezondheid en veiligheid voor verwijdering.

6. Kleurplaten

1. Giet cultuurmedia van platen in geschikte afvalcontainer. Fix cellen door het toevoegen van 5 mL van onverdunde methanol per plaat en incubeer gedurende 5 minuten op RT, zorg ervoor dat methanol wervelen, zodat het de hele plaat bedekt.
   LET OP: Methanol is gevaarlijk bij inname, ingeademd of op de huid. Gebruik een rookkap voor deze stap.
2. Giet methanol van platen in de juiste afvalcontainer. Spoel borden met 5 mL gedestilleerd water per plaat en giet water in de juiste afvalcontainer. Voeg 5 mL van 0,03% methyleenblauw per plaat toe en broed gedurende 5 minuten bij RT, zorg ervoor dat u de methyleenblauwe oplossing wervelt, zodat deze de hele plaat bedekt.
3. Giet methyleenblauw in de juiste afvalcontainer. Spoel de platen opnieuw af met 5 mL gedestilleerd water per plaat. Draai platen ondersteboven en dep tegen een papieren handdoek om overtollige vloeistof te verwijderen. Plaats de plaat op het deksel en laat de lucht 's nachts drogen bij RT.
   LET OP: Uitgezaaide kolonies zullen blauw zijn. Zodra de platen zijn gedroogd, kunnen ze voor onbepaalde tijd worden opgeslagen bij RT.

7. Beeldanalyse

1. Verwijder gelabelde deksels van platen, zorg ervoor dat de monsters duidelijk worden geïdentificeerd. Line-up alle gekleurde longplaten op een schone, lichte oppervlak om een foto van alle platen in een beeld te nemen.
2. Maak een foto van de collectie platen in een goed verlichte ruimte, om reflecties te minimaliseren als de platen zijn zeer reflecterend. Reflecties in de platen zullen de beeldanalyse beïnvloeden en moeten daarom worden vermeden.
   LET OP: Fiji-ImageJ heeft een bovengrens van 2 gigapixels. De meeste moderne smartphones zullen voldoende camera's hebben. Gebruik geen camera van minder dan 8 megapixels. De camera die in dit experiment werd gebruikt was een 12,2 megapixel op een Google Pixel 2.
3. Snijd de afbeelding bij om de platen op te nemen, maar sluit de deksels of iets anders op de achtergrond van de afbeelding uit. Upload de bijgesneden afbeelding naar Fiji-ImageJ.
4. Wijzig de afbeelding in zwart-wit met behulp van de volgende opdrachten: Afbeelding, Aanpassen, Kleurdrempel, Drempelmethode: Standaard, Drempelkleur: B&W, Drempelruimte: Lab. Schakel het achtergrondvak Donker uit. Het beeld moet nu zwart-wit zijn. Zwart vertegenwoordigt de lichte achtergrond, en wit vertegenwoordigt de blauwe uitgezaaide kolonies.
5. Selecteer met het gereedschap Cirkel op de werkbalk Fiji-ImageJ het te analyseren gebied. Teken een cirkel te gebruiken voor alle platen om ervoor te zorgen elke plaat wordt geanalyseerd voor hetzelfde formaat gebied. Kies een grootte die het geanalyseerde gebied op de platen maximaliseert terwijl het minimaliseren van het achtergrondgeluid dat op de rand van de platen verschijnt. De grootte verschijnt in de werkbalk als deze wordt getekend, dus het is mogelijk om een perfecte cirkel te maken door de hoogte en de breedte te bewaken terwijl de cirkel wordt getekend.
6. Analyseer de geselecteerde cirkel om te bepalen welk percentage van het gebied wit is, wat het gebied van de plaat vertegenwoordigt dat blauwe uitgezaaide kolonies heeft. Gebruik de volgende opdrachten:
   Deeltjes analyseren, verkleinen (pixel^2):0-Oneindigheid, Circulariteit: 0,00-1,00, Weergeven: Niets en schakel het selectievakje Samenvatten in. Raak OK.
7. Nota van het % gebiedsresultaat. Dit is het percentage van het geselecteerde gebied dat wit is en dus de uitgezaaide last vertegenwoordigt.
   OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de resultaten op te slaan in Fiji-ImageJ of de volledige resultatenpagina te kopiëren/plakken in een apart document. Als de resultaten van het gebied van % onverwacht of verdacht zijn, is het mogelijk om te zien of een van de andere metingen ook verdacht waren of dat % gebied onjuist is geregistreerd.
8. Verplaats de cirkel, zonder de grootte te veranderen door het in het midden te grijpen, naar de volgende plaat op de foto. Herhaal stap 7.6 en 7.7 voor alle platen op de foto.
9. Herhaal stap 7.1 – 7.8 op ten minste twee beelden. Zodra alle platen en afbeeldingen zijn geanalyseerd, gemiddeld het % gebied resultaten tussen de verschillende beelden voor elke plaat om eventuele inconsistenties tussen foto's te verminderen.

Results

Deze methode bevat eenvoudige aanpassingen van het Pulaski- en Ostrand-Rosenberg 4T1-protocol³ en kan worden gevisualiseerd in figuur 1. Wanneer 3 afzonderlijke onderzoekers handmatig gemetastaseerde gemetastaseerde kolonies voor 12 longplaten (1:10 verdunning), de resultaten waren zeer inconsistent tussen de verschillende tellers (Figuur 2A). Alle onderzoekers werden gericht om "tellen de gemetastaseerde kolonies die verschijnen als blau...

Discussion

Zoals aangetoond, kan het handmatig tellen van de gemetastaseerde kolonies op elke longplaat een onnauwkeurige en onnauwkeurige methode zijn om longmetastase te kwantificeren, wat de noodzaak van een beter kwantificeringsmiddel aantoont (figuur 2). Histopathologische analyse verschilde enigszins van zowel handmatig tellen als Fiji-ImageJ-analyse(figuur 2B en 4D),waarschijnlijk omdat de H&E-dia's geen representatief monster van het hele orgaan zi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesie kamer	Zie opmerkingen	Zie opmerkingen	Gebruik goedgekeurde materialen volgens de beleidslijnen van uw instelling
Verdovingsmiddel	Zie opmerkingen	Zie opmerkingen	Gebruik goedgekeurde materialen volgens de beleidslijnen van uw instelling
BALB/c vrouwelijke muizen	The Jackson Laboratory	000651
Blunt schaar	Roboz	RS-6700
Rekenmachine	Elk	Elk
Camera	Elk	Elk	Minimaal 8 megapixels
Centrifuge	Elk	Elk	Moet in staat zijn om 125 x g en 300 x g te bereiken
CO2 euthanasie-opstelling	Zie opmerkingen	Zie opmerkingen	Gebruik goedgekeurde materialen volgens de beleidslijnen van uw instelling
Koude ruimte, koelkast, koude opslag	Elk	Elk
Computer met Fiji-ImageJ	Elk	Elk	Moet in staat zijn om Fiji-ImageJ uit te voeren
Telkamer	Fisher Scientific	02-671-10
Gebogen schaar	Roboz	RS-5859
Gedestilleerd water	Elk	Elk
Elastase	MP Biomedicals	100617
Elektronische weegschaal	Elk	Elk
Fetaal runder serum (FBS)	R&D Systems	S11150
Pincet	Roboz	RS-8100
IJs	N/A	N/A
Incubator	Zie opmerkingen	Zie opmerkingen	Moet in staat zijn om 5% CO2 en 37 °C te bereiken
Methanol	Fisher Scientific	A412SK-4
Methyleenblauw	Sigma-Aldrich	03978-250ML
Penicilline Streptomycine	ATCC	30-2300
Pins of naalden	Elk	Elk	Voor het vastpinnen van muizen tijdens necropsie
Kunststof schuifmaten	VWR	25729-670
RMPI-1640 Medium	ATCC	30-2001
Rotator of roterend wiel	Elk	Elk
Scherpe schaar	Roboz	RS-6702
Steriele wegwerpfilter met PES-membraan	ThermoFisher Scientific	568-0010
T-150 Flessen	Fisher Scientific	08-772-48
T-25 Flessen	Fisher Scientific	10-126-10
T-75 Flessen	Fisher Scientific	13-680-65
Driehoekige plastic beker	Fisher Scientific	14-955-111F	Wordt gebruikt om muizen te wegen
Trypanblauw	VWR	97063-702
Trypsin-EDTA	ATCC	30-2101
Type IV collageenaase	Sigma-Aldrich	C5138
3.5 cm weefselkwekerijplaten	Nunclon	153066
1 mL spuit	BD	309659
1.7 mL microcentrifugebuisjes	VWR	87003-294
10 cm weefselkwekerijplaten	Fisher Scientific	08-772-22
12 wel plaat	Corning	3512
15 mL centrifugeerbuis	Fisher Scientific	14-959-70C
1X Dulbecco's Fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS)	Fisher Scientific	SH30028FS
1X Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS)	Thermo Scientific	SH3026802
27 g 1/2 inch naalden	Fisher Scientific	14-826-48
4T1 (ATCC® CRL­2539™)	ATCC	CRL-2539
50 mL centrifugeerbuis	Fisher Scientific	14-959-49A
6-Thioguanine	Sigma-Aldrich	A4882
70 μM celstrainer	Fisher Scientific	22-363-548
70% ethanol	Sigma Aldrich	E7023	Verdun tot 70% met DI water