De procedure beschrijft de isolatie van de villi van het darmepitheel van de muis die dedifferentiatie ondergaat om hun organoïdevormingspotentieel te bepalen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
3D-kweek van organoïden uit het intestinale villi-epitheel dat dedifferentiatie ondergaat
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Clonogeniciteit van organoïden uit het darmepitheel wordt toegeschreven aan de aanwezigheid van stamcellen daarin. Het dunne-darmepitheel van de muis is gecompartimenteerd in crypten en villi: de stam- en prolifererende cellen zijn beperkt tot de crypten, terwijl het villi-epitheel alleen gedifferentieerde cellen bevat. Vandaar dat de normale darmcrypten, maar niet de villi, aanleiding kunnen geven tot organoïden in 3D-culturen. De hier beschreven procedure is alleen van toepassing op villusepitheel dat dedifferentiatie ondergaat die leidt tot stengelvorming. De beschreven methode maakt gebruik van de Smad4-loss-of-function:β-catenine gain-of-function (Smad4KO:β-catenineGOF) voorwaardelijke mutante muis. De mutatie zorgt ervoor dat de intestinale villi dedifferentiëren en stamcellen genereren in de villi. Intestinale villi die dedifferentiatie ondergaan, worden van de darm geschraapt met behulp van glazen dia's, in een zeef van 70 μm geplaatst en meerdere keren gewassen om eventuele losse cellen of crypten eruit te filteren voorafgaand aan plating in BME-R1-matrix om hun organoïde-vormend potentieel te bepalen. Twee belangrijke criteria werden gebruikt om ervoor te zorgen dat de resulterende organoïden werden ontwikkeld uit het dedifferentierende villuscompartiment en niet uit de crypten: 1) microscopisch evalueren van de geïsoleerde villi om de afwezigheid van vastgebonden crypten te garanderen, zowel voor als na plating in de 3D-matrix, en 2) het monitoren van het tijdsverloop van organoïdeontwikkeling van de villi. Organoïde-initiatie van de villi vindt slechts twee tot vijf dagen na plating plaats en lijkt onregelmatig gevormd, terwijl de crypt-afgeleide organoïden uit hetzelfde darmepitheel binnen zestien uur na plating zichtbaar zijn en bolvormig lijken. De beperking van de methode is echter dat het aantal gevormde organoïden en de tijd die nodig is voor organoïde-initiatie van de villi variëren afhankelijk van de mate van dedifferentiatie. Daarom moet, afhankelijk van de specificiteit van de mutatie of de belediging die de dedifferentiatie veroorzaakt, het optimale stadium waarin villi kunnen worden geoogst om hun organoïdevormingspotentieel te testen, empirisch worden bepaald.
Inleiding
De darmcrypten, maar niet villi, vormen organoïden wanneer ze worden gekweekt in Matrigel of BME-R1 matrix. Deze organoïden zijn zelforganiserende structuren, vaak aangeduid als de "mini-darm" vanwege de aanwezigheid van de verschillende gedifferentieerde afstammingslijn, voorloper en stamcellen die in vivo inhet darmepitheel aanwezig zijn . Het potentieel om organoïden uit crypten te vormen, wordt toegeschreven aan de aanwezigheid van stamcellen1. De intestinale villi daarentegen bestaan alleen uit gedifferentieerde cellen en kunnen dus geen organoïden vormen. Mutaties2 of omstandigheden die dedifferentiatie van het villusepitheel mogelijk maken, kunnen echter leiden tot stamcellen in de villi2,3. Deze lotverandering die resulteert in stengelheid in het villi-epitheel kan worden bevestigd door het de differentiërende villusepitheel in 3D-matrix te plateren om hun organoïdevormende potentieel te bepalen als een indicator van de-novo stengelheid in het villusepitheel. Daarom is het kritieke aspect van deze procedure om ervoor te zorgen dat er geen cryptebesmetting is.
De Smad4KO:β-catenineGOF voorwaardelijke mutatie veroorzaakt dedifferentiatie in het darmepitheel gekenmerkt door de expressie van proliferatie en stamcelmarkers in de villi, en uiteindelijk de vorming van crypte-achtige structuren in de villi aangeduid als ectopische crypten De aanwezigheid van stamcellen deze gededifferentieerde villi werd bepaald door de expressie van stamcelmarkers in de ectopische crypten (in vivo) en het vermogen van de mutante villi om organoïden te vormen wh nl plated Matrigel3. De onderstaande procedure werkt de methodologie uit die wordt gebruikt om de stengelheid van het dedifferentierende darmepitheel in de Smad4KO:β-catenineGOF-mutante muizen te bevestigen. Een belangrijk kenmerk van deze methodologie voor het isoleren van villi was het gebruik van schrapen van het darmlumen, in tegenstelling tot de EDTA-chelatiemethode4. In tegenstelling tot de EDTA-chelatiemethode behoudt villi-isolatie door schrapen het grootste deel van het onderliggende mesenchym en maakt het mogelijk de druk van het schrapen aan te passen om villi te produceren zonder vastgebonden crypten. De druk van schrapen is subjectief voor de operator, daarom moet de optimale druk om villi te produceren zonder crypten vastgebonden empirisch door de operator worden bepaald. Het kritieke aspect van deze procedure is om de afwezigheid van cryptebesmetting te waarborgen door microscopisch onderzoek van de villi zowel voor als na plating in de BME-R1-matrix.
Intestinale villi worden met glazen glaasjes van het darmlumen geschraapt en in een filter van 70 μm geplaatst en gewassen met PBS om losse cellen of crypten, indien aanwezig, te verwijderen voordat ze in de BME-R1-matrix worden geplateerd. De methode legt de nadruk op de volgende criteria om cryptebesmetting te voorkomen: a) het beperken van de villi-oogst van de proximale helft van de twaalfvingerige darm waar de villi het langst zijn, b) het minimaliseren van het aantal villi-vruchtbare schaafwonden, c) het wassen van het filter met de villi door een reeks PBS in een schaal met zes putten, en d) het bevestigen van de afwezigheid van cryptebesmetting door microscopisch onderzoek voorafgaand aan en na plating in BME-R1-matrix. Villi-isolatie door schrapen, in plaats van door EDTA-chelatie, voorkomt het volledige verlies van het onderliggende mesenchymdat de nichesignalen5,6,7, 8, indien nodig, kan leveren voor organoïde initiatie van het villus-epitheel.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle uitgevoerde muisexperimenten, inclusief het gebruik van Tamoxifen en euthanasie door cervicale dislocatie, hadden de goedkeuring van de Institutional Animal Care and Use Committee van het Stevens Institute of echnology.
1. Muizen
OPMERKING: Het genereren van Smad4f/f; Catnblox (ex3)/+; Villin-CreERT2 muizen zijn eerder beschreven3. Volwassen vrouwelijke muizen tussen de acht en twaalf weken oud werden gebruikt.
- Induceer de Smad4KO:β-catenineGOF mutatie in de Smad4f/f; Catnblox (ex3)/+; Villin-CreERT2 met intraperitoneale injectie van Tamoxifen in maïsolie gedurende vier opeenvolgende dagen.
- Offer de muizen door cervicale dislocatie tien dagen na de eerste tamoxifeninjectie.
- Spuit de buik in met 70% ethanol om te voorkomen dat de vacht van de muis in de peritoneale holte komt.
- Open de buikholte met een dissectieschaar om de darm bloot te leggen. Isoleer de darm met behulp van de schaar en tang.
OPMERKING: Gelijktijdig verlies van Smad4 samen met winst van functiemutatie van β-catenine (Smad4KO; β-catenineGOF) in darmepitheel werd bereikt doorSmad4f / fte injecteren; Catnblox (ex3)/+; Villin-CreERT2 muizen elke dag gedurende vier opeenvolgende dagen met 0,05 g Tamoxifen/kg lichaamsgewicht in maïsolie. Deze muizen worden tien dagen na de eerste tamoxifeninjectie geoogst om de aanwezigheid van cellen die stamcel-geassocieerde markers tot expressie brengen in de de differentiërende villi te garanderen.
2. Duodeen isolatie en bereiding
- Ontleed de proximale helft van de twaalfvingerige darm.
- Spoel de twaalfvingerige darm met 5 ml ijskoude PBS in een spuit van 10 ml om het luminale gehalte te verwijderen.
- Open de twaalfvingerige darm in de lengterichting met een schuine schaar en leg de twaalfvingerige darm plat op een petriplaat van 15 cm op ijs met het lumen van de twaalfvingerige darm naar de operator gericht.
3. Villi isolatie door schrapen
- Plaats voordat u begint met schrapen een gaaszeef van 70 μm in een van de putjes van een 6-well weefselkweekplaat. Vul alle putten met 4 ml 1x PBS en plaats de 6-well tissuekweekplaat op ijs(figuur 1).
- Schraap de villi als volgt met behulp van twee microscopische glasplaten: een om de twaalfvingerige darm naar beneden te houden en de andere om te schrapen (figuur 1B1).
- Schraap de luminale kant van de twaalfvingerige darm twee keer oppervlakkig heen en weer om het slijm te verwijderen. Oefen druk uit zodat deze stap de slijmlaag verwijdert, maar niet de villi.
- Schraap de twaalfvingerige darm opnieuw, heen en weer tweemaal met dezelfde druk als in 3..1, waarbij villi te zien zijn die zich op de dia's verzamelen (figuur 1B2). Dit is de optimale druk (die empirisch door de operator moet worden bepaald) om de villi te produceren zonder dat de crypten zijn vastgebonden.
- Gebruik een transferpipetter van 1 ml met PBS om de villi (die worden verzameld op de dia van stap 3.2.2.) over te brengen naar een gaaszeef van 70 μm die in een schaal met 6 putten wordt geplaatst. De villi worden zo verzameld, na elke schaafwond (figuur 1B2).
- Was de villi verzameld in de 70 μm zeef (vanaf stap 3.3) door de zeef (met de villi) door een reeks putjes over te brengen in een 6-well schotel met koude PBS (~ 4 ml / put). Dit is om eventuele losse crypten te verwijderen.
- Breng met behulp van een p1000-pipet de villi-suspensie in PBS (~ 3 ml) over van de zeef van 70 μm naar een nieuwe buis van 15 ml op ijs.
- Gebruik een 0,1% BSA-gecoate p200-pipetpunt om 50 μL volume van de villi-suspensie op een glazen dia te zuigen. Tel het aantal villi in de druppel van 50 μL onder 4x vergroting om de concentratie villi in de PBS-suspensie te bepalen. Als er bijvoorbeeld 10 villi in de onderzochte suspensie van 50 μL zitten, dan is de villiconcentratie 0,2 villi/μL. Dit is ook het moment om de afwezigheid van vastgebonden crypten te bevestigen.
- Bereken het volume villi-suspensie dat nodig is om te platen bij een concentratie van 0,5 villi/μL BME-R1-matrix. Voeg een extra 100 μL toe om rekening te houden met pipetteerfouten en het volume dat nodig is voor microscopisch onderzoek dat nodig is om de zuiverheid van de villi te waarborgen.
LET OP: De druk die wordt gebruikt in de eerste twee schaafwonden, die het slijm verwijdert, maar niet de villi, moet worden gebruikt in de daaropvolgende schaafwonden waarbij villi zullen vrijkomen. Beperk het aantal heen-en-weer schrapen tot twee nadat de villi-afgifte voor het eerst is waargenomen. Deze maatregel voorkomt het vrijgeven van villi met de crypten vastgebonden. Het is essentieel om de villi microscopisch te evalueren om de afwezigheid van de vastgebonden crypten te garanderen.
4. Plating van villi op BME-R1 matrix
- Breng met behulp van een 0,1% BSA-gecoate p200 stompe pipetpunt het volume villi (vanaf stap 3.6) over op een microcentrifugebuis die nodig is om te platen met een dichtheid van ~ 6 villi per put in 12,5 μL BME-R1 matrix. Het gebruik van BSA-gecoate stompe uiteinden op dit punt zorgt ervoor dat de villi, die te groot zijn voor een puntige punt, worden aangezogen zonder te worden geblokkeerd of verloren te gaan door vast te zitten aan de zijkanten van de punt.
- Draai de villi gedurende 2 min op 200 x g in een gekoelde centrifuge (4 °C) en verwijder het supernatant.
- Herhaal stap 4.2 om eventuele resterende PBS te verwijderen en ga verder met de volgende stap onder een laminaire flow-hood.
- Resuspend de villi pellet voorzichtig in de vereiste hoeveelheid koude BME-R1 ontdooid op ijs.
- Met behulp van een p20 pipet, plaat 12,5 μL/put van de villi in BME-R1 matrix in 3D in een voorgewarmde 96-well U-bodemplaat.
- Incubeer de plaat in een weefselkweekincubator bij 37 °C gedurende 15 minuten om stolling van de BME-R1-matrix mogelijk te maken.
- Voeg 125 μL/putje voorverwarmde ENR (Epidermale groeifactor/Noggin/R-spondin1) media toe: geavanceerde DMEM F-12 media, aangevuld met 1x Penicilline: Streptomycine, 10 mM HEPES, Glutamax, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 5% geconditioneerde media van HEK293-T-cellen die R-Spondin1 tot expressie brengen, 1x N2, 1x B27, 1 mM N-acetylcysteïne en 0,05 mg/ml Primocine.
- Incubeer de vergulde villi in een weefselkweekincubator die op 37 °C wordt gehouden met 5% CO2en ververs de media om de andere dag.
- Gooi elke put weg waarin organoïden verschijnen vóór twee dagen plating, omdat het vroegste tijdstip waarop villi-afgeleide organoïden worden verwacht na twee dagen is.
OPMERKING: Alle villi die de helft of meer dan de helft van de lengte van villi hebben, worden geteld als één villus. In tegenstelling tot van crypten afgeleide organoïden, worden villi-afgeleide organoïden niet verwacht binnen 24 uur na plating. De organoïde-initiërende villi lijken donkerder en krimpend te zijn voorafgaand aan de vorming van organoïden. Daarom moeten alle putten met organoïden die zich binnen een dag na het beplaten ontwikkelen, worden weggegooid om te voorkomen dat ze zijn afgeleid van plausibele cryptebesmetting. De methodologie die wordt gebruikt om de geconditioneerde media te produceren, is op aanvraag beschikbaar.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De bepalende factor voor het succes van de procedure is het voorkomen van cryptebesmetting. Organoïde ontwikkeling van de villi (en niet van eventuele contaminerende crypten) wordt verzekerd door vier belangrijke criteria te bevestigen: 1) het waarborgen van de zuiverheid van de geoogste villi door microscopisch onderzoek voor en na het platen van de villi in BME-R1, 2) plating beperkt aantal villi per put om visualisatie van alle vergulde villi afzonderlijk mogelijk te maken, 3) op het dagelijks ontwikkelen van organoïd...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze methode kan het zelfvernieuwende vermogen bevestigen van het dedifferentiëren van villi-epitheel dat in vivo stamcelmarkers verwerft. Het normale darmepitheel kan aanleiding geven tot organoïden uit de crypte, maar niet uit het villi-compartiment, wanneer gekweekt in 3D vanwege de aanwezigheid van stamcellen in de crypten1. Organoïdevorming uit het gededifferentieerde villi-epitheel gekweekt in 3D-culturen bevestigt dus stamcelvorming door omkering van het lot van cellen. Rapporten o...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.
Dankbetuigingen
Deze publicatie werd ondersteund door awardnummer K22 CA218462-03 van het NIH National Cancer Institute. De HEK293-T cellen die R-Spondin1 tot expressie brengen was een gulle gift van Dr. Michael P. Verzi.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Advanced DMEM F-12 media | Gibco | 12634010 | |
| 3,3-diaminobenzidine | Vector Labs | SK-4105 | |
| 96 well U-bottom plate | Fisher Scientific | FB012932 | |
| ABC kit | Vector Labs | PK4001 | |
| Angled scissor | Fisher Scientific | 11-999 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9703100 | |
| CD44 antibody | BioLegend | 1030001 | |
| Cdx2 antibody | Cell Signaling | 12306 | |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | |
| Corning 70-micron cell strainer | Life Sciences | 431751 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1 | R&D | 3433-005-R1 | |
| Dissection scissors | Fisher Scientific | 22-079-747 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 17-456-209 | |
| Glutamax (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| HEK 293-T cells expressing RSPO-1 | Gift from Dr. Michael Verzi | ||
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Histogel | Thermoscientific | HG-4000-012 | |
| Mesh filter | Fisher Scientific | 07-201-431 | |
| Micrscope glass slide | VWR | 89218-844 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| p200 Blunt tips | VWR | 46620-642 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Primocin (50mg/mL) | Invivogen | ant-pm-1 | |
| Quality Biological Inc PBS (10X) | Fisher Scientific | 50-146-770 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Signal diluent | Cell Signaling | 8112L | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| 6-well tissue culture plate | Fisher Scientific | 50-146-770 |
Referenties
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Schwitalla, S., et al. Intestinal tumorigenesis initiated by dedifferentiation and acquisition of stem-cell-like properties. Cell. 152 (1-2), 25-38 (2013).
- Perekatt, A. O., et al. SMAD4 Suppresses WNT-Driven Dedifferentiation and Oncogenesis in the Differentiated Gut Epithelium. Cancer Research. 78 (17), 4878-4890 (2018).
- Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods in Molecular Medicine. 50, 15-20 (2001).
- Aoki, R., et al. Foxl1-expressing mesenchymal cells constitute the intestinal stem cell niche. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (2), 175-188 (2016).
- Seiler, K. M., et al. Tissue underlying the intestinal epithelium elicits proliferation of intestinal stem cells following cytotoxic damage. Cell and Tissue Research. 361 (2), 427-438 (2015).
- Stzepourginski, I., et al. CD34+ mesenchymal cells are a major component of the intestinal stem cells niche at homeostasis and after injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (4), 506-513 (2017).
- Roulis, M., et al. Paracrine orchestration of intestinal tumorigenesis by a mesenchymal niche. Nature. 580 (7804), 524-529 (2020).
- Haramis, A. P., et al. De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine. Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).
- Madison, B. B., et al. Epithelial hedgehog signals pattern the intestinal crypt-villus axis. Development. 132 (2), 279-289 (2005).
- van Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
- Tetteh, P. W., et al. Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters. Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).
- Baulies, A., et al. The Transcription Co-Repressors MTG8 and MTG16 Regulate Exit of Intestinal Stem Cells From Their Niche and Differentiation Into Enterocyte vs Secretory Lineages. Gastroenterology. 159 (4), 1328-1341 (2020).
- Zeilstra, J., et al. Stem cell CD44v isoforms promote intestinal cancer formation in Apc(min) mice downstream of Wnt signaling. Oncogene. 33 (5), 665-670 (2014).
- Gracz, A. D., et al. Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells. Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).
- Gao, N., White, P., Kaestner, K. H. Establishment of intestinal identity and epithelial-mesenchymal signaling by Cdx2. Developmental Cell. 16 (4), 588-599 (2009).
- Verzi, M. P., Shin, H., Ho, L. L., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. Essential and redundant functions of caudal family proteins in activating adult intestinal genes. Molecular and Cellular Biology. 31 (10), 2026-2039 (2011).
- Verzi, M. P., Shin, H., San Roman, A. K., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. Intestinal master transcription factor CDX2 controls chromatin access for partner transcription factor binding. Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 281-292 (2013).
- Grainger, S., Hryniuk, A., Lohnes, D. Cdx1 and Cdx2 exhibit transcriptional specificity in the intestine. PLoS One. 8 (1), 54757(2013).
- Stringer, E. J., et al. Cdx2 determines the fate of postnatal intestinal endoderm. Development. 139 (3), 465-474 (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
