Methodenartikel

Een eenvoudige droge sectiemethode voor het verkrijgen van hele zaad-sized hars sectie en de toepassingen ervan

DOI:

10.3791/61822

⸱

23 januari 2021

 ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology of Jiangsu Province/Jiangsu Key Laboratory of Crop Genomics and Molecular Breeding, Yangzhou University, 2Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops of Jiangsu Province/Joint International Research Laboratory of Agriculture & Agri-Product Safety of the Ministry of Education, Yangzhou University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze techniek maakt het mogelijk voor de snelle en eenvoudige voorbereiding van hele zaad-sized hars sectie voor de observatie en analyse van cellen, zetmeel korrels, en eiwitlichamen in verschillende regio's van het zaad.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De morfologie, grootte en kwantiteit van cellen, zetmeelkorrels en eiwitlichamen in zaad bepalen het gewicht en de kwaliteit van zaad. Ze zijn aanzienlijk verschillend tussen de verschillende gebieden van zaad. Om de morfologieën van cellen, zetmeelkorrels en eiwitlichamen duidelijk te bekijken en hun morfologieparameters nauwkeurig te analyseren, is de sectie van hele zaadformaat nodig. Hoewel de hele zaad-sized paraffine sectie kan de accumulatie van opslagmaterialen in zaden te onderzoeken, is het zeer moeilijk om kwantitatief te analyseren de morfologie parameters van cellen en opslagmaterialen als gevolg van de lage resolutie van de dikke sectie. De dunne hars sectie heeft een hoge resolutie, maar de routine hars sectie methode is niet geschikt voor de hele zaad-sized sectie van volwassen zaden met een groot volume en een hoog zetmeelgehalte voor te bereiden. In deze studie presenteren we een eenvoudige droge sectiemethode voor het voorbereiden van de hele harssectie ter grootte van zaden. De techniek kan de dwars- en longitudinale hele-zaad-sized secties van ontwikkelende, rijpe, ontkiemde, en gekookte zaden ingebed in LR Witte hars, zelfs voor grote zaden met een hoog zetmeelgehalte. De hele-zaad-sized sectie kan worden gekleurd met fluorescerende brightener 28, jodium, en Coomassie briljante blauwe R250 om specifiek vertonen de morfologie van cellen, zetmeel korrels, en eiwit lichamen duidelijk, respectievelijk. Het verkregen beeld kan ook kwantitatief worden geanalyseerd om de morfologieparameters van cellen, zetmeelkorrels en eiwitlichamen in verschillende gebieden van het zaad te tonen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plantenzaden bevatten opslagmaterialen zoals zetmeel en eiwitten en zorgen voor energie en voeding voor mensen. De vorm, grootte en hoeveelheid cel- en opslagmaterialen bepalen het gewicht en de kwaliteit van het zaad. De cellen en opslagmaterialen in verschillende gebieden van het zaad hebben aanzienlijk verschillende morfologieën, vooral voor sommige hoog-amylose graangewassen met remming van zetmeel vertakking enzym IIb1,2,3. Daarom is het erg belangrijk om de morfologieën van cellen en opslagmaterialen in verschillende gebieden van zaad te onderzoeken.

Paraffinesectie is een goede methode om de hele zaai-en-kleiningssectie voor te bereiden en kan de weefselstructuur van zaad en de accumulatie van opslagmateriaal vertonen in verschillende gebieden van zaad4,5,6. De paraffinesecties hebben echter meestal een dikte van 6-8 μm met een lage resolutie; het is dus erg moeilijk om de morfologie van cel- en opslagmaterialen duidelijk te observeren en kwantitatief te analyseren. De harssecties hebben meestal een dikte van 1-2 μm en een hoge resolutie en zijn zeer geschikt om de morfologie van cel- en opslagmaterialen te observeren en te analyseren7. De routinematige harssectiemethode heeft echter moeite met de voorbereiding van de hele sectie ter grootte van zaden, met name voor zaden met een groot volume en een hoog zetmeelgehalte; er is dus geen manier om de morfologie van cellen en opslagmaterialen in verschillende gebieden van het zaad te observeren en te analyseren. LR Witte hars is een acrylhars en vertoont een lage viscositeit en sterke doorlaatbaarheid, wat leidt tot de goede toepassingen bij de voorbereiding van de hars sectie van zaden, vooral voor granen volwassen pitten met een groot volume en een hoog zetmeelgehalte. Bovendien kan het monster ingebed in LR Witte hars gemakkelijk worden gekleurd met veel chemische kleurstoffen om duidelijk de morfologie van cellen en opslagmaterialen onder licht of fluorescerende microscoop7tentoon te stellen. In ons vorige artikel hebben we melding gemaakt van een droge sectiemethode voor de voorbereiding van de hele zaad-sized secties van volwassen granen pitten ingebed in LR witte hars. De methode kan ook de hele zaad-sized sectie van de ontwikkeling, ontkiemde en gekookte graanpit8bereiden. De verkregen hele-zaad-sized sectie heeft vele toepassingen in micromorfologie observatie en analyse, met name voor het duidelijk bekijken en kwantitatief analyseren van de morfologie verschillen van cel-en opslagmaterialen in verschillende regio's van zaad8,9.

Deze techniek is geschikt voor onderzoekers die de microstructuur van weefsel en de vorm en grootte van cellen, zetmeelkorrels en eiwitlichamen in verschillende gebieden van zaad met behulp van lichtmicroscoop willen observeren. De beelden van hele zaad-sized secties gekleurd specifiek voor het tentoonstellen van cellen, zetmeel korrels, en eiwitlichamen kunnen worden geanalyseerd door morfologie analyse software om kwantitatief te meten van de morfologie parameters van cellen, zetmeel korrels, en eiwit lichamen in verschillende gebieden van zaad. Om de technische toepasbaarheid en de hele zaad-sized sectie toepassingen aan te tonen, hebben we onderzocht de volwassen zaden van maïs en koolzaad en de ontwikkeling, ontkiemd, en gekookte pitten van rijst in deze studie. Het protocol bevat vier processen. Hier gebruiken we volwassen maïspit, wat het moeilijkst is bij het voorbereiden van de secties ter grootte van het hele zaad vanwege het grote volume en het hoge zetmeelgehalte, als een monster om de processen stap voor stap tentoon te stellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van in hars ingebed zaad (figuur 1)

  1. Plaats zes maïsrijpe pitten in 10 mL van 2,5% fosfaatgebufferde glutaraldehyde (0,1 M, pH7.2) bij 4 °C voor 48 uur. De onderzoekers kunnen kiezen voor andere fixatieve mengsels, fixatieve concentraties, en fixatie voorwaarden op basis van hun onderzoeksdoelstellingen en weefseltypes.
  2. Haal de pitten eruit en snijd ze in de lengterichting of dwars door een dikte van 2-3 mm met een scherp dubbelzijdig blad en bevestig ze in 10 mL van 2,5% fosfaatgefferde glutaraldehyde (0,1 M, pH 7.2) opnieuw voor 48 uur.
  3. Was de monsters drie maal met 10 mL fosfaatbuffer van 0,1 M (pH 7.2) gedurende 30 minuten per keer.
  4. Dehydrateer de monsters in toenemende soorten ethanol waterige oplossing (10 mL) van 30% tot 50%, 70%, 90% eenmaal, en 100% drie keer voor 30 min elke keer.
  5. Infiltreren de monsters in 10 mL toenemende kwaliteiten van LR Witte hars oplossing verdund met ethanol van 25% tot 50%, 75% een keer, en 100% tweemaal bij 4 °C voor 12 uur elke keer.
  6. Bereid de sokkels voor op monsters voordat u insluit. Voeg 0,25 mL LR-witte hars toe aan een 2 mL centrifugebuis en polymeriseer deze bij 60 °C gedurende 48 uur.
  7. Voeg achtereenvolgens de zuivere LR Witte hars (0,5 mL) en het geïnfiltreerde monster toe aan de centrifugebuis met een voetstuk. Recht de monsters met de anatomische naald, en polymeriseren ze op 60 °C in een oven voor 48 uur.

2. Droge doorsnede voor de voorbereiding van de gehele gedeelte zaadformaat (figuur 1)

  1. Haal de ingebedde pitten uit de centrifugebuis en knip de overtollige hars rond het monster uit met een scherp mes.
  2. Klem het harsblok in de monsterhouder van ultramicrotome (EM UC7) en snijd de overbodige hars op het oppervlak van het monster en rond het monster met een mes af.
  3. Polijst het oppervlak van het monster fijn met een glazen mes tot een volledige sectie kan worden gevormd.
  4. Plaats een kleine koperen haak ongeveer 2 mm boven de bladrand voor het snijden en snijd het monster in een 2 μm sectie. De rol van de haak is om te voorkomen dat de curling omhoog van de sectie.
  5. Zet de haak onder de sectie om het te ondersteunen wanneer de sectie lang wordt.
  6. Voeg 100 μL water toe op een onbehandelde glijbaan en breng het volledige en ongebroken gedeelte voorzichtig met de pincet over naar het water.
  7. Om het gerimpelde gedeelte glad te strijken, verwarm en droog het monster op de afvlakkingstafel bij 50 °C 's nachts.
    1. Als de sectie afbrokkelt of scheurt, verlengt u de tijd voor elke harsinfiltratie van het monster van 12 uur tot 24 uur of 48 uur.
    2. Als de sectie een aantal lijnen parallel aan het mes heeft, klemt u het monsterblok stevig vast. Als de sectie heeft een aantal lijnen verticaal aan het mes, gebruik dan een nieuw mes.

3. Kleuring en observatie van de sectie

OPMERKING: Om de weefselstructuur en morfologie van cellen, zetmeelkorrels en eiwitlichamen te observeren, bevlekt u de secties met specifieke vlekken volgens het doel van het onderzoek. Hier gebruiken we de fluorescerende brightener 28, jodiumoplossing en Coomassie briljante blauwe R250 om respectievelijk de celwanden, zetmeelkorrels en eiwitlichamen te bevlekken.

  1. Voor het observeren van de morfologie van cellen, vlek de sectie met 40 mL van 0,1% (w / v) fluorescerende brightener 28 waterige oplossing in een 70 mL compacte glazen kleurpot op 45 °C gedurende 10 minuten, en spoel het vervolgens met stromend water gedurende 5 minuten. Observeer en fotografeer de sectie onder een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een CCD-camera.
  2. Voor het observeren van de morfologie van zetmeelkorrels bevlekt u de sectie met 40 μL jodiumoplossing (0,07% (w/v) I2 en 0,14% (w/v) KI in 25% (v/v) glycerol) gedurende 1 min, en bedek het monster met jodiumoplossing met een dekenslip. Bekijk en fotografeer het monster onder een lichtmicroscoop uitgerust met een CCD-camera.
  3. Voor het observeren van de morfologie van eiwitlichamen, dompel de sectie met 40 mL van 10% (v/v) azijnzuur in een 70 mL compacte glazen kleurpot gedurende 10 minuten bij 45 °C, en vervolgens vlek in 40 mL van 1% (w / v) Coomassie briljante blauwe R250 in 25% (v / v) isopropanol en 10% (v / v) azijnzuur voor 15 min bij 45 °C. Was de gekleurde delen met stromend water gedurende 5 minuten en droog het. Observeer en fotografeer de sectie onder een lichtmicroscoop uitgerust met een CCD-camera.

4. Kwantitatieve analyse van morfologieparameters

  1. Proces en kwantitatief analyseren van de gefotografeerde beelden voor gebied, lange / korte as, en rondheid van cellen, zetmeel korrels, en eiwit lichamen in verschillende gebieden van zaad met behulp van morfologie analyse software (Image-Pro Plus 6.0 software) volgens de procedures van Zhao et al.9 precies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eenvoudige droge doorsnedemethode voor het verkrijgen van een hele zaai-gedekte sectie
We stellen een eenvoudige droogsectiemethode vast voor de voorbereiding van een hele zaadvormige sectie zaad die is ingebed in LR-witte hars(figuur 1). De methode kan transversale en langs-zaadsecties voorbereiden met een dikte van 2 μm (figuur 2-5, aanvullende figuur 1-4). Bijvoorbeeld, het rijpe zaad van kool...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De zaden zijn de belangrijkste hernieuwbare hulpbron voor voedsel, veevoer en industriële grondstoffen, en zijn rijk aan opslagmaterialen zoals zetmeel en eiwit. De morfologie en kwantiteit van cellen en de inhoud en configuratie van opslagmaterialen beïnvloeden het gewicht en de kwaliteit van zaden7,12. Hoewel de stereologie- en beeldanalysetechnologie de grootte en hoeveelheid cellen in een weefselgebied kan meten, ontbreekt het in veel laboratoria. De paraffin...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De financiering werd verstrekt door de National Natural Science Foundation of China (32071927), het Talent Project van de Yangzhou University en de Priority Academic Program Development van Jiangsu Higher Education Institutions.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AzijnzuurSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A501931
Compacte glazen kleuringsschaal (5-plaats)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.E678013
Coomassie briljantblauw R-250Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A100472
DekglasSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.F518211
Dubbelzijdig mesGillette Shanghai Co., Ltd.74-S
Absoluut ethanolSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A500737
VlaklegtafelLeicaHI1220
FluorescentiemicroscoopOlympusBX60
Fluorescentie versterker 28Sigma-Aldrich910090
Glazen stripsLeica840031
Glutaraldehyde 50% oplossing in waterSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A600875
GlycerolSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A600232
JodiumSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A500538
IsopropanolSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A507048
LichtmicroscoopOlympusBX53
LR White harsAgar ScientificAGR1281A
OvenShanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.,Ltd.9023A
KaliumjodideSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A100512
GlijmiddelSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.F518101
PincetSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.F519022
Natriumfosfaat dibasisch dodecahydraatSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A607793
Natriumfosfaat monobasisch dihydraatSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A502805
UltramicrotoomLeicaEM UC7

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cai, C., et al. Heterogeneous structure and spatial distribution in endosperm of high-amylose rice starch granules with different morphologies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (41), 10143-10152 (2014).
  2. He, W., et al. The defective effect of starch branching enzyme IIb from weak to strong induces the formation of biphasic starch granules in amylose-extender maize endosperm. Plant Molecular Biology. 103 (3), 355-371 (2020).
  3. Wang, J., et al. Gradually decreasing starch branching enzyme expression is responsible for the formation of heterogeneous starch granules. Plant Physiol. 176 (1), 582-595 (2018).
  4. Chen, X., et al. Dek35 encodes a PPR protein that affects cis-splicing of mitochondrial nad4 intron 1 and seed development in maize. Molecular Plant. 10 (3), 427-441 (2017).
  5. Hu, Z. Y., et al. Seed structure characteristics to form ultrahigh oil content in rapeseed. PLoS One. 8 (4), 62099(2013).
  6. Huang, Y., et al. Maize VKS1 regulates mitosis and cytokinesis during early endosperm development. Plant Cell. 31 (6), 1238-1256 (2019).
  7. Xu, A., Wei, C. Comprehensive comparison and applications of different sections in investigating the microstructure and histochemistry of cereal kernels. Plant Methods. 16, 8(2020).
  8. Zhao, L., Pan, T., Cai, C., Wang, J., Wei, C. Application of whole sections of mature cereal seeds to visualize the morphology of endosperm cell and starch and the distribution of storage protein. Journal of Cereal Science. 71, 19-27 (2016).
  9. Zhao, L., Cai, C., Wei, C. An image processing method for investigating the morphology of cereal endosperm cells. Biotech & Histochemistry. 95 (4), 249-261 (2020).
  10. Borisjuk, L., et al. Seed architecture shapes embryo metabolism in oilseed rape. The Plant Cell. 25 (5), 1625-1640 (2013).
  11. Lott, J. N. A. Protein bodies in seeds. Nordic Journal of Botany. 1, 421-432 (1981).
  12. Jing, Y. P., et al. Development of endosperm cells and starch granules in common wheat. Cereal Research Communications. 42 (3), 514-524 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Doorsneden van hele zadeninbedding in LR White harsanalyse van zetmeelkorrelskleuring van prote nelichamenfluorescentiemiddel 28jodiumoplossingskleuringCoomassie Brilliant Blueanalyse van morfologische parametersstructuur van zaadweefsel

Gerelateerde artikelen