Methodenartikel

Tetramere fluorescerende antigeenarrays voor eenstapsidentificatie van antigeenspecifieke B-cellen

DOI:

10.3791/61827

⸱

20 oktober 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical Chemistry, University of Kansas, 2Bioengineering Graduate Program, University of Kansas, 3Department of Chemical and Petroleum Engineering, University of Kansas

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de aanpasbare productie en het gebruik van fluorescerende sondes voor het labelen van antigeenspecifieke B-cellen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De productie van fluorescerende antigeenen is een cruciale stap in de identificatie van antigeenspecifieke B-cellen. Hier hebben we de bereiding, zuivering en het gebruik van vierarmige, fluorescerende PEG-antigeenconjugaten beschreven om selectief antigeenspecifieke B-cellen te identificeren door middel van gretige betrokkenheid bij verwante B-celreceptoren. Met behulp van modulaire klikchemie en in de handel verkrijgbare fluorofoorkitchemie hebben we de veelzijdigheid aangetoond van het bereiden van op maat gemaakte fluorescerende PEG-conjugaten door verschillende arrays te creëren voor proteolipide-eiwit (PLP139-151) en insuline, die belangrijke auto-antigenen zijn in muizenmodellen van respectievelijk multiple sclerose en diabetes type 1. Er werden tests ontwikkeld voor elk fluorescerend conjugaat in zijn respectieve ziektemodel met behulp van flowcytometrie. Antigeenarrays werden vergeleken met monovalent auto-antigeen om het voordeel van multimerisatie op PEG-backbones te kwantificeren. Ten slotte hebben we het nut van dit platform geïllustreerd door anti-insuline B-celresponsen na antigeenstimulatie ex vivo te isoleren en te beoordelen. Het labelen van insulinespecifieke B-cellen maakte de versterkte detectie mogelijk van veranderingen in co-stimulatie (CD86) die anders werden gedempt in geaggregeerde B-celanalyse. Samen maakt dit rapport de productie en het gebruik van fluorescerende antigeenarrays mogelijk als een robuust hulpmiddel voor het onderzoeken van B-celpopulaties.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het adaptieve immuunsysteem speelt een cruciale rol in de progressie of regressie van vele ziektetoestanden, waaronder auto-immuniteit, kanker en infectieziekten1. Voor brede toepassingen, waaronder de studie van immunopathologie of de ontwikkeling van nieuwe precisiebehandelingen, is het vaak van cruciaal belang om antigeenspecifieke B- en T-celresponsen die ten grondslag liggen aan ziekteprogressiete beoordelen 2,3,4. Major histocompatibility complex (MHC) tetrameren zijn op grote schaal en commercieel beschikbaar voor het identificeren van antigeenspecifieke T-celklonen5. Deze fluorofoor-gelabelde constructies presenteren quadrivalente peptide-MHC-complexen om gretig aan te gaan met verwante T-celreceptoren voor labeltoepassingen zoals microscopie en flowcytometrie.

Antigenen voor B-celondervraging kunnen zeer gevarieerde molecuulgewichten, ladingen en oplosbaarheden vertonen 6,7. Bij gebruik van monomeer antigeen als oplosbare B-celsondes, kunnen de fysisch-chemische antigeeneigenschappen niet worden gestabiliseerd door complexvorming met het veel grotere, in water oplosbare streptavidinemolecuul, of kunnen ze oplosbaarheidsproblemen opleveren als monomere reagentia voorafgaand aan conjugatie. Sommige eiwitten vertonen dus bioconjugatieproblemen en onverwachte resultaten in de praktijk 7,8. Directe conjugatie van fluorescerende kleurstoffen kan constructies soms onoplosbaar en lipofiel maken. Deze directe kleurstof-antigeenverbindingen zijn vatbaar voor niet-specifieke inbedding in celmembranen, waardoor antigeenspecifieke analyses worden verstoord 7,8,9. Sommige strategieën hebben de oplosbaarheidsuitdagingen overwonnen door antigeen en fluoroforen te koppelen aan andere functionele groepen. Cambier et al., bijvoorbeeld, gebruikten gebiotinyleerde insuline in zijn oorspronkelijke vorm om zich bezig te houden met insulinespecifieke B-celreceptoren (BCR's) voordat ze stapsgewijs fluorofoor-gelabeld streptavidine toevoegden10. Hoewel deze aanpak de beoordeling mogelijk maakte van B-cellen die binden aan monomere insuline met hoge resolutie, waren er twee labelstappen nodig. Een generaliseerbaar protocol voor de bereiding van kant-en-klare B-celsondes op basis van polymeren die gemakkelijk kunnen worden geïntegreerd met gebruikelijke procedures voor het labelen van fluorescerende antilichamen, zou nuttig zijn voor het bevorderen van de studie van B-cellen bij ziekte.

In dit protocol beschrijven we de productie en het gebruik van fluorescerende antigeenarrays (FAA's) voor de generaliseerbare en eenstaps labeling van antigeenspecifieke B-cellen voor microscopie en flowcytometrie-experimenten (Figuur 1). Oplosbare antigeenarrays (SAgA's) zijn de afgelopen tien jaar gebruikt als B-celgerichte antigeenspecifieke immunotherapieën tegen auto-immuunziekten 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 . SAgA's maken gebruik van multivalente antigeenweergave op flexibele, polymere ruggengraat om gretig B-celreceptoren aan te spreken en immunomodulerende effecten op te wekken, hoewel hun antigeenspecificiteit een andere mogelijkheid biedt om interessante B-cellen te onderzoeken wanneer ze worden gekoppeld aan een fluorofoor23. De polymere ruggengraat waaruit SAgAs bestaat, verleent oplosbaarheid in water aan het totale biomacromolecuul en kan de soms extreme antigeenkenmerken dempen die de productie van sondes en de kleuringsspecificiteit verwarren 6,24. We hebben talloze antigenen, variërend in grootte en complexiteit, geënt op het SAgA-platform met behulp van modulaire klikchemie, wat bevorderlijk is voor het gebruik van kleine peptide-epitopen en volledige eiwitten14,18. Hier demonstreren we FAA's als robuuste antigeenspecifieke B-cellabelingsinstrumenten die parallel kunnen worden gebruikt met typische fluorescerende antilichaamlabeling. We hebben FAA's voorbereid en geëvalueerd die bestaan uit humane insuline voor het labelen van B-cellen in een transgeen muismodel van diabetes type 1 (VH125), evenals FAA's die proteolipide-eiwit 139-151 (PLP) bevatten, een peptide-epitoop voor experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE), het muismodel van multiple sclerose. Onze bedoeling bij het gebruik van deze ziektemodellen was om de veelzijdigheid van dit platform aan te tonen, zowel voor de modulaire substitutie van gebruikte antigenen, als voor de levensvatbaarheid van gebruik met peptide-epitopen (PLP) en volledige eiwitten (insuline). Dit protocol wordt gepresenteerd met het oog op toegankelijkheid, zonder dat uitgebreide expertise op het gebied van bioconjugatie vereist is. De reagentia, evenals synthese- en zuiveringsmethoden, zijn ontworpen om veelzijdig te zijn en gemakkelijk te kunnen worden geïmplementeerd in de meeste onderzoekslaboratoria die zich richten op scheikunde, moleculaire biologie of immunologie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierprocedures die in dit werk vertegenwoordigd zijn, zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Kansas.

1. Synthese van antigeen-array (4-6 dagen)

  1. Functionaliseer ongemodificeerd antigeen met een alkyne handvat (1 uur). Voeg 1 equivalente insuline (100 mg, 17,4 μmol) toe aan een glazen injectieflacon van 20 ml met een roerstaaf en los op in watervrij dimethylsulfoxide (DMSO) (2 ml) onder zachte verhitting tot 40-50 °C met behulp van een heteluchtpistool of waterbad.
    1. Voeg 1,1,3,3-tetramethylguanidine (40,2 mg, 348,8 μmol) en 1,35 equivalenten vers bereide 78,5 mM propargyl N-hydroxysuccinimide-ester (NHS-ester) stockoplossing toe in watervrije DMSO (0,3 ml, 5,3 mg, 23,6 μmol).
    2. Roer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en blus de reactie vervolgens af met 0,05% HCl (12 ml).
  2. Zuiver het afzonderlijk gemodificeerde insuline-alkyne door middel van omgekeerde fase vloeistofchromatografie (4 uur). Gebruik een preparatieve C18-kolom (19 mm x 250 mm, 300 A poriegrootte, 5 μm deeltjesgrootte) met een 30-40% B-gradiënt van 10 minuten (A, water met 0,05% trifluorazijnzuur (TFA); B, acetonitril met 0,05% TFA) en een debiet van 14 ml/min. Het gewenste product elueert onmiddellijk na ongewijzigde insuline.
    1. Verdamp acetonitril en TFA door stikstofgasstroom of roterende verdamping onder verminderde druk (650 Pascal) en roterend met 150 tpm. Vries de waterige oplossing in en vries droog op. Bewaar gefunctionaliseerde insuline bij -20 °C onder een droge atmosfeer.
      OPMERKING: De gefunctionaliseerde insuline is onder deze bewaaromstandigheden tot een jaar stabiel.
  3. Synthetiseer de antigeenarray door koper-gekatalyseerde, azide-alkyne cycloadditie (CuAAC) (2,5 uur)22. Voeg 6 equivalenten insuline-alkyne (38 mg, 6,3 μmol) toe aan een glazen injectieflacon van 10 ml met een roerstaaf en los op in DMSO (1,2 ml) onder zachte verhitting.
    1. Voeg 50 mM natriumfosfaatbuffer (1,8 ml) pH 7,4, 1 equivalent 20 kDa 4-armig PEG-azide (21 mg, 1,05 μmol), koper (II) sulfaat pentahydraat (3,15 mg, 12,6 μmol), Tris (3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (27,37 mg, 63 μmol) en natriumascorbaat (50,34 mg, 254 μmol) toe.
    2. Roer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur en voeg dan DMSO (3 ml) toe om eventuele neerslag op te lossen en zuur de oplossing aan met 0,05% HCl (4 ml).
  4. Zuiver de antigeenarray door middel van vloeistofchromatografie in omgekeerde fase (3 uur). Gebruik een preparatieve C18-kolom (19 mm x 250 mm, 300 A poriegrootte, 5 μm deeltjesgrootte) met een 10 min 20-60% B-gradiënt (A, water met 0,05% TFA; B, acetonitril met 0,05% TFA) en een debiet van 14 ml/min. Het gewenste product elueert onmiddellijk na insuline-alkyne.
    1. Verdamp acetonitril door stikstofgasstroom of roterende verdamping onder verminderde druk. Vries de waterige oplossing in en vries droog op. Bewaren bij -20 °C onder een droge atmosfeer.
      OPMERKING: De insuline-antigeenarray is zeer hygroscopisch. De gevriesdroogde vezels kunnen samensmelten tot een dichte pellet na herhaalde blootstelling aan de atmosfeer. FAA-eigenschappen kunnen verschillen afhankelijk van het toepassingsspecifieke antigeen dat wordt gebruikt. De insuline-antigeenarray is onder deze opslagomstandigheden enkele maanden stabiel.

2. Conjugatie van fluorofoor (1-2 dagen)

  1. Conjuga de fluorofoor aan de antigeenarray (2,5 uur). Voeg 1 equivalente tetravalente insuline (21,7 mg, 0,5 μmol) toe aan een glazen injectieflacon van 20 ml met roerstaaf en los op in DMSO (1,75 ml) onder zachte verhitting. Voeg vers bereide 100 mM carbonaatbuffer (8 ml) pH 9,0 en 5 equivalenten fluoresceïne-isothiocyanaat toe aan een vers bereide 10 mM stockoplossing in DMSO (0,25 ml, 0,97 mg, 2,5 μmol). Roer 2 uur in het donker op kamertemperatuur.
  2. Zuiveren van het product door dialyse (24 uur). Gebruik een dialyseslang met een moleculair gewicht van 3,5 kDa in een geroerde emmer van 5 liter met gedestilleerd water in het donker bij kamertemperatuur. Dialyseer gedurende 24 uur en vervang de dialyseoplossing elke 6-12 uur.
  3. Vries de gedialyseerde oplossing in en vries deze droog om de FAA te verkrijgen. Bewaren in het donker onder een droge atmosfeer bij -20 °C.
    OPMERKING: De FAA is onder deze opslagomstandigheden enkele maanden stabiel.

3. FAA-karakterisering (2-4 uur)

  1. Analyseer de producten van stap 1 en 2 door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese volgens Laemmli25 (2 uur). Bereid monsters voor met 5 μg gezuiverd monovalent antigeen, 20 kDa 4-armig PEG-azide, antigeenarray en FAA.
    1. Visualiseer fluorofoorlabeling in de FAA-monsters door fluorescentiebeeldvorming in een gel-imager.
    2. Voer Coomassie blauwe kleuring26 uit om het antigeen te visualiseren.
    3. Voer jodiumkleuring27 uit om de PEG-ruggengraat te visualiseren. Spoel de gel af in gedestilleerd water (3 x 2 min), incubeer in 5% bariumchloride-oplossing (20 ml) gedurende 10 min, spoel af in gedestilleerd water (3 x 2 min), incubeer in 0,1 N jodiumoplossing (20 ml) gedurende 1 min, spoel vervolgens af in gedestilleerd water (3 x 2 min) om achtergrondvlekken te verwijderen vóór visualisatie.
      OPMERKING: Om 0,1 N jodiumoplossing te maken, voegt u kaliumjodide (2,0 g, 12 mmol) en jodium (1,27 g, 5 mmol) toe aan 100 ml gedestilleerd water.
  2. Bereken de mate van kleurstoflabeling met behulp van UV-Vis-spectroscopie (1 uur). Los een kleine hoeveelheid FAA op bij 0,1 mg/ml en registreer de absorptie bij 280 nm en de piekabsorptiegolflengte voor de kleurstof. Verkrijg de molaire extinctiecoëfficiënten voor het antigeen en de kleurstof.
    OPMERKING: Sommige kleurstoffen zijn pH-gevoelig. Zorg ervoor dat u een goed gebufferde oplossing gebruikt, zoals een carbonaatbuffer van 100 mM met een pH van 8.3 bij het meten van de FAA-extinctie om ervoor te zorgen dat de gerapporteerde kleurstofextinctiecoëfficiënt nauwkeurig is.
    1. Voer de volgende berekeninguit 28 waarbij ADye, maxλ de FAA-absorptie is bij de piekabsorptiegolflengte voor de kleurstof, EDye, maxλ de molaire extinctiecoëfficiënt is bij de piekabsorptiegolflengte voor de kleurstof, en E-antigeen, 280 nm de molaire extinctiecoëfficiënt voor monovalent antigeen bij 280 nm is.:
      Correctiefactor (CF) =A-kleurstof, 280 nm /A-kleurstof, maxλ 0,25 * (A-kleurstof, maxλ / E-kleurstof, maxλ) * (E-antigeen, 280 nm / (A280 nm – (A-kleurstof, maxλ * CF))) = kleurstof/FAA
  3. Analyseer de FAA op vrije kleurstof of potentiële afbraakproducten door RP-HPLC (1 uur).
    1. Los een kleine hoeveelheid FAA op in 1,0 mg/ml en analyseer met een analytische C18-kolom (4,6 mm x 150 mm, 300 A poriegrootte, deeltjesgrootte van 2,5 μm) met een 5-95% B-gradiënt van 10 minuten (A, water met 0,05% trifluorazijnzuur: B, acetonitril met 0,05% trifluorazijnzuur) met een debiet van 1 ml/min. Stel de UV-Vis-detector in om de piekabsorptiegolflengte van de kleurstof te bewaken (437 nm voor FITC).
      OPMERKING: Voor pH-gevoelige kleurstoffen kan het voor HPLC-analyse in aangezuurde oplosmiddelen nodig zijn om de bewaakte golflengte te verschuiven van de piekabsorptiegolflengte van de kleurstof in neutrale, waterige omstandigheden. Bij 0,05% TFA is de pH ongeveer 3 en is de maximale absorptie voor FITC verschoven.

4. Ontwikkeling van de test door FAA-titratie (3-5 uur)

OPMERKING: FAA-gebruik voor flowcytometrie wordt gepresenteerd, maar dezelfde stappen kunnen worden aangepast voor gebruik in andere formaten, zoals immunohistochemie of fluorescerende microscopie. Bij het toepassen van FAA's voor een nieuw formaat, moet een nieuwe optimalisatietest worden voltooid. Gemengde of geïsoleerde celpopulaties kunnen worden verkregen door middel van verwerkingsmethoden voor bloed of lymfoïde organen23,29. Oogst door enzymatische vertering van weefsel wordt niet aanbevolen, omdat markers aan het oppervlak van cellen kunnen worden afgestoten.

  1. Schors de FAA-voorraad tot 1 mg/ml in FACS-buffer (1x PBS + 5% foetaal runderserum en 0,1% natriumazide). Tot 10% DMSO kan worden opgenomen om de oplossing te versnellen.
  2. Verkrijg cellen die positief zijn voor antigeenspecifieke B-cellen van belang en doseer deze in microcentrifugebuisjes. Er zijnin totaal ongeveer 1 x 10 7 cellen nodig.
    OPMERKING: Splenocyten werden geoogst van VH125- en EAE-muizen volgens door de IACUC goedgekeurde protocollen aan de Universiteit van Kansas voor de huidige demonstratie. Onderzoekers kunnen de hierin beschreven methoden gebruiken voor celmonsters die specifiek zijn voor hun eigen toepassing en FAA-voorbereiding.
    1. Doseer 5 x 105 cellen voor het labelen van replicaten voor titratie (ten minste 3 replicaten per titratie).
    2. Doseer 1 x 105 cellen voor controles met één vlek en een ongekleurde controle.
      OPMERKING: Antilichaamisotypes en fluorescentie minus één controle kunnen ook worden gebruikt om de test volledig te valideren.
  3. Was de cellen door 1 ml FACS-buffer aan elke buis toe te voegen. Centrifugeer op 200 x g gedurende 5 min.
  4. Zuig het bovenstaande op en resusorsiet de celpellets in 50 μl FACS-buffer.
  5. Voeg CD3- en CD19-fluorescerende antilichamen toe aan elk monster in de door de fabrikant aanbevolen concentraties, evenals getitreerde FAA-doses.
    OPMERKING: De werkingsconcentraties van fluorescerende antilichamen kunnen onafhankelijk van elkaar worden getitreerd om de integriteit van de partij te bevestigen. De juiste FAA-dosisbereiken variëren per toepassing, maar een goed uitgangspunt is 50, 25, 10, 5 en 1 μg per monster. 1 μL voorraad FAA-oplossing is gelijk aan 1 μg dosis.
  6. Meng elk monster goed en broed afgedekt van licht gedurende 30 minuten op ijs.
  7. Was de cellen na de incubatie door 1 ml FACS-buffer aan elke buis toe te voegen. Centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten op 200 x g .
  8. Zuig het bovenstaande op en herhaal de wasbeurt door 1 ml FACS-buffer aan elke tube toe te voegen. Centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten op 200 x g .
  9. Zuig het bovenstaande op en suspendeer de monsters in 200 μl verse FACS-buffer. Leg de monsters op ijs en ga naar de cytometer.
  10. Laat de monsters op de cytometer lopen en verzamel minstens 50.000 gebeurtenissen.

5. FAA-titratieanalyse en optimalisatie van de etiketteringsdosis (1-2 uur)

  1. Met behulp van flowcytometrie-analysesoftware, poort voor afzonderlijke cellen.
  2. Plaats op afzonderlijke cellen poortjes voor CD19+ (B-cellen) en CD3+ (T-cellen).
  3. Binnen CD19+ en CD3+ ouderpopulaties, gate voor FAA+ events in het relevante fluorochroomkanaal.
  4. Noteer het percentage FAA+-gebeurtenissen binnen de CD19+- en CD3+-ouderpopulaties.
  5. Bereken een specificiteitsratio door het aandeel FAA+-gebeurtenissen in de CD19+-populatie (specifiek) te delen door het aandeel FAA+-gebeurtenissen in de CD3+-populatie (niet-specifiek). De specificiteitsratio moet worden gemaximaliseerd voor succesvol gebruik door de FAA.
  6. Gebruik de etiketteringsdosis die overeenkomt met de hoogste specificiteitsratio voor toekomstige experimenten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De gezuiverde opbrengst van insuline-alkyne (Figuur 2, bovenste paneel), bepaald door het gewicht, varieerde doorgaans van 50-65%. Opbrengsten van minder dan 40% werden waarschijnlijk veroorzaakt door waterverontreiniging in de watervrije DMSO en/of hydrolyse van de propargyl NHS-ester. Voor antigeenmultimerisatie (Figuur 1B) varieerde de gezuiverde opbrengst van de insuline-antigeenarray (Figuur 2,...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben een protocol ontwikkeld (Figuur 1) om op maat gemaakte FAA's te construeren voor het identificeren van antigeenspecifieke B-cellen, waardoor het genereren van B-celsondes voor moeilijke antigeendoelen wordt vereenvoudigd. We hebben 4-armige PEG-polymeren met terminale azidegroepen geselecteerd als een gemakkelijk substraat voor het bouwen van FAA's, aangezien PEG wateroplosbaarheid verleent, terwijl de functionele azidehandgrepen eenvoudige klikcon...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CJB is mede-oprichter van Orion Bioscience, Inc., een bedrijf dat de SAgA-technologie in licentie geeft voor het onderzoeken van het therapeutische gebruik ervan. Dit rapport is gebaseerd op werk dat wordt ondersteund door het National Science Foundation Graduate Research Program onder subsidie nr. 1946099. Alle meningen, bevindingen en conclusies of aanbevelingen in dit materiaal zijn die van de auteurs en weerspiegelen niet noodzakelijkerwijs de standpunten van de National Science Foundation.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken Colette Worcester voor haar hulp bij het verzamelen van gegevens. Dit werk werd ondersteund door de PhRMA Foundation (JDG), het National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (KDA) en door NIH-subsidies R21AI143407, R21AI144408 en DP5OD023118.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1,1,3,3-tetramethylguanidineAlfa AesarAAA12314AC
12 M zoutzuurFisher ChemicalA508-4
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 ulBio-Rad4561043
20 kDa 4-arm PEG azideJenkem USAA7185-1
3.5 kDa MWCO dialyseslang (geregenereerde cellulose)Fisher Scientific25-152-10
Acetonitril, HPLC-kwaliteitFisher ChemicalA998-4
Alexa Fluor 647 anti-muis CD19 AntilichaamBioLegend115522
watervrij dimethylsulfoxideACROS OrganicsAC610420010
bariumchlorideACROS Organics203135000
Brilliant Blue G-250-kleurstofFisher BioReagentsBP100-50
Cell Prime r-insulineEMD Millipore4512-01Recombinant menselijk insuline voor insuline FAA-synthese
Koper (II) sulfaat pentahydraatACROS OrganicsAC197722500
dimethylsulfoxideFisher ChemicalS67496
fluoresceïne isothiocyanaatheel (FITC) isomeer 1Sigma-AldrichF7250-1G
Glacial azijnzuurFisher ChemicalA38-212
GlycerolACROS Organics15892-0010
GlycineFisher ChemicalG46-500
homopropargyl-PLPBiomatikNAAangepaste synthese (sequentie: homopropargyl-HSLGKWLGHPDKF; zuiverheid: 97,29%)
joodSigma-Aldrich207772-100G
Methanol, HPLC-kwaliteitFisher ChemicalA452-4
NHS-Rhodamine (5/6-carboxy-tetramethyl-rhodamine succinimide ester), gemengde isomeerThermo Scientific46406Een commercieel verkrijgbare analoog van de Rhodamine-B NHS-ester gebruikt in het papier
PE/Cyanine7 anti-muis CD3 AntilichaamBioLegend100220
kaliumiodineSigma-Aldrich30315
propargyl N-hydroxysuccinimide-esterSigma-Aldrich764221
natriumascorbinezuurSigma-AldrichA7631
natriumbicarbonaatSigma-AldrichS5761-1KG
natriumdodecylsulfaatFisher BioReagentsBP166-100
Natriumfosfaat monobasis monohydraatFisher ChemicalS468-500
trifluorazijnzuurSigma-Aldrich302031-10x1mL
Tris-baseFisher BioReagentsBP152-500
Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amineClickChemTools1010-1000
xBridge BEH C18 3.5 um, 4.6 x 150 mm kolomWaters186003034
xBridge BEH C18 5um OBD Prep Kolom, 19 x 250 mmWaters186004021

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Murphy, K., Weaver, C. Janeway's Immunobiology. , Garland Science. (2016).
  2. Sospedra, M., Martin, R. Immunology of Multiple Sclerosis. Seminars in Neurology, Thieme Medical Publishers. , 115-127 (2016).
  3. Knutson, K. L., Disis, M. Tumor antigen-specific T helper cells in cancer immunity and immunotherapy. Cancer Immunology, Immunotherapy. 54 (8), 721-728 (2005).
  4. Rivino, L., et al. Hepatitis B virus-specific T cells associate with viral control upon nucleos (t) ide-analogue therapy discontinuation. The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 668-681 (2018).
  5. Constantin, C. M., Bonney, E. E., Altman, J. D., Strickland, O. L. Major histocompatibility complex (MHC) tetramer technology: an evaluation. Biological Research For Nursing. 4 (2), 115-127 (2002).
  6. Griffin, J. D., Song, J. Y., Sestak, J. O., DeKosky, B. J., Berkland, C. J. Linking autoantigen properties to mechanisms of immunity. Advanced Drug Delivery Reviews. , (2020).
  7. Moody, M. A., Haynes, B. F. Antigen-specific B cell detection reagents: use and quality control. Cytometry A. 73 (11), 1086-1092 (2008).
  8. Boonyaratanakornkit, J., Taylor, J. J. Techniques to study antigen-specific B cell responses. Frontiers in Immunology. 10 (1694), (2019).
  9. Newman, J., Rice, J. S., Wang, C., Harris, S. L., Diamond, B. Identification of an antigen-specific B cell population. Journal of Immunological Methods. 272 (1), 177-187 (2003).
  10. Smith, M. J., et al. Silencing of high-affinity insulin-reactive B lymphocytes by anergy and impact of the NOD genetic background in mice. Diabetologia. 61 (12), 2621-2632 (2018).
  11. Griffin, J. D., et al. Acute B-cell inhibition by soluble antigen arrays is valency-dependent and predicts immunomodulation in splenocytes. Biomacromolecules. 20 (5), 2115-2122 (2019).
  12. Hartwell, B. L., et al. Antigen-specific binding of multivalent soluble antigen arrays induces receptor clustering and impedes B cell receptor mediated signaling. Biomacromolecules. 17 (3), 710-722 (2016).
  13. Hartwell, B. L., Pickens, C. J., Leon, M., Berkland, C. Multivalent soluble antigen arrays exhibit high avidity binding and modulation of B cell receptor-mediated signaling to drive efficacy against experimental autoimmune encephalomyelitis. Biomacromolecules. 18 (6), 1893-1907 (2017).
  14. Hartwell, B. L., et al. Soluble antigen arrays disarm antigen-specific B cells to promote lasting immune tolerance in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Autoimmunity. 93, 76-88 (2018).
  15. Hartwell, B. L., et al. Molecular dynamics of multivalent soluble antigen arrays support a two-signal co-delivery mechanism in the treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis. Molecular Pharmaceutics. 13 (2), 330-343 (2016).
  16. Kuehl, C., et al. Pulmonary administration of soluble antigen arrays is superior to antigen in treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (11), 3293-3302 (2017).
  17. Leon, M. A., et al. Soluble antigen arrays displaying mimotopes direct the response of diabetogenic T Cells. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1436-1448 (2019).
  18. Leon, M. A., et al. Soluble antigen arrays for selective desensitization of Insulin-Reactive B cells. Molecular Pharmaceutics. 16 (4), 1563-1572 (2019).
  19. Sestak, J. O., Fakhari, A., Badawi, A. H., Siahaan, T. J., Berkland, C. Structure, size, and solubility of antigen arrays determines efficacy in experimental autoimmune encephalomyelitis. The AAPS Journal. 16 (6), 1185-1193 (2014).
  20. Sestak, J. O., et al. Codelivery of antigen and an immune cell adhesion inhibitor is necessary for efficacy of soluble antigen arrays in experimental autoimmune encephalomyelitis. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 1, 14008(2014).
  21. Thati, S., et al. Routes of administration and dose optimization of soluble antigen arrays in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (2), 714-721 (2015).
  22. Johnson, S. N., et al. Multimeric insulin desensitizes insulin-specific B cells. ACS Applied Bio Materials. , (2020).
  23. Griffin, J. D., et al. Antigen-specific immune decoys intercept and exhaust autoimmunity to prevent disease. Biomaterials. 222, 119440(2019).
  24. Hartwell, B. L., et al. Multivalent nanomaterials: learning from vaccines and progressing to antigen-specific immunotherapies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (2), 346-361 (2015).
  25. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  26. Simpson, R. J. Staining proteins in gels with coomassie blue. CSH Protocols. 2007, 4719(2007).
  27. Moosmann, A., Müller, E., Böttinger, H. Purification of PEGylated proteins, with the example of PEGylated lysozyme and PEGylated scFv. Methods Molecular Biology. 1129, 527-538 (2014).
  28. Haugland, R. P. Coupling of monoclonal antibodies with fluorophores. Monoclonal Antibody Protocols. Davis, W. C. , Humana Press. Totowa, NJ. 205-221 (1995).
  29. Martin, T. J., Whalen, M. M. Exposures to the environmental toxicants pentachlorophenol (PCP) and dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT) modify secretion of interleukin 1-beta (IL-1β) from human immune cells. Archives of Toxicology. 91 (4), 1795-1808 (2017).
  30. Felton, J. L., Maseda, D., Bonami, R. H., Hulbert, C., Thomas, J. W. Anti-insulin B cells are poised for antigen presentation in type 1 diabetes. The Journal of Immunology. 201 (3), 861-873 (2018).
  31. Griffin, J. D., et al. Tocopherol emulsions as functional autoantigen delivery vehicles evoke therapeutic efficacy in experimental autoimmune encephalomyelitis. Molecular Pharmaceutics. 16 (2), 607-617 (2019).
  32. Yarkoni, Y., Getahun, A., Cambier, J. C. Molecular underpinning of B-cell anergy. Immunology Reviews. 237 (1), 249-263 (2010).
  33. Pickens, C. J., Johnson, S. N., Pressnall, M. M., Leon, M. A., Berkland, C. J. Practical considerations, challenges, and limitations of bioconjugation via azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 29 (3), 686-701 (2017).
  34. Song, J. Y., et al. Glatiramer acetate persists at the injection site and draining lymph nodes via electrostatically-induced aggregation. Journal of Controlled Release. 293, 36-47 (2019).
  35. van Dongen, M. A., et al. Avidity mechanism of dendrimer-folic acid conjugates. Molecular Pharmaceutics. 11 (5), 1696-1706 (2014).
  36. Hudson, P. J., Kortt, A. A. High avidity scFv multimers; diabodies and triabodies. Journal of Immunological Methods. 231 (1), 177-189 (1999).
  37. Baker, J. C., et al. Selective acylation of epsilon-amino groups. Google Patents. , (2003).
  38. Grimsley, G. R., Scholtz, J. M., Pace, C. N. A summary of the measured pK values of the ionizable groups in folded proteins. Protein Science. 18 (1), 247-251 (2009).
  39. Fesel, C., Coutinho, A. Serum IgM repertoire reactions to MBP/CFA immunization reflect the individual status of EAE susceptibility. Journal of Autoimmunity. 14 (4), 319-324 (2000).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

PEG antigeenconjugatenclickchemieflowcytometriedetectie van autoantigenenB celreceptorinteractiemultimerisatieplatformex vivo analysebeoordeling van costimulatie
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen